Name: quantitative metabolomics of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00
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ティトレンコ研究所の現在および元メンバーの話し合いに感謝しています。我々は、質量分析の生物学的応用センター、構造機能ゲノム研究センター、および顕微鏡・細胞イメージングセンター(すべてコンコルディア大学)が優れたサービスを提供することを認める。この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(NSERC)(RGPIN 2014-04482およびCRDPJ 515900 - 17)からの助成金によって支えられた。K.Mは、コンコルディア大学アーマンドC.アルシャンボーフェローシップとコンコルディア大学芸術科学学部優秀賞の支援を受けました。

1. 酵母を育てる培地を製造し、殺菌する
<ol><li>完全な酵母エキスの180 mLをバクトペプトン(YP)培地で作ります。完全なYP培地は、1%(w / v)酵母エキスと2%(w / v)バクトペプトンが含まれています。</li>
	<li>180 mLのYP培地を4つの250 mLのエルレンマイヤーフラスコに均等に分配します。これらのフラスコのそれぞれは、YP培地の45 mLを含む。</li>
	<li>15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、YP...

ここで説明するプロトコルを正常に使用するには、以下に説明する予防措置に従ってください。クロロホルムとメタノールは、実験室のプラスチック製品から様々な物質を抽出します。したがって、慎重にそれらを処理します。これら2つの有機溶剤と接触するステップでのプラスチックの使用を避けてください。これらのステップには、ホウケイ酸ガラスピペットを使用してください。使用...

水溶性代謝産物は、低分子の中間体であり、必須の細胞プロセスに寄与する代謝産物です。これらの進化的に保存されたプロセスには、栄養素の使用可能エネルギーへの変換、高分子の合成、細胞増殖およびシグナル伝達、細胞周期制御、遺伝子発現調節、ストレス応答、代謝の翻訳後調節、ミトコンドリア機能の維持、静脈細胞密売、オートファジー、細胞老化、および調節細胞死1、2、3が含まれる。
水溶性代謝産物のこれらの本質的な役割の多くは、出芽酵母S.cerevisiae1、3、4、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22の研究によって発見されています。この単細胞真核生物は、高度な生化学的、遺伝的、および分子生物学的解析23、24、25、26へのアメナビリティによる細胞プロセスに水溶性代謝物が寄与する解剖機構を解剖するための有用なモデル生物である。非標的メタボロミクスのLC-MS法は、出芽酵母3、18、22、27における水溶性代謝産物の役割を研究するために使用されてきたが、この種の分析では、その汎用性、堅牢性、感度、およびこれらの代謝産物の異なる構造異性体と立体異性体形態を区別する能力の向上が必要である。
近年、非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法を生体内の水溶性代謝産物のプロファイリングに適用する際の大きな進歩が顕著である。しかし、この方法論を使用する上での多くの課題は、2、28、29、30、31、32、33、34、35、36のままです。これらの課題には、次のようなものがあります。まず、多くの水溶性代謝産物の細胞内濃度が、現在使用されている方法に対する感受性の閾値を下回る。第二に、代謝活性の改善の効率が低すぎると、細胞内代謝産物の焼入れ関連細胞漏出の程度は、現在の方法では高すぎる。したがって、現在使用されている水溶性代謝産物の細胞内濃度を過小評価する方法。第三に、既存の方法では、特定の代謝物の構造異性体(すなわち、同じ化学式を持つ分子が原子結合性が異なる分子)や立体異性体(すなわち、同じ化学式と原子結合性を有する分子)を区別することはできません。これにより、現在使用されているメソッドによる特定の代謝物の正しい注釈がなくなります。第4に、親イオン(MS1)と二次イオン(MS2)の既存の質量スペクトルオンラインデータベースは不完全です。これは、現在のメソッドの助けを借りて生成された未加工の LC-MS/MS データを使用して、特定の代謝産物の正しい識別と定量に影響します。第五に、既存の方法は、水溶性代謝産物のすべてのまたはほとんどのクラスを回復するために単一のタイプの代謝産物抽出を使用することはできません。第六に、既存の方法は、水溶性代謝産物の全てのクラスまたはほとんどのクラスを互いに分離するために、単一のタイプのLCカラムを使用することはできません。
ここでは 、S.セレビシエ 細胞内の代謝活性を改善し、抽出前にこれらの細胞内の水溶性代謝産物の大部分を維持し、酵母細胞からほとんどのクラスの水溶性代謝産物を抽出するための条件を最適化した。我々は 、S.セレビシエ 細胞から抽出された370以上の水溶性代謝産物のLC-MS/MSベースの同定と定量のための汎用性、堅牢で高感度な方法を開発しました。非標的化メタボロミクスのこの方法は、種々のエネルギーキャリア分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体の細胞内濃度を評価することを可能にする。開発されたLC-MS/MS法により、多様な構造、物理的、化学的特性を有する水溶性代謝産物の異なる構造異性体および立体異性体の同定と定量化が可能です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R37108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Hardware equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge bottles</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>6254249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Centrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>JA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital thermometer</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HH509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Tube Holder Kit with Retainer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-215-388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5&#181;m polymer 150 x 2.1 mm)</td>
			<td>Sigma Milipore</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Bonus-RP, 80&#197;, 2.1 x 150 mm, 5 &#181;m</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>883725-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Laboratory materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;m)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Discoverer 3.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Yeast strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative metabolomics of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

メタボロミクスは、細胞、組織、臓器、生体、または生物内の多くの低分子中間体および代謝産物の同定と定量に使用される方法論である。メタボロミクスは伝統的に水溶性代謝産物に焦点を当てています。水溶性のメタボロメは、様々なゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオミクス、および環境因子を統合する複雑な細胞ネットワークの最終生成物です。したがって、メタボロミック分析は、様々な生物内の生物学的プロセスの多くのこれらの要因の作用の結果を直接評価する。これらの生物の一つは、出芽酵母 サッカロミセスセレビシエ、完全に配列されたゲノムを持つ単細胞真核生物です。 S.cerevisiae は包括的な分子解析に適しているため、真核細胞内の多くの生物学的プロセスの根底にあるメカニズムを解剖するモデルとして使用されています。水溶性のメタボロムの堅牢で、敏感で、正確な定量的評価のための多目的な分析方法は、これらのメカニズムを解剖するための不可欠な方法論を提供するであろう。ここでは 、S.セレビシエ 細胞からの代謝活性の活性化および水溶性代謝産物抽出の最適化条件に関するプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、抽出された水溶性代謝産物の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と結合された液体クロマトグラフィーの使用を記述する。ここで説明する非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法は、汎用性と堅牢性があります。それはこれらの代謝物の異なった構造異性体および立体異性体形態を含む多様な構造、物理的、および化学的特性を有する370以上の水溶性代謝産物の識別そして定量化を可能にする。これらの代謝産物は、種々のエネルギー担体分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体を含む。LC-MS/MS法は、非標的メタボロミクスの感度が高く、0.05 pmol/μLの低濃度で水溶性代謝物の同定と定量を可能にします。この方法は、異なる条件下で培養した野生型および変異酵母細胞の水溶性メタボロメの評価に成功して使用されている。

酵母細胞内の水溶性代謝産物の定量的評価を改善するために、代謝産物検出のための細胞焼入れ条件を最適化した。この目的のための細胞の焼入れは、細胞31、33、37、38内のすべての酵素反応の迅速な逮捕を伴う。このような細胞代謝活性の停止は、生体内の水溶?...

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Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

我々は、酵母 サッカロミセスセレビシエにおける水溶性代謝産物の主要クラスの同定と定量のためのプロトコルを提示する。記載された方法は、汎用性、堅牢性、および高感度です。これは、構造異性体と水溶性代謝物の立体異性体の分離を可能にします。

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

このプロトコルは、高い特異性、高感度を有し、また異性体、同種、親水性、疎水性分子を含む代謝産物の多くの異なるクラスをプロファイルすることができるので、現在使用されている酵母メタボロミクスよりも多くの利点を有する。このプロトコルで使用されるクエンチ法は、細胞からの代謝産物の漏出を著しく減少させながら、すべての酵素反応を停止します。このプロトコルで構築された MS1 ライブラリは、さまざまな MS2 実行から実行されます。摂氏30度および1分間に200回転で一晩培養した後、1ミリリットルの培養で酵母細胞の数を決定し、フラスコ当たり45ミリリットルのオートクレーブYP培地を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに5ミリリットルの殺菌された20%ストック溶液のグルコースを加える。滅菌転移ピペットを使用して、各フラスコに7番目の酵母細胞に10倍を加え、1分間に200回転で摂氏30度で少なくとも24時間酵母細胞を成長させます。代謝産物抽出の場合、培養後、遠心分離により酵母細胞を採取し、上清を素早く除去する。チューブをドライアイスに置き、マイナス20度のクロロホルム2ミリリットル、マイナス20度メタノールの1ミリリットル、氷冷ナノ純水1ミリリットル、425〜600ミクロンの酸洗浄ガラスビーズ200マイクロリットルを細胞に加えます。ビーズを添加したら、アルミ箔で覆われたチューブをリテーナー付きのフォームチューブホルダーキットに入れ、サンプルを4°Cで中速で30分間渦を出して代謝物の抽出を容易にします。次に、サンプルを遠心分離する前にチューブを氷上で15分間インキュベートし、上部水相を中デブリおよびタンパク質および低有機相から分離できるようにします。マイクロピペットを使用して、上水相の約400マイクロリットルを洗浄し、マイナス20°Cのアセトニトリルの800マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブにラベル付けします。次いで、サンプルを遠心分離し、上清の上部の800マイクロリットルを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析までゼロ度保存用の標識質量分析バイアルに移します。抽出した代謝物を分離するには、サンプルバイアルを15分間超音波処理し、続いて室温で3つの10秒渦を超音波処理します。ボルテックスの後、バイアルを液体クロマトグラファーのウェルプレートに入れ、1分あたり0.25ミリリットルの流量でカラムを摂氏45度に、ウェルプレートを摂氏ゼロ度に設定します。次に、この表を使用して、分析用の液体クロマトグラフィー勾配を設定します。分離後、水溶性代謝物を同定し定量するために、加熱されたエレクトロスプレーイオン化を備えた質量分析計で、エレクトロスプレーイオン化正および負の両方のモードで10マイクロリットルのサンプルの注入を使用します。解析の最後に、適切な化合物分析ソフトウェアプログラムで生データを開き、質量スペクトルを一致させるために質量スペクトルを利用して、分析で特定された代謝産物にアポイントを付けます。MS1 と同位体パターンの正確な質量を識別して、オンライン データベースを使用して代謝物の注釈を可能にすることもできます。次に、データベースとスペクトルのライブラリを使用して、生データの MS2 スペクトルを検索します。翌日、酵母細胞を焼入れた後、15ミリリットルのABCバッファーで細胞を十分に洗浄し、遠心分離によって細胞を採取する。新鮮なABCバッファーの1ミリリットルにペレットを再懸濁し、500マイクロリットルのヨウ化プロピジウム溶液を細胞に加える。1渦あたり10秒間、サンプルを3回渦を起こして、光から保護された氷の上で細胞を10分間インキュベートする。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を採取し、1回の洗浄につき1ミリリットルの新鮮なABCバッファーで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、新鮮なABCバッファーの300マイクロリットルにペレットを再懸濁し、得られた細胞懸濁液の10マイクロリットルを顕微鏡スライドに加えます。蛍光顕微鏡を使用して、593ナノメートルの励起波長と636ナノメートルの発光波長に設定されたフィルターを使用して、細胞の差動干渉コントラストと蛍光顕微鏡画像をキャプチャします。次に、適切な画像解析プログラムを使用して、明視野画像および蛍光画像における細胞の総細胞数をカウントし、個々の細胞の染色の蛍光強度を決定します。改変細胞焼入法は、マイナス40°Cの焼入れ法で非緩衝化80%メタノールよりも、細胞膜および細胞壁への損傷を著しく低くする。実際、改変法を用いて焼入れを行った細胞のほとんどすべてが、赤い蛍光発光を示し、これは、細胞膜および細胞壁が損傷していない酵母細胞の特徴である。これに対し、40°C法で非緩衝化80%メタノールを用いて焼入を行った細胞のほとんどすべてが、緑色の蛍光発光を示し、これは、細胞膜および細胞壁が著しく損傷している酵母細胞の特徴である。改変細胞焼入法はまた、マイナス40°Cの除菌法で非緩衝化80%メタノールよりも酵母細胞からの水溶性代謝物の漏出を著しく低くする。水溶性代謝産物標準の保持時間シフト値は有意に低く、ピーク形状は逆相カラムと比較してジウテリオニック相カラムに対して実質的に鋭い。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法のもう1つの利点は、ジウィッテリオニック相カラムを使用して、多様な構造、物理的、化学的特性を持つ異なる水溶性代謝産物を効率的に分離できることです。暗闇の中に立ってヨウ化プロピジウムを行うことを確認し、また、中間相を乱さない間、上の段階を収集することを確認してください。MS2 スペクトル ライブラリがないためにどの MSP にも注意を付けることができない場合は、NMR を使用してこの構造を説明します。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

アフィニティクロマトグラフィーによるインノシトールリン酸塩またはホスホイノシチド相互作用タンパク質の同定

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエの定量的メタボロミクス