Name: quantitative metabolomics of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00
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我们感谢蒂托连科实验室的现任和前任成员进行讨论。我们感谢质谱学生物应用中心、结构和功能基因组学中心以及显微镜和细胞成像中心（均在康科迪亚大学）提供出色的服务。这项研究得到了加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）的资助（RGPIN 2014-04482和CRDPJ 515900-17）。K.M得到了康科迪亚大学阿曼德·阿坎巴尔特奖学金和康科迪亚大学艺术与科学系主任卓越奖的支持。

1. 制造和消毒一种生长酵母的媒介
<ol><li>用巴托普酮 （YP） 介质制作 180 mL 的完整酵母提取物。完整的 YP 介质包含 1% （w/v） 酵母提取物和 2% （w/v） 巴托普酮。</li>
	<li>将 180 mL 的 YP 介质均匀地分配到四个 250 mL 的埃伦迈尔烧瓶中。每个烧瓶都含有 45 mL 的 YP 介质。</li>
	<li>在 15 psi/121 °C 下自动包装 45 分钟，用 YP 介质对烧瓶进行消毒。</li>
</ol>2. 野生型酵母菌株
<ol><li>使用 BY...

要成功使用此处描述的协议，请遵循下面描述的预防措施。氯仿和甲醇从实验室塑料制品中提取各种物质。因此，请谨慎处理。避免使用塑料的步骤，涉及接触这两种有机溶剂中的任何一个。使用硅酸盐玻璃移液器进行这些步骤。使用前用氯仿和甲醇将这些移液器升起。仅使用抗有机溶剂的聚丙烯制成的微管尖和管。在 LC-MS/MS 的样品准备过程中，在将气泡插入井板之前，先消除玻璃瓶中的所有气...

水溶性代谢物是低分子量中间体和新陈代谢产物，有助于基本的细胞过程。这些进化保存的过程包括将营养转化为可用能量、大分子的合成、细胞生长和信号、细胞周期控制、基因表达的调节、应激反应、新陈代谢的转化后调节、线粒体功能的维持、车辆细胞贩运、自噬、细胞老化以及调节细胞死亡1、2、3。
水溶性代谢物的许多基本作用是通过研究在萌芽酵母S.Cerevisiae1，3，4，7，9，14，15，16，17，18，19，20，21，22发现。这种单细胞真核生物是一个有用的模型有机体，通过解剖机制，水溶性代谢物有助于细胞过程，因为它的适应先进的生化，遗传和分子生物分析23，24，25，26。虽然非靶向代谢的LC-MS/MS方法已用于研究水溶性代谢物在萌芽酵母3、18、22、27中的作用，但这种分析需要改进其多功能性、稳健性、灵敏度，以及区分这些代谢物的不同结构异构体和立体体形式的能力。
近年来，在将非靶向代谢物的LC-MS/MS方法应用于体内水溶性代谢物的分析方面取得了重大进展。然而，使用这种方法的许多挑战仍然是2，28，29，30，31，32，33，34，35，36。这些挑战包括以下挑战。首先，许多水溶性代谢物的细胞内浓度低于目前使用的方法的敏感阈值。二是代谢活性淬火效率过低，细胞内代谢物淬火相关细胞泄漏程度过高，不适合现行方法：因此，目前使用的方法低估了水溶性代谢物的细胞内浓度。第三，现有方法不能区分特定代谢物的结构异构体（即具有相同化学公式但原子连接性的分子）或立体体（即具有相同化学公式和原子连接性的分子，但具有空间中不同的原子排列）：这防止了某些代谢物的正确注释，目前使用的方法。第四，现有的母离子（MS1）和二次离子（MS2）质量光谱在线数据库不完整：这会影响使用当前方法产生的原始 LC-MS/MS 数据对特定代谢物的正确识别和量化。第五，现有方法不能使用单一类型的代谢物提取来回收所有或大多数类型的水溶性代谢物。第六，现有方法不能使用单一类型的LC柱来分离所有或大多数类型的水溶性代谢物。
在这里，我们优化了在 S.cerevisiae 细胞内淬火的条件，在提取之前保持这些细胞内的大部分水溶性代谢物，并从酵母细胞中提取大多数类型的水溶性代谢物。我们开发了一种多功能、坚固和敏感的方法，用于基于LC-MS/MS的识别和量化从 S.Cerevisiae 细胞中提取的370多种水溶性代谢物。这种非靶向代谢方法能够评估各种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖解中间体和三碳基循环中间体的细胞内浓度。开发的LC-MS/MS方法允许识别和量化具有不同结构、物理和化学特性的不同结构异构体和立体形式的水溶性代谢物。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Hardware equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge bottles</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>6254249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Centrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>JA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital thermometer</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HH509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Tube Holder Kit with Retainer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-215-388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5&#181;m polymer 150 x 2.1 mm)</td>
			<td>Sigma Milipore</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Bonus-RP, 80&#197;, 2.1 x 150 mm, 5 &#181;m</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>883725-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Laboratory materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;m)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Discoverer 3.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Yeast strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative metabolomics of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

代谢学是一种用于识别和量化细胞、组织、器官、生物流体或生物体内许多低分子量中间体和代谢产物的方法。代谢学传统上侧重于水溶性代谢物。水溶性代谢体是综合细胞网络的最终产物，它集成了各种基因组、表观基因组、转录学、蛋白质组学和环境因素。因此，代谢分析直接评估了在各种生物体中过多的生物过程中对所有这些因素的行动结果。其中一种生物是初露头角的酵母 糖核酸，一种具有完全测序基因组的单细胞真核生物。由于 S.Cerevisiae 是适应综合分子分析，它被用作解剖真核细胞内许多生物过程背后的机制的模型。一种多功能的分析方法，用于对水溶性代谢体进行可靠、敏感和准确的定量评估，将为剖析这些机制提供基本方法。在这里，我们提出了一个协议，为代谢活性的优化条件淬火和水溶性代谢物提取从 S.Cerevisiae 细胞。该协议还描述了使用液相色谱加上串联质谱法（LC-MS/MS）对提取的水溶性代谢物进行定量分析。此处描述的非目标代谢学的 LC-MS/MS 方法用途广泛且坚固。它能够识别和量化370多种具有不同结构、物理和化学特性的水溶性代谢物，包括这些代谢物的不同结构异构体和立体体形式。这些代谢物包括各种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖解中间体和三碳循环中间体。非靶向代谢的LC-MS/MS方法非常敏感，允许在低至0.05pmol/μL的浓度下识别和量化某些水溶性代谢物。该方法已成功用于评估在不同条件下培养的野生型和突变酵母细胞的水溶性代谢体。

为了改进酵母细胞内水溶性代谢物的定量评估，我们优化了细胞淬火的条件，以便检测代谢物。为此目的的细胞淬火涉及快速逮捕细胞内的所有酶反应31，33，37，38。这种细胞代谢活性的抑制是任何方法在体内量化水溶性代谢物的重要步骤，因为它防止低估其细胞内浓?...

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Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

我们提出了一个协议，用于识别和量化主要类别的水溶性代谢物在酵母 糖体中。所述方法通用、坚固且灵敏。它允许结构异构体和立体形式的水溶性代谢物彼此分离。

使用液体色谱加上串联质谱法的 糖核 酸菌的定量元细胞学

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

本协议比目前使用的酵母代谢学有许多优点，因为它具有高特异性、高灵敏度，而且它可以描述许多不同类别的代谢物，包括异位体、同位素、亲水分子和疏水分子。本协议中使用的淬火方法可停止所有酶反应，同时显著减少细胞代谢物的泄漏。此协议中构建的 MS1 库来自各种 MS2 运行。在每分钟30摄氏度和200转的隔夜培养后，确定每毫升培养物的酵母细胞数量，并在每瓶含有45毫升自体YP介质的两个Erlenmeyer烧瓶中每片加入5毫升经过消毒的20%的葡萄糖库存溶液。使用无菌转移移液器将五倍于第七酵母细胞添加到每个烧瓶中，并在每分钟 200 转的 30 摄氏度下至少再生长酵母细胞 24 小时。对于代谢物提取，培养后，通过离心收集酵母细胞，并迅速去除超高纳特。将管子放在干冰上，在细胞中加入2毫升零下20摄氏度的氯仿、1毫升零下20摄氏度的甲醇、1毫升冰冷纳米纯净水和200微升425至600微米酸洗玻璃珠。添加珠子后，将覆盖铝箔的管子放入带固定器的泡沫管支架套件中，并在摄氏4度以中等速度将样品涡流30分钟，以方便代谢物提取。接下来，在冰上孵育管15分钟，然后离心样品，使上部的起伏期与中间碎屑、蛋白质和下部有机相分离。使用微管将上水相的大约 400 微升转移到洗过并标记为 1.5 毫升的管子中，其中包含 800 微升零下 20 摄氏度的丙酮三聚醇。然后离心样品，将超高光子上部的800微升转移到标记的质谱小瓶中，进行零度存储，直到液相色谱串联质谱分析。要分离提取的代谢物，将样品小瓶超声波15分钟，然后在室温下进行三个10秒的漩涡。涡流后，将小瓶放入液相色谱仪的井板中，将柱子设置为 45 摄氏度，流量为每分钟 0.25 毫升，井板为零摄氏度。然后使用表设置液相色谱梯度进行分析。分离后，在配备加热电喷雾电离的质谱仪中，在电喷电离正和负模式下使用10微升样品量，以识别和量化水溶性代谢物。在分析结束时，打开适当的复合分析软件程序中的原始数据，并利用质量光谱碎片库匹配质量光谱来注释分析中确定的代谢物。也可以识别MS1和同位素模式的确切质量，以便使用在线数据库对代谢物进行注释。然后使用数据库和光谱库来搜索原始数据的 MS2 光谱。第二天，在淬火酵母细胞后，用15毫升ABC缓冲器彻底清洗细胞，并通过离心收集细胞。将颗粒重新浸入一毫升新鲜的 ABC 缓冲器中，并在细胞中加入 500 微升碘化物溶液。每个漩涡将样品三次，每次漩涡10秒，并在不受光线保护的冰上孵育细胞10分钟。在孵化结束时，通过离心收集细胞，每次洗涤用一毫升新鲜ABC缓冲器清洗细胞三次。最后一次洗涤后，将颗粒重新注入 300 微升新鲜 ABC 缓冲器中，并将产生的细胞悬浮物的 10 微升添加到显微镜滑动中。使用荧光显微镜捕捉细胞的微分干扰对比度和荧光显微镜图像，过滤器的激发波长为 593 纳米，发射波长为 636 纳米。然后使用适当的图像分析程序来计算亮场和荧光图像中的细胞总数，并确定单个细胞染色时的荧光强度。改性细胞淬火法对血浆膜和细胞壁的损伤明显低于零下40摄氏度的无缓冲80%甲醇淬火方法。事实上，几乎所有使用改良方法淬火的细胞都表现出红色荧光发射，这是酵母细胞的特征，其中血浆膜和细胞壁没有损坏。相比之下，几乎所有使用40摄氏度非缓冲80%甲醇进行淬火的细胞都表现出绿色荧光发射，这是酵母细胞的特征，血浆膜和细胞壁受到显著损伤。改性细胞淬火法也比零下40摄氏度的无缓冲80%甲醇淬火法导致酵母细胞中水溶性代谢物的泄漏显著降低。水溶性代谢物标准的保留时间移位值显著降低，与反向相列相比，zwitterion 相列的峰值形状要清晰得多。液相色谱串联质谱法的另一个优点是能够使用 zwitterion 相列有效地分离具有不同结构、物理和化学特性的不同水溶性代谢物。确保在黑暗中站立碘化物，并确保收集上相，同时不干扰中间阶段。如果由于 MS2 光谱库的缺乏而无法注释任何 MSP，则使用 NMR 来说明此结构。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

解决由蓝变性PAGE和蛋白质相关剖析亲和纯化的蛋白复合物

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

科研

生物化学

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

对于代谢物分析基于法 - 串联液相色谱 - 质谱法<em&gt;金黄色葡萄球菌</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

脂滴隔离定量质谱分析

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

用等压标记、广泛的液相色谱法、质谱法和软件辅助定量技术进行深层蛋白质组分析

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

通过亲和色谱与西布洛特或质谱结合的亲致色谱,识别磷酸磷酸磷酸磷酸醇或磷酸蛋白

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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使用液色谱结合串联质谱法对糖皮质酶细胞脂质的定量分析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

无目标液相色谱-质量光谱学-小麦粒基代谢代谢学分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

肽聚糖的液相色谱质谱和生物信息学半定量分析

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

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贝克酵母糖精中线粒体基因组表达产品的标记和可视化

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

使用液体色谱加上串联质谱法的 糖核 酸菌的定量元细胞学

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