Name: semi-quantitative determination of dopaminergic neuron density in the substantia nigra of rodent models using automated image analysis
Uploaded: 2021-02-02T12:30:00
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Gli autori ringraziano tutto lo staff dell'Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) di University Health Network per il loro tempo e la loro assistenza nello sviluppo di questo protocollo.

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali della rete sanitaria universitaria ed eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti stabiliti dal Canadian Council on Animal Care.
1. Iniezione stereotassia
<ol><li>Coppia femmina adulta Ratti Sprague-Dawley (250-280 g) in gabbie con biancheria da letto in legno e accesso ad lib a cibo e acqua. Mantenere la colonia animale in un ciclo normale di luce/buio di 12 ore (luci accese alle 06:30) con tempera...

<ol>
	<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li><li>Nair-Roberts, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+dopaminergic,+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+ventral+tegmental+area,+substantia+nigra+and+retrorubral+field+in+the+rat.">Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat.</a> Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).</li><li>Golub, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurostereology+protocol+for+unbiased+quantification+of+neuronal+injury+and+neurodegeneration.">Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).</li><li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology+in+neuroscience.">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li><li>Penttinen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+deep+neural+networks+to+count+dopamine+neurons+in+substantia+nigra.">Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra.</a> European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).</li><li>Yousef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+loss+and+degeneration+in+the+progression+of+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration.">Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).</li><li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+A53T+alpha-synuclein+in+the+rat+substantia+nigra+using+a+novel+AAV1/2+vector+produces+a+rapidly+evolving+pathology+with+protein+aggregation,+dystrophic+neurite+architecture+and+nigrostriatal+degeneration+with+potential+to+model+the+pathology+of+Parkinson's+disease.">Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).</li><li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+neurodegeneration+or+endogenous+compensation+in+an+animal+model+of+Parkinson's+disease+produced+by+decreasing+doses+of+alpha-synuclein.">Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein.</a> PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).</li><li>McKinnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-onset+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+dopaminergic+neurons+caused+by+alpha-synuclein.">Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).</li><li>Henderson, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+alpha-synuclein+pathology+through+the+brain+connectome+is+modulated+by+selective+vulnerability+and+predicted+by+network+analysis.">Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).</li><li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV1/2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment:+a+new+mouse+model+for+Parkinson's+disease.">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).</li><li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis:+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology.">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li></ol>

La valutazione affidabile dell'integrità del sistema dopaminergico nei modelli preclinali di PD è fondamentale per determinare l'efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Pertanto, è importante controllare e ridurre al minimo le potenziali confusioni che possono ridurre l'affidabilità e la riproducibilità dei dati istopatologici. Risultati quantitativi accurati possono fornire più informazioni rispetto alle sole descrizioni qualitative o semi-quantitative. Allo stesso tempo, dobbiamo riconoscer...

Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo del movimento neurodegenerativo prevalente caratterizzato dalla presenza di aggregati proteici contenenti α-sinuleina (α-syn) e dalla perdita preferenziale di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNpc)1. La quantificazione del numero di neuroni dopaminergici è una parte vitale della ricerca PD in quanto consente la valutazione dell'integrità del sistema nigrostriatale, fornendo così un endpoint importante per valutare l'efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Attualmente, lo standard per la quantificazione del numero di cellule è il conteggio stereologico imparziale, che utilizza sezioni trasversali bidimensionali (2D) del tessuto per stimare le caratteristiche volumetriche nelle strutture tridimensionali (3D)2,3,4. I moderni metodi stereologici basati sulla progettazione utilizzano procedure di campionamento casuali complete e applicano protocolli di conteggio (noti come sonde) per evitare potenziali artefatti ed errori sistematici, consentendo un rilevamento affidabile delle differenze solo leggermente superiore alla variazione tra animali5. Mentre la stereologia fornisce un potente strumento analitico per studi istologici in vivo, richiede molto tempo, presuppone una preparazione uniforme del campione e richiede la convalida in diversi passaggi, il che può influire sull'efficienza sempre più richiesta per l'indagine traslazionale preclinale.
I recenti progressi tecnologici nella scienza digitale rendono possibile l'adozione di nuove applicazioni per valutazioni più efficienti della patologia senza stereomicroscopio, pur riempiendo un'esigenza di surrogato di stereologia imparziale. Questi metodi aumentano la velocità, riducono l'errore umano e migliorano la riproducibilità delle tecnichestereologiche 6,7. HALO è una di queste piattaforme di analisi delle immagini per l'analisi quantitativa dei tessuti nella patologia digitale. Comprende una varietà di moduli diversi e riporta dati di espressione morfologici e multiplexati su base cellulare per cella su intere sezioni tissutali utilizzando algoritmi di riconoscimento dei modelli. Il modulo FL citonucleare misura la positività immunofluorescente dei marcatori fluorescenti nel nucleo o nel citoplasma. Ciò consente di segnalare il numero di celle positive per ogni marcatore e il punteggio di intensità per ogni cella. Il modulo può essere adattato per fornire le singole dimensioni cellulari e le misurazioni dell'intensità, anche se questa caratteristica non è necessaria per la quantificazione dei neuroni dopaminergici.
Lo scopo di questo studio è quello di verificare questo metodo con un modello di ratto α-syn basato su vettori virali precedentemente convalidato di neurodegenerazione nigrale8,9,10. In questo modello, il mutante umano A53T α-syn è espresso nell'SNpc per iniezione stereotassitica del sierotipo ibrido virus adeno-associato 1/2 (AAV1/2), con conseguente significativa neurodegenerazione per un periodo di 6 settimane. L'SNpc non iniettato contralaterale può, in alcuni studi, servire da controllo interno per il lato iniettato. Più comunemente, l'iniezione di vettore vuoto AAV (AAV-EV) in una coorte di controllo degli animali viene utilizzata come controllo negativo. Presentiamo una guida dettagliata per stimare la densità dei neuroni dopaminergici che rimangono nell'SNpc iniettato dopo 6 settimane utilizzando un software automatizzato di analisi delle immagini(Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A-Syn Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Elite</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-28180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG</td>
			<td>Jackson Immuno</td>
			<td>111-055-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAKO fluorescent mouting medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALO&#8482;</td>
			<td>Indica Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo-Clear II</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>HS202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB Peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>PAR070.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Investigator</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P21962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaMount mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-quantitative determination of dopaminergic neuron density in the substantia nigra of rodent models using automated image analysis

La stima del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra è un metodo chiave nella ricerca pre-clinica sul morbo di Parkinson. Attualmente, il conteggio stereologico imparziale è lo standard per la quantificazione di queste cellule, ma rimane un processo laborioso e dispendioso in termini di tempo, che potrebbe non essere fattibile per tutti i progetti. Qui descriviamo l'uso di una piattaforma di analisi delle immagini, in grado di stimare con precisione la quantità di celle etichettate in una regione di interesse predefinita. Descriviamo un protocollo passo-passo per questo metodo di analisi nel cervello del ratto e dimostriamo che può identificare una significativa riduzione dei neuroni positivi tirosina idrossilasi a causa dell'espressione della α-sinuleina mutante nella substantia nigra. Abbiamo convalidato questa metodologia confrontando i risultati ottenuti da stereologia imparziale. Nel complesso, questo metodo fornisce un processo efficiente in termini di tempo e accurato per rilevare i cambiamenti nel numero di neuroni dopaminergici, ed è quindi adatto per una determinazione efficiente dell'effetto degli interventi sulla sopravvivenza cellulare.

Applicando i metodi di cui sopra al tessuto cerebrale raccolti 6 settimane dopo le iniezioni di AAV, abbiamo dimostrato che l'iniezione stereotassica di AAV che esprime mutante A53T α-syn (AAV-A53T) nell'SNpc del cervello del ratto si traduce in una significativa riduzione della densità dei neuroni dopaminergici rispetto all'iniezione di vettore vuoto AAV (AAV-EV) come controllo(Figura 5A, B). Il numero medio di neuroni TH-positivi/mm2 nell'SNpc dei ratti iniett...

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Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Qui presentiamo un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto.

Determinazione semi-quantitativa della densità neuronale dopaminergica nella Substantia Nigra dei modelli di roditori utilizzando l'analisi automatizzata delle immagini

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

La stima del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra è una misura chiave del risultato nella ricerca sul morbo di Parkinson. Questo protocollo riduce significativamente il carico di lavoro necessario per stimare il numero di neuroni. Questo metodo fornisce un processo efficiente in termini di tempo e accurato per rilevare i cambiamenti nel numero di neuroni dopaminergici ed è adatto per determinare l'effetto degli interventi sulla sopravvivenza cellulare.Questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per fornire conteggi accurati dei neuroni in diverse regioni cerebrali mantenendo al contempo vantaggi in termini di costi e tempo rispetto ai metodi stereologici tradizionali. Per acquisire immagini IHC utilizzare il software accoppiato a un microscopio confocale con ingrandimento 10X. Aprire il foro del perno a 1,5 unità di area per catturare un piano largo per un totale di 1,5 micrometri e impostare la messa a fuoco sul lato iniettato del cervello.Nella scheda acquisizione controllare l'opzione di imaging della scansione dei riquadri e impostare le dimensioni su 10 per quattro. Nel pannello modalità di acquisizione impostare lo zoom su 1.1 per evitare segni di cucitura tra le immagini di scansione del riquadro. Impostare le dimensioni del fotogramma su 1024 per 1024 pixel e la media su due per garantire un'acquisizione di immagini di alta qualità.Nel pannello canali impostare traccia uno su Alexa 488 e traccia due ad Alexa 555. Caricare la diapositiva sul palco e scegliere una sezione con una forte colorazione TH. Clicca in diretta sul pannello di acquisizione.Nel pannello canali impostare la forza e il guadagno del laser su livelli che massimizzano il segnale e limitano il rumore di fondo. Utilizzare l'indicatore di intervallo per assicurarsi che i segnali non siano sovraesposti. Ripetere questa situazione con più diapositive.Nella scheda acquisizione selezionare la casella posizioni. Per iniziare l'imaging, utilizzare l'oculare e scegliere la prima sezione che mostra la colorazione TH positiva. Quindi impostare lo stato attivo nel punto di interesse e spostare lo stage sulla linea mediana della sezione.In questo modo viene salvata la posizione negli assi X, Y e Z e verrà etata una scansione del riquadro che cattura l'intera sezione. Ripetere questa ripetizione per tutte le altre diapositive, incluso un sito non iniettato. Separare i file di immagine utilizzando il software appropriato e importarli in un software di analisi automatica delle immagini.Definite una regione di interesse selezionando lo strumento di annotazione a penna per disegnare un'annotazione attorno alla substantia nigra pars compacta. Passare alla scheda analisi e selezionare Ottimizzazione in tempo reale dal menu di analisi a discesa. In questo modo viene aperta una finestra separata sull'immagine della sezione che consente la modifica in tempo reale dei parametri di analisi.Nella sezione ingrandimento analisi selezionare lo zoom dell'immagine appropriato. Nella sezione di rilevamento delle cellule selezionare il colorante nucleare come colorante utilizzato per la colorazione TH. Regolare la soglia di contrasto nucleare, l'intensità nucleare minima, l'aggressività della segmentazione nucleare e le impostazioni delle dimensioni nucleari, osservando attentamente la finestra di sintonizzazione del tempo.Ripetere questo processo con più campioni. Una volta che un numero appropriato di immagini è stato campionato e l'ottimizzazione in tempo reale è stata regolata di conseguenza, salvare le impostazioni di analisi nel menu a discesa delle azioni delle impostazioni. Selezionare tutte le immagini da analizzare e fare clic su analizza.Scegliete l'impostazione di analisi appena salvata e nella finestra area di analisi selezionare la casella livelli di annotazione, quindi selezionare il livello uno e fare clic su analizza. Una volta completati, esportare i dati di analisi di riepilogo per tutte le sezioni selezionando l'opzione per esportare i dati di analisi degli oggetti. Questo set di dati potrebbe essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule in risposta a una tossina o terapeutica.Sei settimane dopo l'adeno associato al virus o alle iniezioni di AAV, l'iniezione stereotassica di AAV che esprime la sinuleina alfa A53T mutante nella substantia nigra nel cervello del ratto ha portato a una significativa riduzione della densità dei neuroni dopaminergici. Il numero medio di neuroni th positivi per millimetro al quadrato nella substantia nigra dei ratti iniettati con AAV-A35T è stato significativamente diminuito rispetto a quello dei ratti iniettati con il vettore vuoto AAV. Osservazioni simili sono state fatte usando una stereologia imparziale.Quando si tenta questo protocollo tenere a mente il software è utile solo quanto viene addestrato ad essere. Pertanto, è necessario prestare tempo e attenzione per garantire che una singola cellula sia identificata come una singola cellula. Il software può essere adattato per misurare un'intensità di fluorescenza di altre proteine di interessi come l'alfa-sinucleina per determinare se i trattamenti possono modulare i livelli proteici.Questa tecnica ha permesso una maggiore efficienza durante il test dell'effetto di molteplici potenziali terapie sulla densità dei neuroni dopaminergici.

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