Name: quantitative metabolomics of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00
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Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa, il Centro per la genomica strutturale e funzionale e il Centro per la microscopia e l'imaging cellulare (tutti presso la Concordia University) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482 e CRDPJ 515900 - 17). K.M. è stato sostenuto dalla Concordia University Armand C. Archambault Fellowship e dal Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

1. Fare e sterilizzare un mezzo per la coltivazione del lievito
<ol><li>Fare 180 ml di un estratto di lievito completo con bactopeptone (YP) mezzo. Il mezzo YP completo contiene l'1% (p/v) di estratto di lievito e il 2% (p/v) di bactopeptone.</li>
	<li>Distribuire 180 mL del mezzo YP in modo equo in quattro palloni Erlenmeyer da 250 mL. Ognuno di questi palloni contiene 45 ml del mezzo YP.</li>
	<li>Sterilizzare i palloni con YP medium mediante autoclave a 15 psi/121 °C per 45 min.</li>
</ol>2. C...

Per utilizzare con successo il protocollo qui descritto, seguire le misure preventive descritte di seguito. Il cloroformio e il metanolo estraggono varie sostanze dalla plastica da laboratorio. Pertanto, maneggiarli con cautela. Evitare l'uso di materie plastiche in fasi che comportano il contatto con uno di questi due solventi organici. Utilizzare pipette in vetro borosilicato per questi passaggi. Sollevare queste pipette con cloroformio e metanolo prima dell'uso. Utilizzare solo punte e tubi in micropipette in poliprop...

I metaboliti idrosolubili sono intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo che contribuiscono ai processi cellulari essenziali. Questi processi evolutivamente conservati includono la conversione dei nutrienti in energia utilizzabile, la sintesi di macromolecole, la crescita e la segnalazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la regolazione dell'espressione genica, la risposta allo stress, la regolazione post-traduzionale del metabolismo, il mantenimento della funzionalità mitocondriale, il traffico cellulare vescicolare, l'autofagia, l'invecchiamento cellulare e la morte cellulare regolata1,2,3.
Molti di questi ruoli essenziali dei metaboliti idrosolubili sono stati scoperti da studi nel lievito in erba S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Questo eucariota unicellulare è un organismo modello utile per i meccanismi di dissezione attraverso i quali i metaboliti idrosolubili contribuiscono ai processi cellulari grazie alla sua suscettibilità ad analisi biochimiche, genetiche e biologiche molecolari avanzate23,24,25,26. Sebbene i metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata siano stati utilizzati per studiare i ruoli dei metaboliti idrosolubili nel lievito in erba3,18,22,27,questo tipo di analisi richiede il miglioramento della sua versatilità, robustezza, sensibilità e capacità di distinguere tra diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti.
Gli ultimi anni sono caratterizzati da progressi significativi nell'applicazione dei metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata alla profilazione di metaboliti idrosolubili in vivo. Tuttavia, molte sfide nell'utilizzo di questa metodologia rimangono2,28, 29,30,31,32,33,34,35,36. Queste sfide includono quanto segue. In primo luogo, le concentrazioni intracellulari di molti metaboliti solubili in acqua sono al di sotto di una soglia di sensibilità per i metodi attualmente utilizzati. In secondo luogo, l'efficienza della tempra dell'attività metabolica è troppo bassa e l'entità della perdita cellulare associata alla tempra dei metaboliti intracellulari è troppo alta per i metodi attuali; quindi, i metodi attualmente utilizzati sottostivalutano le concentrazioni intracellulari dei metaboliti idrosolubili. In terzo luogo, i metodi esistenti non possono differenziare gli isomeri strutturali (cioè molecole con la stessa formula chimica ma diversa connettività atomica) o stereoisomeri (cioè molecole con la stessa formula chimica e connettività atomica, ma con la diversa disposizione atomica nello spazio) di metaboliti specifici; ciò impedisce la corretta annotazione di alcuni metaboliti con i metodi attualmente utilizzati. In quarto luogo, i database online spettrali di massa esistenti di ioni genitori (MS1) e ioni secondari (MS2) sono incompleti; ciò influisce sulla corretta identificazione e quantificazione di metaboliti specifici utilizzando i dati grezzi LC-MS/MS prodotti con l'aiuto dei metodi attuali. In quinto luogo, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di estrazione di metaboliti per recuperare tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua. Sesto, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di colonna LC per separare l'uno dall'altro tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua.
Qui, abbiamo ottimizzato le condizioni per la tempra dell'attività metabolica all'interno delle cellule di S. cerevisiae, mantenendo la maggior parte dei metaboliti idrosolubili all'interno di queste cellule prima dell'estrazione ed estraendo la maggior parte delle classi di metaboliti idrosolubili dalle cellule di lievito. Abbiamo sviluppato un metodo versatile, robusto e sensibile per l'identificazione e la quantificazione basata su LC-MS/MS di oltre 370 metaboliti idrosolubili estratti dalle cellule di S. cerevisiae. Questo metodo di metabolomica non mirata consente di valutare le concentrazioni intracellulari di varie molecole vettore energetico, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS sviluppato consente l'identificazione e la quantificazione di diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Hardware equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge bottles</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>6254249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Centrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>JA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital thermometer</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HH509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Tube Holder Kit with Retainer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-215-388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5&#181;m polymer 150 x 2.1 mm)</td>
			<td>Sigma Milipore</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Bonus-RP, 80&#197;, 2.1 x 150 mm, 5 &#181;m</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>883725-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Laboratory materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;m)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Discoverer 3.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Yeast strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative metabolomics of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

La metabolomica è una metodologia utilizzata per l'identificazione e la quantificazione di molti intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo all'interno di una cellula, tessuto, organo, fluido biologico o organismo. La metabolomica si concentra tradizionalmente sui metaboliti solubili in acqua. Il metaboloma solubile in acqua è il prodotto finale di una complessa rete cellulare che integra vari fattori genomici, epigenomici, trascrittomici, proteomici e ambientali. Quindi, l'analisi metabolomica valuta direttamente l'esito dell'azione per tutti questi fattori in una pletora di processi biologici all'interno di vari organismi. Uno di questi organismi è il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae, un eucariota unicellulare con il genoma completamente sequenziato. Poiché S. cerevisiae è suscettibile di analisi molecolari complete, viene utilizzato come modello per sezionare i meccanismi alla base di molti processi biologici all'interno della cellula eucariotica. Un metodo analitico versatile per la valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata del metaboloma solubile in acqua fornirebbe la metodologia essenziale per sezionare questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per le condizioni ottimizzate di tempra dell'attività metabolica e l'estrazione di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di S. cerevisiae. Il protocollo descrive anche l'uso della cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei metaboliti idrosolubili estratti. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata qui descritto è versatile e robusto. Consente l'identificazione e la quantificazione di oltre 370 metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche, tra cui diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti. Questi metaboliti includono varie molecole vettore di energia, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcuni metaboliti idrosolubili a concentrazioni fino a 0,05 pmol/μL. Il metodo è stato utilizzato con successo per valutare i metabolomi idrosolubili di cellule di lievito selvatiche e mutanti coltivate in condizioni diverse.

Per migliorare una valutazione quantitativa dei metaboliti solubili in acqua all'interno di una cellula di lievito, abbiamo ottimizzato le condizioni di tempra cellulare per il rilevamento dei metaboliti. La tempra cellulare per questo scopo comporta un rapido arresto di tutte le reazioni enzimatiche all'interno di una cellula31,33,37,38. Tale arresto dell'attiv...

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Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Presentiamo un protocollo per l'identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l'uno dall'altro.

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Questo protocollo ha molti vantaggi rispetto alla metabolomica del lievito attualmente utilizzata perché ha un'elevata specificità, un'alta sensibilità e può anche profilare molte diverse classi di metaboliti, tra cui molecole isomeriche, isobariche, idrofile e idrofobiche. Il metodo di tempra utilizzato in questo protocollo blocca tutte le reazioni enzimatiche mentre riduce significativamente la perdita di metaboliti dalle cellule. La libreria MS1 integrata in questo protocollo proviene dalle varie esecuzioni MS2.Dopo la coltura notturna a 30 gradi Celsius e 200 giri al minuto, determinare il numero di cellule di lievito per millilitro di coltura e aggiungere cinque millilitri di soluzione madre sterilizzata al 20% di glucosio a ciascuno dei due palloni Erlenmeyer contenenti 45 millilitri di YP medio autoclavato per pallone. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per aggiungere cinque volte 10 alle settimi cellule di lievito a ciascun pallone e far crescere le cellule di lievito per almeno altre 24 ore a 30 gradi Celsius a 200 giri al minuto. Per l'estrazione del metabolita, dopo la coltura, raccogliere le cellule di lievito mediante centrifugazione e rimuovere rapidamente il surnatante.Posizionare il tubo su ghiaccio secco e aggiungere due millilitri di meno 20 gradi Celsius cloroformio, un millilitro di meno 20 gradi Celsius metanolo, un millilitro di acqua nano pura ghiacciata e 200 microlitri di 425-600 micron di perle di vetro lavate con acido da 425 a 600 micron alle cellule. Quando le perle sono state aggiunte, posizionare il tubo coperto con un foglio di alluminio in un kit di supporto per tubi di schiuma con un fermo e vorticizzare il campione per 30 minuti a velocità media a quattro gradi Celsius per facilitare l'estrazione del metabolita. Quindi, incubare il tubo per 15 minuti su ghiaccio prima di centrifugare il campione per consentire la separazione della fase acquosa superiore dai detriti medi e dalle proteine e dalle fasi organiche inferiori.Utilizzare una micropipetta per trasferire circa 400 microlitri della fase acquosa superiore in un tubo lavato ed etichettato da 1,5 millilitri contenente 800 microlitri di meno 20 gradi Celsius acetonitrile. Quindi centrifugare il campione e trasferire 800 microlitri della porzione superiore del surnatante in una fiala di spettrometria di massa etichettata per la conservazione a zero gradi fino all'analisi di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida. Per separare i metaboliti estratti, ultrasonicare il flaconcino campione per 15 minuti, seguito da tre vortici di 10 secondi a temperatura ambiente.Dopo aver vorticoso, posizionare la fiala nella piastra del pozzo del cromatografo liquido e impostare la colonna a 45 gradi Celsius con una portata di 0,25 millilitri al minuto e la piastra del pozzo a zero gradi Celsius. Quindi utilizzare la tabella per impostare i gradienti di cromatografia liquida per l'analisi. Dopo la separazione, utilizzare 10 volumi di campione di microlitro dell'iniezione in entrambe le modalità positiva e negativa della ionizzazione elettrospray in uno spettrometro di massa dotato di ionizzazione elettrospray riscaldata per identificare e quantificare i metaboliti solubili in acqua.Alla fine dell'analisi, aprire i dati grezzi in un programma software di analisi dei composti appropriato e utilizzare la libreria di frammentazione spettrale di massa per abbinare gli spettri di massa per annotare i metaboliti identificati nell'analisi. Le masse esatte dei modelli MS1 e isotopici possono anche essere identificate per consentire l'annotazione dei metaboliti utilizzando database online. Quindi utilizzare la libreria di database e spettri per cercare gli spettri MS2 dei dati grezzi.Il giorno dopo, dopo aver spento le cellule di lievito, lavare accuratamente le cellule con 15 millilitri di tampone ABC e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Rispeniare il pellet in un millilitro di tampone ABC fresco e aggiungere 500 microlitri della soluzione di ioduro di propidio alle cellule. Vortice del campione tre volte per 10 secondi per vortice e incubare le cellule per 10 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce.Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e lavare le cellule tre volte con un millilitro di tampone ABC fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, risuscidere il pellet in 300 microlitri di tampone ABC fresco e aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare risultante a un vetrino per microscopio. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per acquisire immagini al contrasto di interferenza differenziale e microscopia a fluorescenza delle cellule con i filtri impostati su una lunghezza d'onda di eccitazione di 593 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 636 nanometri.Quindi utilizzare un programma di analisi delle immagini appropriato per contare il numero totale di cellule nelle immagini del campo luminoso e della fluorescenza e per determinare l'intensità di fluorescenza della colorazione per le singole cellule. Il metodo di tempra cellulare modificato provoca danni significativamente inferiori alla membrana plasmatica e alla parete cellulare rispetto al metodo di tempra dell'80% non tamponato a meno 40 gradi Celsius. In effetti, quasi tutte le cellule sottoposte a tempra con il metodo modificato presentano un'emissione di fluorescenza rossa, che è caratteristica delle cellule di lievito in cui la membrana plasmatica e la parete cellulare non sono danneggiate.Al contrario, quasi tutte le cellule sottoposte a tempra utilizzando il metodo non tamponato dell'80% di metanolo a 40 gradi Celsius hanno mostrato un'emissione di fluorescenza verde, che è caratteristica delle cellule di lievito in cui la membrana plasmatica e la parete cellulare sono significativamente danneggiate. Il metodo di tempra cellulare modificato causa anche perdite significativamente inferiori di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di lievito rispetto al metodo di tempra dell'80% non tamponato a meno 40 gradi Celsius. I valori di spostamento del tempo di ritenzione degli standard dei metaboliti solubili in acqua sono significativamente più bassi e le forme del picco sono sostanzialmente più nitide per la colonna di fase zwitterionica rispetto alla colonna di fase inversa.Un altro vantaggio del metodo di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida è la capacità di utilizzare la colonna di fase zwitterionica per separare in modo efficiente diversi metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche. Assicurati di fare lo ioduro di propidio in piedi al buio e assicurati anche di raccogliere la fase superiore senza disturbare la fase centrale. Se un MSP non può essere annotato a causa della mancanza della libreria spettrale MS2, utilizzare una NMR per illustrare questa struttura.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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