Name: quantitative metabolomics of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00
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Nous sommes reconnaissants aux membres actuels et anciens du laboratoire Titorenko pour les discussions. Nous reconnaissons le Centre pour les applications biologiques de la spectrométrie de masse, le Centre de génomique structurale et fonctionnelle et le Centre de microscopie et d’imagerie cellulaire (tous de l’Université Concordia) pour leurs services exceptionnels. Cette étude a été financée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CNSR) du Canada (RGPIN 2014-04482 et CRDPJ 515900 - 17). K.M. a été soutenu par la bourse Armand C. Archambault de l’Université Concordia et le Prix d’excellence du doyen des arts et des sciences de l’Université Concordia.

1. Fabrication et stérilisation d’un milieu de culture de levure
<ol><li>Faire 180 mL d’un extrait de levure complet avec un milieu de bactopéptone (YP). Le milieu YP complet contient 1% (p / v) d’extrait de levure et 2% (w / v) de bactopéptone.</li>
	<li>Répartir 180 mL du milieu YP également dans quatre flacons d’Erlenmeyer de 250 mL. Chacune de ces fioles contient 45 mL du milieu YP.</li>
	<li>Stériliser les flacons avec un milieu YP par autoclavage à 15 psi/121 °C pendant 45 min.</li>
</ol><p class=...

Pour utiliser avec succès le protocole décrit ici, suivez les mesures préventives décrites ci-dessous. Le chloroforme et le méthanol extraient diverses substances de la matière plastique de laboratoire. Par conséquent, manipulez-les avec prudence. Évitez l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent un contact avec l’un de ces deux solvants organiques. Utilisez des pipettes en verre borosilicate pour ces étapes. Augmentez ces pipettes avec du chloroforme et du méthanol avant utilisation. Utili...

Les métabolites solubles dans l’eau sont des intermédiaires de faible poids moléculaire et des produits du métabolisme qui contribuent aux processus cellulaires essentiels. Ces processus conservés de manière évolutionnaire comprennent la conversion des nutriments en énergie utilisable, la synthèse de macromolécules, la croissance et la signalisation cellulaires, le contrôle du cycle cellulaire, la régulation de l’expression des gènes, la réponse au stress, la régulation post-traductionnelle du métabolisme, le maintien de la fonctionnalité mitochondriale, le trafic cellulaire vésiculaire, l’autophagie, le vieillissement cellulaire et la mort cellulaire régulée1,2,3.
Beaucoup de ces rôles essentiels des métabolites solubles dans l’eau ont été découverts par des études dans la levure bourgeonnante S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Cet eucaryote unicellulaire est un organisme modèle utile pour disséquer les mécanismes par lesquels les métabolites solubles dans l’eau contribuent aux processus cellulaires en raison de son aptitude aux analyses biochimiques, génétiques et biologiques moléculairesavancées23,24,25,26. Bien que les méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée aient été utilisées pour étudier les rôles des métabolites solubles dans l’eau dans les levures bourgeonnantes3,18,22,27, ce type d’analyse nécessite l’amélioration de sa polyvalence, de sa robustesse, de sa sensibilité et de sa capacité à distinguer les différents isomères structurels et les formes stéréoisomériques de ces métabolites.
Ces dernières années sont marquées par des progrès significatifs dans l’application des méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée au profilage des métabolites solubles dans l’eau in vivo. Cependant, de nombreux défis dans l’utilisation decetteméthodologierestent 2,28 , 29,30,31,32,33,34,35,36. Ces défis sont les suivants. Premièrement, les concentrations intracellulaires de nombreux métabolites solubles dans l’eau sont inférieures à un seuil de sensibilité pour les méthodes actuellement utilisées. Deuxièmement, l’efficacité de la trempe de l’activité métabolique est trop faible et l’étendue des fuites cellulaires associées à la trempe des métabolites intracellulaires est trop élevée pour les méthodes actuelles; par conséquent, les méthodes actuellement utilisées sous-estiment les concentrations intracellulaires de métabolites solubles dans l’eau. Troisièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas différencier les isomères structuraux (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique mais une connectivité atomique différente) ou les stéréoisomères (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique et la même connectivité atomique, mais avec un arrangement atomique différent dans l’espace) de métabolites spécifiques; cela empêche l’annotation correcte de certains métabolites par les méthodes actuellement utilisées. Quatrièmement, les bases de données en ligne sur le spectral de masse des ions parents (MS1) et des ions secondaires (MS2) sont incomplètes; cela affecte l’identification et la quantification correctes de métabolites spécifiques à l’aide des données brutes LC-MS/MS produites à l’aide des méthodes actuelles. Cinquièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type d’extraction de métabolites pour récupérer toutes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau. Sixièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type de colonne LC pour séparer les unes des autres toutes les classes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau.
Ici, nous avons optimisé les conditions pour la trempe de l’activité métabolique dans les cellules de S. cerevisiae, en maintenant la plupart des métabolites solubles dans l’eau dans ces cellules avant l’extraction et en extrayant la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau des cellules de levure. Nous avons développé une méthode polyvalente, robuste et sensible pour l’identification et la quantification basées sur LC-MS/MS de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau extraits de cellules de S. cerevisiae. Cette méthode de métabolomique non ciblée permet d’évaluer les concentrations intracellulaires de diverses molécules porteuses d’énergie, nucléotides, acides aminés, monosaccharides, intermédiaires de glycolyse et intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS développée permet l’identification et la quantification de différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Hardware equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge bottles</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>6254249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Centrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>JA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital thermometer</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HH509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Tube Holder Kit with Retainer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-215-388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5&#181;m polymer 150 x 2.1 mm)</td>
			<td>Sigma Milipore</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Bonus-RP, 80&#197;, 2.1 x 150 mm, 5 &#181;m</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>883725-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Laboratory materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;m)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Discoverer 3.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Yeast strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative metabolomics of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

La métabolomique est une méthodologie utilisée pour l’identification et la quantification de nombreux intermédiaires et produits de faible poids moléculaire du métabolisme dans une cellule, un tissu, un organe, un fluide biologique ou un organisme. La métabolomique se concentre traditionnellement sur les métabolites solubles dans l’eau. Le métabolome soluble dans l’eau est le produit final d’un réseau cellulaire complexe qui intègre divers facteurs génomiques, épigénomiques, transcriptomiques, protéomiques et environnementaux. Par conséquent, l’analyse métabolomique évalue directement le résultat de l’action pour tous ces facteurs dans une pléthore de processus biologiques au sein de divers organismes. L’un de ces organismes est la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, un eucaryote unicellulaire avec le génome entièrement séquencé. Parce que S. cerevisiae se prête à des analyses moléculaires complètes, il est utilisé comme modèle pour disséquer les mécanismes sous-jacents à de nombreux processus biologiques au sein de la cellule eucaryote. Une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise du métabolome soluble dans l’eau fournirait la méthodologie essentielle pour disséquer ces mécanismes. Nous présentons ici un protocole pour les conditions optimisées de trempe de l’activité métabolique et d’extraction des métabolites solubles dans l’eau des cellules de S. cerevisiae. Le protocole décrit également l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des métabolites solubles dans l’eau extraits. La méthode LC-MS/MS de métabolomique non ciblée décrite ici est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques, y compris différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de ces métabolites. Ces métabolites comprennent diverses molécules porteuses d’énergie, des nucléotides, des acides aminés, des monosaccharides, des intermédiaires de la glycolyse et des intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS de métabolomique non ciblée est sensible et permet l’identification et la quantification de certains métabolites solubles dans l’eau à des concentrations aussi faibles que 0,05 pmol/μL. La méthode a été utilisée avec succès pour évaluer les métabolomes solubles dans l’eau de cellules de levure de type sauvage et mutantes cultivées dans différentes conditions.

Pour améliorer une évaluation quantitative des métabolites solubles dans l’eau dans une cellule de levure, nous avons optimisé les conditions de trempe cellulaire pour la détection des métabolites. La trempe cellulaire à cette fin implique un arrêt rapide de toutes les réactions enzymatiques au seind’unecellule31,33,37,38. Un tel arrêt de l’activ...

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Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Nous présentons un protocole pour l’identification et la quantification des principales classes de métabolites solubles dans l’eau dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite est polyvalente, robuste et sensible. Il permet de séparer les isomères structurels et les formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau les uns des autres.

Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Ce protocole présente de nombreux avantages par rapport à la métabolomique de levure actuellement utilisée car il a une spécificité élevée, une sensibilité élevée et peut également profiler de nombreuses classes différentes de métabolites, y compris des molécules isomériques, isobares, hydrophiles et hydrophobes. La méthode de trempe utilisée dans ce protocole arrête toutes les réactions enzymatiques tout en réduisant considérablement les fuites de métabolites des cellules. La bibliothèque MS1 intégrée à ce protocole est issé des différentes exécutions MS2.Après une culture nocturne à 30 degrés Celsius et 200 tours par minute, déterminez le nombre de cellules de levure par millilitre de culture et ajoutez cinq millilitres de solution stock stérilisée de glucose à 20% à chacune des deux fioles d’Erlenmeyer contenant 45 millilitres de milieu YP autoclavé par flacon. Utilisez une pipette de transfert stérile pour ajouter cinq fois 10 à la septième cellule de levure à chaque fiole et faites pousser les cellules de levure pendant au moins 24 heures supplémentaires à 30 degrés Celsius à 200 tours par minute. Pour l’extraction des métabolites, après culture, prélever les cellules de levure par centrifugation et éliminer rapidement le surnageant.Placez le tube sur de la glace carbonique et ajoutez deux millilitres de chloroforme de moins 20 degrés Celsius, un millilitre de méthanol de moins 20 degrés Celsius, un millilitre d’eau nano pure glacée et 200 microlitres de perles de verre lavées à l’acide 425 à 600 microns aux cellules. Lorsque les billes ont été ajoutées, placez le tube recouvert de papier d’aluminium dans un kit de support de tube en mousse avec un dispositif de retenue et vortex l’échantillon pendant 30 minutes à vitesse moyenne à quatre degrés Celsius pour faciliter l’extraction des métabolites. Ensuite, incuber le tube pendant 15 minutes sur de la glace avant de centrifuger l’échantillon pour permettre la séparation de la phase aqueuse supérieure des débris et des protéines et des phases organiques inférieures.Utilisez une micropipette pour transférer environ 400 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un tube lavé et étiqueté de 1,5 millilitre contenant 800 microlitres d’acétonitrile de moins 20 degrés Celsius. Ensuite, centrifugez l’échantillon et transférez 800 microlitres de la partie supérieure du surnageant dans un flacon de spectrométrie de masse marqué pour un stockage de zéro degré jusqu’à l’analyse par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide. Pour séparer les métabolites extraits, ultrasonez le flacon d’échantillon pendant 15 minutes, suivi de trois vortex de 10 secondes à température ambiante.Après le vortex, placez le flacon dans la plaque de puits du chromatographe liquide et réglez la colonne à 45 degrés Celsius avec un débit de 0,25 millilitre par minute et la plaque de puits à zéro degré Celsius. Utilisez ensuite le tableau pour définir les gradients de chromatographie liquide pour l’analyse. Après la séparation, utiliser des volumes d’échantillon de 10 microlitres de l’injection dans les modes positif et négatif d’ionisation par électropulvérisation dans un spectromètre de masse équipé d’une ionisation par électropulvérisation chauffée pour identifier et quantifier les métabolites solubles dans l’eau.À la fin de l’analyse, ouvrez les données brutes dans un logiciel d’analyse de composés approprié et utilisez la bibliothèque de fragmentation spectrale de masse pour faire correspondre les spectres de masse afin d’annoter les métabolites identifiés dans l’analyse. Les masses exactes du MS1 et les profils isotopiques peuvent également être identifiés pour permettre l’annotation des métabolites à l’aide de bases de données en ligne. Utilisez ensuite la bibliothèque de bases de données et de spectres pour rechercher les spectres MS2 des données brutes.Le lendemain, après avoir trempé les cellules de levure, lavez soigneusement les cellules avec 15 millilitres de tampon ABC et collectez les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille dans un millilitre de tampon ABC frais et ajoutez 500 microlitres de la solution d’iodure de propidium aux cellules. Vortex l’échantillon trois fois pendant 10 secondes par vortex et incuber les cellules pendant 10 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière.À la fin de l’incubation, prélever les cellules par centrifugation et laver les cellules trois fois avec un millilitre de tampon ABC frais par lavage. Après le dernier lavage, ressuspendez la pastille dans 300 microlitres de tampon ABC frais et ajoutez 10 microlitres de la suspension cellulaire résultante à une lame de microscope. Utilisez un microscope à fluorescence pour capturer des images de contraste d’interférence différentielle et de microscopie à fluorescence des cellules avec les filtres réglés sur une longueur d’onde d’excitation de 593 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 636 nanomètres.Ensuite, utilisez un programme d’analyse d’image approprié pour compter le nombre total de cellules dans les images en champ clair et en fluorescence, et pour déterminer l’intensité de fluorescence de la coloration pour les cellules individuelles. La méthode de trempe cellulaire modifiée cause des dommages significativement plus faibles à la membrane plasmique et à la paroi cellulaire que la méthode de trempe au méthanol non tamponné à moins 40 degrés Celsius. En effet, presque toutes les cellules soumises à la trempe à l’aide de la méthode modifiée présentent une émission de fluorescence rouge, caractéristique des cellules de levure dans lesquelles la membrane plasmique et la paroi cellulaire ne sont pas endommagées.En revanche, presque toutes les cellules soumises à la trempe à l’aide de la méthode non tamponnée de 80% de méthanol à 40 degrés Celsius ont montré une émission de fluorescence verte, caractéristique des cellules de levure dans lesquelles la membrane plasmique et la paroi cellulaire sont considérablement endommagées. La méthode de trempe cellulaire modifiée provoque également une fuite significativement plus faible de métabolites solubles dans l’eau des cellules de levure que la méthode de trempe à 80% de méthanol non tamponnée à moins 40 degrés Celsius. Les valeurs de décalage temporel de rétention des étalons de métabolites solubles dans l’eau sont significativement plus faibles et les formes de pic sont nettement plus nettes pour la colonne de phase zwitterionique que pour la colonne de phase inverse.Un autre avantage de la méthode de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide est la possibilité d’utiliser la colonne de phase zwitterionique pour séparer efficacement différents métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques. Assurez-vous de faire l’iodure de propidium dans l’obscurité et assurez-vous également de recueillir la phase supérieure sans perturber la phase moyenne. Si un MSP ne peut pas être annoté en raison de l’absence de la bibliothèque spectrale MS2, utilisez une RMN pour illustrer cette structure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

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Recherche

Biochimie

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