Name: semi-quantitative determination of dopaminergic neuron density in the substantia nigra of rodent models using automated image analysis
Uploaded: 2021-02-02T12:30:00
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Les auteurs tiennent à remercier tout le personnel de l’Installation avancée de microscopie optique (AOMF) du Réseau universitaire de santé pour leur temps et leur aide dans l’élaboration de ce protocole.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux du Réseau universitaire de santé et exécutées conformément aux lignes directrices et aux règlements établis par le Conseil canadien de protection des animaux.
1. Injection stéréotaxique
<ol><li>Couples de rats Sprague-Dawley femelles adultes (250-280 g) dans des cages avec litière en bois et accès ad lib à la nourriture et à l’eau. Maintenir la colonie animale dans un cycle clair/sombre régulier...

<ol>
	<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li><li>Nair-Roberts, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+dopaminergic,+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+ventral+tegmental+area,+substantia+nigra+and+retrorubral+field+in+the+rat.">Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat.</a> Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).</li><li>Golub, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurostereology+protocol+for+unbiased+quantification+of+neuronal+injury+and+neurodegeneration.">Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).</li><li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology+in+neuroscience.">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li><li>Penttinen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+deep+neural+networks+to+count+dopamine+neurons+in+substantia+nigra.">Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra.</a> European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).</li><li>Yousef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+loss+and+degeneration+in+the+progression+of+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration.">Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).</li><li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+A53T+alpha-synuclein+in+the+rat+substantia+nigra+using+a+novel+AAV1/2+vector+produces+a+rapidly+evolving+pathology+with+protein+aggregation,+dystrophic+neurite+architecture+and+nigrostriatal+degeneration+with+potential+to+model+the+pathology+of+Parkinson's+disease.">Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).</li><li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+neurodegeneration+or+endogenous+compensation+in+an+animal+model+of+Parkinson's+disease+produced+by+decreasing+doses+of+alpha-synuclein.">Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein.</a> PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).</li><li>McKinnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-onset+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+dopaminergic+neurons+caused+by+alpha-synuclein.">Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).</li><li>Henderson, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+alpha-synuclein+pathology+through+the+brain+connectome+is+modulated+by+selective+vulnerability+and+predicted+by+network+analysis.">Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).</li><li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV1/2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment:+a+new+mouse+model+for+Parkinson's+disease.">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).</li><li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis:+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology.">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li></ol>

L’évaluation fiable de l’intégrité du système dopaminergique dans les modèles précliniques de palladium est essentielle pour déterminer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Par conséquent, il est important de contrôler et de réduire au minimum les confusions potentielles qui peuvent réduire la fiabilité et la reproductibilité des données histopathologiques. Des résultats quantitatifs prudents peuvent fournir plus d’informations que les descriptions qualitatives ou s...

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie du mouvement neurodégénérative répandue caractérisée par la présence d’agrégats protéiques contenant de la α-synucléine (α-syn) et la perte préférentielle de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNpc)1. La quantification du nombre de neurones dopaminergiques est une partie essentielle de la recherche sur la MP, car elle permet d’évaluer l’intégrité du système nigrostriatal, fournissant ainsi un critère d’évaluation important pour évaluer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Actuellement, la norme pour la quantification du nombre de cellules est le comptage stéréologique non biaisé, qui utilise des sections transversales bidimensionnelles (2D) du tissu pour estimer les caractéristiques volumétriques dans les structures tridimensionnelles (3D)2,3,4. Les méthodes thétélogiques modernes basées sur la conception utilisent des procédures d’échantillonnage aléatoire complètes et appliquent des protocoles de comptage (connus sous le nom de sondes) pour éviter les artefacts potentiels et les erreurs systématiques, permettant une détection fiable des différences légèrement supérieures à la variation inter-animaux5. Tandis que la stéréologie fournit un outil analytique puissant pour des études histologiques in vivo, elle prend beaucoup de temps, suppose la préparation uniforme d’échantillon, et exige la validation à plusieurs étapes, qui peut avoir un impact de plus en plus l’efficacité de plus en plus exigée pour l’investigation translationnelle préclinique.
Les progrès technologiques récents de la science numérique permettent d’adopter de nouvelles applications pour des évaluations plus efficaces de la pathologie sans stéréomicroscope, tout en comblant un besoin de substitut de la stéréologie impartiale. Ces méthodes augmentent la vitesse, réduisent l’erreur humaine et améliorent la reproductibilité des techniques téréologiques6,7. HALO est l’une de ces plateformes d’analyse d’images pour l’analyse quantitative des tissus en pathologie numérique. Il comprend une variété de modules différents et rapporte des données d’expression morphologiques et multiplexées sur une base cellule par cellule à travers des sections entières de tissu utilisant des algorithmes de reconnaissance de formes. Le module FL cytonucléaire mesure la positivité immunofluorescente des marqueurs fluorescents dans le noyau ou le cytoplasme. Cela permet de signaler le nombre de cellules positives pour chaque marqueur et le score d’intensité pour chaque cellule. Le module peut être adapté pour fournir des mesures individuelles de la taille des cellules et de l’intensité, bien que cette fonctionnalité ne soit pas requise pour la quantification des neurones dopaminergiques.
Le but de cette étude est de vérifier cette méthode avec un modèle de rat α-syn à base de vecteur viral préalablement validé de neurodégénérescencenigrale 8,9,10. Dans ce modèle, le mutant humain A53T α-syn est exprimé dans le SNpc par injection stéréotaxique du sérotype hybride adéno-associé du virus 1/2 (AAV1/2), entraînant une neurodégénérescence significative sur une période de 6 semaines. Le SNpc non injecté contralatéral peut, dans certaines études, servir de contrôle interne pour le côté injecté. Plus communément, l’injection de vecteur vide AAV (AAV-EV) dans une cohorte témoin d’animaux est utilisée comme témoin négatif. Nous présentons un guide étape par étape pour estimer la densité des neurones dopaminergiques restant dans le SNpc injecté après 6 semaines à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image automatisé (Figure 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A-Syn Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Elite</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-28180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>111-055-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAKO fluorescent mouting medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALO&#8482;</td>
			<td>Indica Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo-Clear II</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>HS202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB Peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>PAR070.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Investigator</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P21962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-quantitative determination of dopaminergic neuron density in the substantia nigra of rodent models using automated image analysis

L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra est une méthode clé dans la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson. Actuellement, le comptage stéréologique non biaisé est la norme pour la quantification de ces cellules, mais il reste un processus laborieux et long, qui peut ne pas être réalisable pour tous les projets. Ici, nous décrivons l’utilisation d’une plate-forme d’analyse d’image, qui peut estimer avec précision la quantité de cellules étiquetées dans une région d’intérêt prédéfinie. Nous décrivons un protocole étape par étape pour cette méthode d’analyse dans le cerveau de rat et démontrons qu’il peut identifier une réduction significative des neurones positifs d’hydroxylase de tyrosine dus à l’expression du mutant α-synuclein dans le nigra de substantia. Nous avons validé cette méthodologie en comparant avec les résultats obtenus par stéréologie impartiale. Prise ensemble, cette méthode fournit un processus rapide et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques, et convient donc à une détermination efficace de l’effet des interventions sur la survie cellulaire.

En appliquant les méthodes ci-dessus au tissu cérébral collecté 6 semaines après les injections d’AAV, nous avons démontré que l’injection stéréotaxique d’AAV exprimant le mutant A53T α-syn (AAV-A53T) dans le SNpc du cerveau de rat entraîne une réduction significative de la densité des neurones dopaminergiques par rapport à l’injection d’AAV vectoriel vide (AAV-EV) comme contrôle(Figure 5A,B). Le nombre moyen de neurones/mmTH-positifs 2 da...

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Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.

Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans le nigra de substantia est une mesure de résultats clé dans la recherche sur la maladie de Parkinson. Ce protocole raccourcit considérablement la charge de travail requise pour estimer le nombre de neurones. Cette méthode fournit un processus efficace dans le temps et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques et convient pour déterminer l’effet des interventions sur la survie cellulaire.Cette méthode pourrait être facilement adaptée pour fournir des comptages précis de neurones dans différentes régions du cerveau tout en maintenant les avantages de coût et de temps par rapport aux méthodes thétéologiques traditionnelles. Pour capturer des images IHC, utilisez le logiciel couplé à un microscope confocal à un grossissement 10X. Ouvrez le trou de la goupille à 1,5 unité de surface pour capturer un plan large totalisant 1,5 micromètre et mettre l’accent sur le côté injecté du cerveau.Dans l’onglet Acquisition, cochez l’option d’imagerie par balayage de tuiles et définissez les dimensions sur 10 par quatre. Sous le panneau du mode d’acquisition, définissez le zoom sur 1.1 pour éviter toute marque d’assemblage entre les images de numérisation de tuiles. Définissez la taille d’image sur 1024 par 1024 pixels et la moyenne sur deux pour garantir l’acquisition d’images de haute qualité.Dans le panneau des canaux, définissez la piste un sur Alexa 488 et la piste deux sur Alexa 555. Chargez la glissière sur la scène et choisissez une section avec une forte coloration TH. Cliquez en direct sur le panneau d’acquisition.Dans le panneau des canaux, réglez la force et le gain du laser à des niveaux qui maximisent le signal et limitent le bruit de fond. Utilisez l’indicateur de portée pour vous assurer que les signaux ne sont pas surexposés. Répétez cette opération avec plusieurs diapositives.Sous l’onglet acquisition, cochez la case positions. Pour commencer l’imagerie, utilisez l’oculaire et choisissez la première section montrant une coloration TH positive. Ensuite, définissez le focus sur le point d’intérêt et déplacez la scène vers la ligne médiane de la section.Cela enregistre la position dans les axes X, Y et Z et image une analyse de tuiles capturant toute la section. Répétez cette opération pour toutes les autres diapositives, y compris un site non injecté. Séparez les fichiers image à l’aide du logiciel approprié et importez-les dans un logiciel d’analyse d’image automatisé.Définissez une région d’intérêt en sélectionnant l’outil d’annotation plume pour dessiner une annotation autour de substantia nigra pars compacta. Passez à l’onglet Analyse et sélectionnez réglage en temps réel dans le menu déroulant Analyser. Cela ouvre une fenêtre séparée sur l’image de la section permettant de modifier en temps réel les paramètres d’analyse.Sous la section grossissement de l’analyse, sélectionnez le zoom d’image approprié. Dans la section détection cellulaire, sélectionnez le colorant nucléaire comme colorant utilisé pour la coloration TH. Ajustez le seuil de contraste nucléaire, l’intensité nucléaire minimale, l’agressivité de la segmentation nucléaire et les paramètres de taille nucléaire tout en surveillant attentivement la fenêtre de réglage du temps.Répétez ce processus avec plusieurs échantillons. Une fois qu’un nombre approprié d’images a été échantillonné et que le réglage en temps réel a été ajusté en conséquence, enregistrez les paramètres d’analyse dans le menu déroulant Actions des paramètres. Sélectionnez toutes les images à analyser et cliquez sur analyser.Choisissez le paramètre d’analyse qui vient d’être enregistré et, dans la fenêtre de la région d’analyse, cochez la case Couches d’annotations, puis cochez la première couche et cliquez sur Analyser. Une fois terminé, exportez les données d’analyse récapitulatives pour toutes les sections en sélectionnant l’option d’exportation des données d’analyse d’objet. Cet ensemble de données pourrait être utilisé pour examiner les changements dans la taille des cellules en réponse à une toxine ou à un traitement.Pendant six semaines après des injections associées de virus ou d’AAV d’adeno, l’injection stereotactic d’AAV exprimant l’alpha synuclein du mutant A53T dans le nigra de substantia dans le cerveau de rat a eu comme conséquence une réduction significative de la densité des neurones dopaminergiques. Le nombre moyen de neurones positifs de TH par millimètre au carré dans le nigra de substantia des rats injectés avec AAV-A35T a été sensiblement diminué par rapport à celui des rats injectés avec le vecteur vide d’AAV. Des observations semblables ont été faites utilisant la stéréologie impartiale.Lorsque vous tentez ce protocole, gardez à l’esprit que le logiciel n’est aussi utile que s’il est formé pour l’être. Par conséquent, il faut prendre le temps et le soin de s’assurer qu’une seule cellule est identifiée comme une seule cellule. Le logiciel peut être adapté pour mesurer une intensité de fluorescence d’autres protéines d’intérêt telles que l’alpha-synucléine afin de déterminer si les traitements peuvent moduler les niveaux de protéines.Cette technique a permis une plus grande efficacité lors de l’essai de l’effet de plusieurs thérapies potentielles sur la densité des neurones dopaminergiques.

Research

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Analyse automatisée des Sholl morphologie neuronale numérisés à de multiples échelles

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Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

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Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

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