Name: creation and maintenance of a living biobank - how we do it
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
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我们衷心感谢我们的图形助理珍妮·伯迈斯特录制和编辑视频。此外，我们感谢外科和病理科的同事的长期合作。我们还要感谢罗斯托克大学 IT 和媒体中心的生产经理 Marcus Müller 提供录音设备并改进音质。
资金： 德国癌症援助基金会（DKH e.V.），赠款编号108446，赠款编号TBI-V-1-241-VBW-084，由该州梅克伦堡-沃尔波默恩部分资助这项研究。

以下研究已获罗斯托克大学医学中心机构审查委员会批准（II HV 43/2004，A 45/2007，A 2018-0054，A 2019-0187和A 2019-0222）。此外，所有兽医相关程序都已得到兰德萨姆特·费尔特沙尔察夫特、莱本斯密特尔西切莱特和菲舍雷·梅克伦堡-沃尔波默恩的核准，注册号为LALLF M-V/TSD/7221.3-2-020/17和7221.3-1-007/19。
1. 实验先决条件
<ol><li>满足建立和维护生物库的若干重要框架条件。<ol>
<li>使用具有外科部门和足够数量的肿瘤切除术的诊所，以及设备齐全的实验室和充足的学术人员。良好的基础设施和与合作病理部门的牢固联系是进一步的先决条件。</li>
		<li>在体内研究中，使用适合免疫性小鼠的住房条件的动物设施。</li>
		<li>获得医疗保健道德委员会对患者源性材料的任何研究的授权。根据当地法规，获得主管机关的 现场研究批准 。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 样本收集
<ol><li>手术前一天<ol>
<li>评估所有可伸缩结直肠或胰腺癌患者和/或相应的转移生物库资格。避免包括与新判断预处理的病例，非常小的肿瘤，不确定的尊严或病变的肿瘤，已经部分重新解剖内窥镜之前。</li>
		<li>在有关外科手术的知情同意讨论中，获得患者参与的书面批准。及时通知所有参与的外科医生、实验室团队以及病理学家。</li>
	</ol>
</li>
	<li>样本采集<ol>
<li>在手术开始前立即通知手术室 （OR） 中的所有服务员有关生物库的组织收集情况。 注：组织不得固定在正式素中，这一点至关重要。如果组织被浸入甲醛中，它就不适合综合生物库。</li>
		<li>在麻醉诱导后立即抽取40 mL的肝化血（2 x 20 mL注射器）以及标准的7.5 mL血清管，并迅速转移到实验室进行PBL隔离和血清处理（见步骤3-4）。</li>
		<li>直接从操作台获取重新切除的标本，将其放入适当的容器中，并将其带到病理部门。写下脱离循环、切除和到达病理学的时间点。 注：生物库标本的适用性应由解剖肿瘤和非恶性组织的合作病理学家进行评估。不要自行去除标本的任何部分，这可能会损害随后的病理报告。</li>
		<li>将两个组织件放在单独的 15 到 50 mL 聚丙烯管中，在冰上放置 10 到 30 mL 组织存储液（或 DPBS）。写下接收时间，并立即将标本转移到实验室。 注：以下协议步骤 3-6 必须在严格的无菌条件下在层流柜中执行。在室温下使用所有液体。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 血清处理
<ol><li>在预冷离心机中将 7.5 mL 血清管在 1128 x g 和 4 °C 下离心 15 分钟。</li>
	<li>在预先标记的低温管中，每管1 mL血清，并冻结在液氮中。</li>
</ol>4. 按密度梯度离心隔离PBL
注：与两个 20 mL 注射器中的每一个平行工作。
<ol><li>将 20 mL 的肝化血液填充到 50 mL 聚丙烯管中，并添加 15 mL 的 DPBS。</li>
	<li>用血清学移液器取15 mL的Pancoll，小心地将移液器插入聚丙烯管的底部，然后非常缓慢地释放潘科尔，在血液/DBPS柱下形成一层。</li>
	<li>离心机在375 x g 15分钟 没有 刹车。</li>
	<li>将两个样品的中柱和顶柱之间的不透明相间层吸气并转移到新鲜的 50 mL 聚丙烯管中，并填充 DPBS 至 50 mL。</li>
	<li>离心机在270 x g 15分钟 与 刹车。</li>
	<li>吸气和丢弃超纳坦，在4.5 mL的冷冻介质中重新悬浮细胞颗粒。</li>
	<li>每低温管的悬架为 1.5 mL，将管子紧紧关闭，并将其放置在适合缓慢冷冻的冷冻容器中，并储存在 -80 °C。</li>
</ol>5. 组织处理
注：从生成肿瘤和健康组织的快速冷冻样本开始，以保持核酸的完整性。
<ol><li>肿瘤组织标本<ol>
<li>将肿瘤标本与几个 mL 的组织存储溶液从聚丙烯管转移到培养皿。如有必要，用 DPBS 冲洗。避免触摸标本，使用两个无菌手术刀处理组织。随时避免干燥。</li>
		<li>在单独的盘中以方便的尺度称量肿瘤标本，并注意组织重量。</li>
		<li>切割前评估肿瘤组织的大小、形状和组织质量。旨在获得至少一块约针头大小的捕捉冻结和四个立方体约30毫米3（ 边缘长度3 x 3x 3毫米），每个至关重要的低温保存。以四倍的速度生成尽可能多的 30 mm3 -立方体，并生成一块，每 5 个立方体进行捕捉冻结。还要考虑到坏死部分必须被切断，以便立方体只由重要组织组成。</li>
		<li>生成 3 毫米厚度的切片。切断坏死部分，可区分为凝胶状或液体质量，并将切片切成两个所需尺寸的立方体。 注意：此时 不要丢弃任何组织。
</li>
		<li>捕捉冻结<ol>
<li>相应地标记低温管（见步骤 7.7）。</li>
			<li>将一块小纸巾放在每个预先标记的低温管上。立即将样品浸入液氮中几分钟，然后储存在-80°C。</li>
		</ol>
</li>
		<li>重要组织的冷冻保存<ol>
<li>相应地标记低温管（见步骤 7.7），并填充每个 1.5 mL 的冰柜介质。把冷冻容器放在长凳旁边。 注意：请尽快遵循下一步。由于冷冻介质中的DMSO具有细胞毒性特性，在没有适当冷却的情况下，组织被浸入冰柜介质的时间不应超过2分钟。</li>
			<li>将 30 mm3 立方体排列为四倍。将坏死组织和其他残留物推到盘子的边缘，但不要丢弃它们。</li>
			<li>用手术刀刀片铲立方体，每个低温管传输 4 个立方体。确保肿瘤块完全淹没在冰柜介质中。将管子紧紧地关闭，放在适合慢速冷冻的冷冻容器中，并存放在-80°C的冰柜中。</li>
			<li>将低温管转移到适合的存储系统中，在-140°C或更低时进行长期存储。实验室库存管理系统中的文档是强制性的。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>健康组织标本：重复步骤 5.1.1。健康组织标本为5.1.6.4。</li>
</ol>6. 原始细胞培养
<ol><li>将培养皿中的肿瘤组织（包括坏死残片）的残留物分解为尽可能小的手术刀。</li>
	<li>将无菌细胞过滤器（100μm 孔径）放在 50 mL 聚丙烯管上。</li>
	<li>使用血清学移液器将 5-10 mL 的 DPBS 添加到培养皿中，将组织残留物和移液器上下浮动以产生悬架。</li>
	<li>将带移液器的悬架转移到细胞过滤器中。</li>
	<li>重复步骤 6.3-6.4，直到从培养皿中解决所有组织残留问题。</li>
	<li>使用 20 mL 单向注射器的柱塞通过细胞过滤器挤压细胞和组织悬架。</li>
	<li>用 5-10 mL 的新鲜 DPBS 冲洗，丢弃细胞过滤器并正确关闭管子。</li>
	<li>将悬架在 180 x g 下停机 5-10 分钟。</li>
	<li>准备一个胶原蛋白-I预涂6井板与1.5 mL的中等每口井。</li>
	<li>吸气并丢弃超生剂。将颗粒重新悬浮在 3 mL 的 DPBS 或介质中，并在每个油井中添加 500μL 的悬架。将板放入孵化器（100% 湿度、5% CO2、37 °C）</li>
	<li>每天监测板的细胞生长和污染。 注：此处没有描述到建立永久细胞系的进一步细胞培养。</li>
</ol>7. PDX 生成
<ol><li>只有符合您管辖权主管机关要求的适当合格人员进行 in 活体 实验。</li>
	<li>在特定无病原体 （SPF） 条件下，家庭免疫机能小鼠满足使用的小鼠菌株的需求。卫生措施包括单独通风的笼子、自动包装食品、水和筑巢材料以及安全气闸和佩戴个人防护设备。</li>
	<li>事先自动切开所有仪器，每个肿瘤病例只使用一套仪器，以避免交叉污染。尽可能处理肿瘤组织。下面命名的所有塑料物品应无菌、一次性，并在每次手术后丢弃。 注：PDX生成的方法由每个冷冻管冻结四个肿瘤组织块的方法确定，每个样本需要两只小鼠，理想情况下可产生四个PDX肿瘤。</li>
	<li>通过实验室库存管理系统选择所需的主肿瘤进行雕刻，并将样品（保存完好的肿瘤组织）从主储罐转移到便携式液氮容器（干冰上-80°C的中间储存也很方便）。</li>
	<li>在进入SPF区（磨砂、木块、围裙、护发罩、外科口罩和过鞋）之前，先穿上个人防护装备，对双手和所有设备进行消毒。</li>
	<li>马特里格尔浸泡<ol>
<li>取出液氮容器中的低温管，等待标本解冻。</li>
		<li>标记 50 mL 聚丙烯管，并填充 35 mL 的 DPBS。</li>
		<li>向上和向下倾斜低温管，并在组织中浆转移后立即将内容转移到聚丙烯管中。轻轻冲洗肿瘤组织块，将主体积从管子中丢弃在单独的容器中，合上盖子，将管子向上向下，使四个组织块聚集在盖子中。</li>
		<li>将培养皿放在冷却蓄能器上，将 100μL 的 Matrigel 作为单个液滴放入中间。使用解剖钳子将肿瘤碎片转移到母体。确保每一块都完全覆盖着马特里格尔。在4°C下孵育10分钟。</li>
	</ol></li>
	<li>小鼠麻醉（每个样本2只小鼠，并行工作）<ol>
<li>准备3：1 - 氯胺酮（100毫克/mL）和西拉津（20毫克/mL）麻醉剂。建议剂量为 90/6 毫克/千克体重。</li>
		<li>称重鼠标，将必要的麻醉液绘制成一次性胰岛素注射器。</li>
		<li>将鼠标放在笼子的网格上，用一只手轻轻地拉着它的尾巴，以诱导向前移动，同时用另一只手的紧握夹住颈部。抬起网格的鼠标，转动握手，使动物的背部放在手掌上。用你的小指固定后腿之一， 并注射麻醉剂内腹。把老鼠放回笼子里，等待麻醉剂的上岗。</li>
		<li>将麻醉鼠标放在加热板上，用软膏遮住眼睛，以避免角膜损伤。用手术钳子轻轻捏捏老鼠的后脚，以评估麻醉的深度。 注：缺乏运动表示深度嗜睡。任何类型的运动要么需要更多的时间来达到所需的麻醉深度或额外的麻醉剂剂量。</li>
	</ol></li>
	<li>手术<ol>
<li>通过捏住鼠标的脖子形成皮肤褶皱，然后用施用器皮下注入微芯片（有关编程详细信息，请参阅步骤 9）</li>
		<li>如有必要，剃光鼠的侧翼（NMRInu/nu 小鼠不需要剃须），用棉签涂抹波维酮碘，并使用手术窗帘创建无菌场。</li>
		<li>用手术钳抬起侧翼的皮肤，用剪刀做一个约4毫米的小切口，用剪刀做钝制，形成一个小皮下口袋。</li>
		<li>将一块肿瘤片放入每个口袋，放在后端。</li>
		<li>夹住 100 μL 移液器尖端，从培养皿中吸出剩余的 Matrigel，并将其均等地涂入每个皮肤口袋。</li>
		<li>用简单的中断缝合线关闭伤口，并涂上喷雾敷料。</li>
	</ol></li>
	<li>扫描微芯片并检查小鼠和肿瘤 ID 的有效性。</li>
	<li>准备一个新的笼子与新鲜的床上用品和筑巢材料，以及啃棒。用纸巾折叠一个"垫子"，用高架头将鼠标放在红外热灯下。</li>
	<li>将 0.25 mL 的三叶醇/硫化物氧化物（400 毫克/80 毫克）与 100 mL 的饮用水混合，并通过饮用水瓶进行管理。考虑一只小鼠每天消耗大约 150 mL 的体重。 注：由于皮下PDX模型与术后疼痛无关，无论是在伤口愈合过程中，还是在肿瘤生长过程中，都不需要术后镇痛。请注意，您机构/当局的动物福利准则可能有所不同。</li>
	<li>实验动物监测<ol>
<li>每天监测老鼠的苦恼迹象。这可以委托给合格的动物饲养员。</li>
		<li>继续使用上述剂量进行术后抗生素治疗4周。每周更换两次抗生素混合物。</li>
		<li>每周至少测量一次肿瘤大小，理想情况下每天用卡钳（肿瘤体积 = 0.52 x 长度 x 宽度 x 高度 [mm3]）测量肿瘤大小，并在数据库中记录。</li>
	</ol></li>
</ol>8. PDX 收获和加工
<ol><li>收获和处理PDX肿瘤，时间： 肿瘤大小达到1.500毫米3的目标体积。 带有疼痛和/或疾病和治疗的肿瘤携带动物的迹象是徒劳的。 肿瘤变渗透或穿透小鼠的皮肤。</li>
	<li>读取微芯片以识别正确的 PDX。</li>
	<li>通过法律方法（取决于国家指南）对小鼠实施安乐死，例如 CO2- 窒息或氯胺酮/西拉津注射，然后是宫颈脱位。</li>
	<li>用手术钳在侧翼抬起皮肤，用与肿瘤相距几毫米的梅森鲍姆剪刀切除。</li>
	<li>通过钝化准备分离肿瘤上方的皮肤，然后用解剖钳子小心地抓住肿瘤，将肿瘤从身体的表面筋膜中分离。</li>
	<li>用 DPBS 冲洗肿瘤，放入培养皿中，并切除相邻的结缔组织。</li>
	<li>此时，执行以下一项：<ol>
<li>切割 30 mm3 立方体并创建新的 PDX（在点 7.7.4 处使用协议）。</li>
		<li>将肿瘤切成切片，然后转移到形态盒式磁带中，保存在4%甲醛中，供以后的石蜡嵌入。</li>
		<li>用组织存储溶液将肿瘤保存在管子中，将其添加到生物库（在第 3 步使用协议）和/或创建 PDX 衍生的细胞系（在第 4 步使用协议）</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 生物库和数据管理
<ol><li>根据 表 1为每个肿瘤病例分配内部 ID 。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>实验室位置/名称</td>
			<td>癌症实体</td>
			<td>连续案例编号</td>
			<td>规范</td>
			<td>连续编号</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td>结肠直肠</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>_Met=转移</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>P=胰腺</td>
			<td>_Tu=肿瘤</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">示例： HROC389_Met2 = 罗斯托克， 结肠直肠癌， 病例 389， 第二转移</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：样本ID的定义。
<ol start="2"><li>将患者同意书与肿瘤 ID 一起以电子和纸质形式存储。</li>
	<li>收集尽可能多的临床数据，并单独存储它们。</li>
	<li>使用数据管理软件（例如冷冻机）或其他软件，并创建一个带有标签打印软件的界面，以生成耐温、自粘条形码标签。</li>
	<li>通过打开数据管理软件添加新样本，定义标本类型并记录以下信息：肿瘤 ID、组织类型、冻结方法、日期、负责员工、通道号、鼠标 ID 和鼠标菌株。</li>
	<li>将样品分配到储罐中的特定位置。</li>
	<li>PDX 的跟踪和监控（适用于步骤 7-8）<ol>
<li>在便携式蓝牙设备（笔记本电脑或平板电脑）上使用 MS Access 数据库（或类似系统）来记录肿瘤 ID、植入日期、安乐死日期、鼠标年龄和菌株以及肿瘤随着时间的推移的生长。</li>
		<li>将微芯片读取器连接到设备，并在植入前读取微芯片。</li>
		<li>为每个鼠标分配特定 ID：我们使用以下方案：（见下表2）</li>
		<li>植入后，将 ID 与鼠标特征一起记录在数据库中。</li>
		<li>重读微芯片并检查微芯片的规格、数据库和低温管标签是否一致。</li>
		<li>相应地为每个鼠标笼创建一个标签。 注：要创建物理备份，请将带有相应微芯片标签的低温管标签贴在小册子中，并注明日期和鼠标应变。</li>
		<li>要监测单个 PDX 的肿瘤生长，使用连接到数据库设备的读卡器扫描小鼠的微芯片，以进行识别，并记录每周由卡钳测量的肿瘤大小。</li>
		<li>通过分析肿瘤的生长曲线，规划PDX收获的理想时间点。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>肿瘤 ID</td>
			<td>在 N2 （+f） 中之前存储</td>
			<td>通道 （=T） 编号</td>
			<td>连续鼠标 （+M） 编号</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">示例：HROP12 fT0 M1 = 罗斯托克，胰腺癌，病例 12，由冷冻原组织生成，第一通道，小鼠 1。</td>
		</tr>
</tbody></table>表2：PDX ID的定义。

<ol>
	<li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies.">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies.">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li><li>Wilding, J. 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除了遵守隐私、医疗法和动物福利的法律法规外，建立一个活生生的生物库是有前提的，一个良好的基础设施和一个协调良好的团队。事实证明，直接让一部分外科工作人员参与研究程序是有利的，因为他们可以很好地评估个别患者是否适合组织捐赠。此外，当患者在手术知情同意讨论过程中获得书面批准时，患者往往更频繁地同意生物库。为了节省时间和资源，不应选择可能产生不足肿瘤组织量的病例进行生物库。当涉及到标本采集时，格言"沟通是关键"是一个简单的，但往往被忽视的真理。只需要一个不知情的戏剧护士或外科同事破坏标本的权利，在开始像往常一样进行，并添加甲醛的切除标本。因此，每个参与员工都熟悉 SOP 进行生物库处理，这一点绝对至关重要。外科医生应该注意到前一天和右在程序开始关于预定的组织收集。此外，选择用于生物库的案例应在电子 OR 计划中突出显示。从手术标本上采集组织应由病理学家进行。首先，这将确保组织收获不会干扰最终的病理报告。其次，这增加了接受具有足够数量的可行癌组织的组织的可能性。特别是在胰腺癌与明显的脱塑反应和频繁的坏死区，可行的部分很难识别宏观为未经训练的眼睛。作为这一规则的例外，如果手术间隙可以宏观地定义，则大肝或肺转移的组织块有时可能由外科医生切除"后表"。经总切除术（TME）重新切除的直肠癌可能不适合生物库，因为石蜡嵌入前从重新切除的标本中采集的组织可能会干扰TME质量评估。或者，用于生物库的组织可以通过直肠癌的跨肛部活检获得。
原肿瘤原发细胞培养物的建立率普遍较低。PDX衍生的二次细胞培养更有可能被成功建立。我们建议对每个病例测试不同的介质，并在第一个通道使用抗生素补充剂，以将污染减少到最低限度，因为收获的组织很少是无菌的。繁殖成功后，应通过FACS分析确认每个细胞系为癌细胞系，并定期检测真菌污染。为了排除交叉污染，建议定期进行 STR 分析。应当指出，初级和二级细胞系的建立方案不断受到优化。关于单一媒体的组成和成功率的细节显然超出了这项工作的范围，将单独公布。
对于PDX雕刻，肿瘤组织可以在切除后直接植入，也可以用10%DMSO或类似的冷冻介质冷冻保存胎儿小腿血清，以延迟植入。肿瘤组织采集后立即植入，给后勤和实验室工作人员带来压力，冷冻保存后的异种采集结果一点也不逊色。此外，在肿瘤植入前在母体中孵育组织，显著提高雕刻率12。我们建议延迟雕刻后，明确的病理发现和立即处置错误收集的组织标本。由于原版雕刻的成功率随着受体小鼠的免疫缺陷而增加，我们倾向于使用NSG小鼠进行第一次PDX通道。在第一次成功的PDX雕刻后，NMRInu/nu小鼠可以而且应该用于后续的通道和组织扩张。与NSG或类似的免疫降解菌株相比，这种菌株更坚固、更便宜、更容易繁殖，但仍显示出合理的雕刻率。此外，它的裸体有助于植入和肿瘤生长监测。为了提高后续段落的雕刻率，我们建议尽可能将新收获的 PDX 组织直接转移到宿主小鼠身上，特别是对于生长缓慢的 PDX 和初级雕刻成功率低的案例。柯林斯和朗最近回顾了14项结肠直肠PDX建立研究，并报告雕刻率从14%到100%不等，PDX建立率中位数为68%，后者与我们的发现13一致。根据文献，我们观察到胰腺的建立率低于结肠直肠癌PDX14。无论宿主小鼠菌株和肿瘤实体，人类的成长，爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）相关的B细胞淋巴瘤和穆林淋巴瘤在植入侧构成一个重要的陷阱15，16。如果不被识别，这种肿瘤可以"污染"随后的通道，从而混淆连续的结果。异常快速的 PDX 生长和肿胀的宫颈，轴突和淋巴结是穆林淋巴瘤生长的有力指标，但定期组理检查 PDX 仍然是可取的。此外，PDX 与相应的捐赠者患者之间的遗传协调性应通过 STR 分析定期测试。理想情况下，生物库应与包含患者特征（一般信息、生存、无复发生存、治疗、继发性肿瘤等）的临床数据库连接。由于隐私保护的法律法规和缺乏这样一个同名数据库，我们的临床数据集定期由合作医生手动管理和更新。
虽然传统的生物库仅限于天文台研究，但活生物库为体外和体内干预提供了机会。患者源性细胞系是基础研究、高通量药物筛选和新药剂评估的重要工具。然而，相应的PDX模型越来越重要，因为它们仔细回顾了原始肿瘤17、18的形态学，并在19、20几个段落中显示出很高的遗传稳定性。我们的PDX生物库已经证明自己是一个优秀的平台，为学前和基础研究6，21。此外，由于大型PDX集合充分反映了患者群体的个体间异质性，PDX临床试验（PCT）方法（每种治疗模式一种动物）对于药物开发非常重要，因为它允许忠实地预测对新药和组合方案8的临床反应。我们目前正在评估小型PCT试验中的新实验药物。
尽管有这些有希望的结果，中位建立持续时间为12.2个月，妨碍了PDX模型作为"头像小鼠"的临床适用性，以测试抗癌治疗方案，至少对于那些需要立即辅助甚至新辅助治疗的患者22。标准PDX模型的另一个缺点是由于宿主小鼠的免疫缺陷而缺乏免疫治疗测试的可用性。为了克服这些局限性，已经开发出几种"人性化"的鼠标菌株。这些小鼠免疫力强，但可以重组与各种类型的人类骨髓源性细胞或CD34+造血干细胞后，PDX生长23，允许评估淋巴细胞毒性和治疗反应免疫检查点抑制剂治疗24，25。
近年来，患者衍生的器官（PDO）成为与PDX竞争的重要癌症模型。这些三维结构来自完整的肿瘤片段，在细胞外基质脚手架中培养，密切反映了原始肿瘤的组织学和遗传特性。长期扩张和低温保存的可能性使PDO成为活生物库26，27的理想补充。除了建立率相对较高外，还报告了几个肿瘤实体28的PDO的可靠药物反应预测。此外，PDO甚至从循环肿瘤细胞中产生，同时从相应的健康组织建立器官也是可能的，允许在患者个人的基础上评估与治疗有关的毒性29，30。然而，与传统的2D细胞培养物相比，有机培养是耗时和资源的，人工细胞外基质化合物可以干扰某些分析程序31。此外，癌症器官容易过度生长，由更快的生长，非恶性器官衍生于健康的上皮30。由于缺乏频闪、血管和免疫细胞，PDOs大多不用于抗血管免疫治疗剂的测试。然而，新的培养方法允许肿瘤微环境在体外建模，使PDOs成为PDX模型32的真正竞争者。在不久的将来，患者-个体肿瘤模型，结合强大的基因工具，如下一代测序，有望铺平道路，真正的精密医学和量身定做的治疗方法。

近年来，对癌症的形态学、临床学和遗传特性积累的知识导致癌症被概念为一种异质的个体疾病。因此，除了临床和病理特征外，肿瘤的突变特征对临床决策也越来越重要，并为各种分子改变开发了许多靶向疗法。例如，通过对KRAS和PIK3CA突变状态1的分析，可以预测腹腔瘤在结肠直肠癌治疗中的疗效。精密医学旨在量身定做的方法，为每位患者提供最高的治疗反应，避免无能疗法的毒性。生物库含有癌症患者的组织、血液和其他生物材料，这些物质与临床数据相关联，因此是转化癌症研究的绝佳工具。由于大量的临床样本，生物库能够检测罕见但可能具有药物性的突变，这为个别患者提供了新的治疗机会。
为了尽可能广泛地涵盖肿瘤研究范围，我们并没有单独限制采集样本的活动，而是专注于建立患者衍生的癌细胞系和异种移植物（PDX）。传统的2D细胞系仍然是体外研究的角石，是大规模药物筛选4、5的主要选择。此外，细胞线分析往往更容易，更便宜，更容易获得。此外，由于患者衍生的外周血淋巴细胞（PBL）是可用的，肿瘤免疫学也可以研究体外6。然而，大多数新开发的药物在基于细胞体外或体内实验的细胞中具有有希望的临床前效应，在临床试验7中都显示出令人失望的结果。相比之下，基于PDX的临床前研究在体内研究中更忠实地反映了反塑性剂的临床活性。由于PDX组织密切反映供体肿瘤的组织学和分子特性，PDX模型是传播通常非常有限的存活肿瘤组织以保持生物库的完整性和允许研究组和机构之间交换样本的好方法。此外，从PDX组织中提取的癌细胞系比原发性癌细胞系9更容易建立。近年来，我们的工作组通过逐步标准化和优化所有有关生物样本的工作流程，建立了全面的结肠直肠癌和胰腺癌综合生物库（图1）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> 图1：生物库的工作流程和组织 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacillol&#174; AF; 1L</td>
			<td>Bode, Hartmann</td>
			<td>REF 973380</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 15ml; sterile</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>GBO Cat. No.:188271</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 50ml, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Order number: 62.547.254</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 20ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 300296</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Item number: 01.1601</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological Pipette 10ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 86.1254.001</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy ratiolab&#174; accupetta</td>
			<td>Ratiolab</td>
			<td>Item number: RL3200300</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>VWR Cat.No: 613-4438</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS; w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-36500</td>
			<td>washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll human</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-60500</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-41500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P40-47500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-80100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P10-023100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>VWR Cat.No: A3672.0250</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)</td>
			<td>selfmade</td>
			<td>---</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotube- CryoPure 2ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well cell culture plate; steril; with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>Cat.-No.: 657 160</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Cat. No.: 82.1472.001</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blades</td>
			<td>B.Braun (Aesculap)</td>
			<td>REF BB510</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309110</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer; yellow; 100&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF 352360</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>biocision</td>
			<td>Item number: 210004</td>
			<td>cooling container with -1&#176;C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar&#160;transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm</td>
			<td>KGW</td>
			<td>Cat. No.: HT39.1</td>
			<td>transport system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.760.002</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.762.411</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200&#181;l, yellow</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.082</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000&#181;l, blue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.120</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator&#160; BB 6220 CU</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat.-No.: 51012839</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating plate PR&#196;ZITHERM</td>
			<td>Harry Gestigkeit GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Zeiss Primo Vert</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>Serial number. 3842000839</td>
			<td>imaging cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench Safe flow 1.8 nunc</td>
			<td>nunc GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>---</td>
			<td>sterile working bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer -80&#176;C</td>
			<td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance MP-300</td>
			<td>Chyo</td>
			<td>---</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine, U100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 324826</td>
			<td>injection anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%; 25ml</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>approval number: 6293841.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td>
			<td>CP-Pharma GmbH</td>
			<td>approval number: 401650.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GES3S Reader</td>
			<td>Datamars</td>
			<td>not available</td>
			<td>RFID reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td>
			<td>Peddymark</td>
			<td>---</td>
			<td>RFID chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotrim-ratiopharm&#174;&#160;Ampullen SF 480&#160;mg/5&#160;ml</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>PZN-03928197</td>
			<td>antibiotic drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate #FM-20 42x28cm</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Electric Petra, Burgau</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>PZN-01578675</td>
			<td>Eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anatomical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD21 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD50 1 R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BC05 6R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle&#160;holder</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BH1 1 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>XN8870.P32</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opsite moisture vapour permable spray dressing</td>
			<td>Smith&#38;Nephew</td>
			<td>REF 66004978, PZN- 02063507</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aperture drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>REF 904622</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze swap Gazin&#174;; steril; 10x10 cm</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 18506</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raucotupf cotton tipped applicators</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 11969</td>
			<td>applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat.-No.: 354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>Item number: 18839</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#174; Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>Order No.:130-100-008</td>
			<td>storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formafix 4%</td>
			<td>Grimm med. Logistik GmbH</td>
			<td>Item number: F10010G</td>
			<td>fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software FreezerworksBasic</td>
			<td>Dataworks Development, Inc</td>
			<td>---</td>
			<td>sample organization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra TLP 2844 printer</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>---</td>
			<td>label printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation and maintenance of a living biobank - how we do it

鉴于人们对癌症的个体间特性和异质性的认识日益增长，新兴的个性化医学领域需要一个学前研究的平台。近年来，我们建立了由原发性肿瘤组织、正常组织、血清、分离外周血淋巴细胞（PBL）、患者衍生异种细胞（PDX）以及原发和继发性癌细胞系组成的结肠直肠癌和胰腺癌生物库。由于原肿瘤组织有限，原发性癌细胞系的建立率仍然较低，PDX不仅能够保存和扩展生物库，而且能够产生继发性癌细胞系。此外，PDX模型已被证明是用于前科药物测试的 体内 模型的理想之选。然而，生物银行需要精心准备，严格的指导方针和良好的调整基础设施。切除术、十二指肠切除术或再切除转移标本在切除后立即收集并转到病理科。尊重公正组织病理报告的优先顺序，由进行解剖的病理学家自行决定，收获小肿瘤块和非肿瘤组织。 
坏死部分被丢弃，剩余的肿瘤组织被切成小，相同的立方体和冷冻保存供以后使用。此外，肿瘤的一小部分被切碎和紧张的原发性癌细胞培养。此外，从患者术前和术后提取的血液样本经过处理，以获得血清和 PBL。对于PDX雕刻，冷冻保存标本被解冻，并皮下植入免疫缺陷小鼠的侧翼。由此产生的PDX仔细回顾"捐赠者"肿瘤的组织学，可用于后续的异种移植或冷冻保存，供以后使用。在以下工作中，我们描述了大肠癌和胰腺癌大型生物库的创建、维护和管理的各个步骤。此外，我们强调与生物银行相关的关键细节和警告。

在我们手中，初级细胞培养（图2A和B）的建立率是12.9%，在一个大系列9。由于缺乏生长或早期污染，从新的手术再切除标本中分离可扩展肿瘤细胞的大多数尝试都失败了。在标准培养条件下（DMEM、10%FCS、标准培养容器）和通过FACS分析10验证上皮分化的3段之后，细胞线的建立被认为是成功的。从PDX肿瘤（图2C&d）衍生的细胞系显示较高的建立率为23.6%，这也是由于重复尝试的可能性相比，原发性再切肿瘤9。然而，一些混合文化（图2E）无法摆脱纤维细胞生长，甚至因纤维细胞过度生长（图2F）而丧失。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> 图2：细胞培养。原发性癌细胞系，源自结肠癌病例HROC313的转移，第21段（A）和胰腺癌病例HROP88，第5段（B）。PDX衍生的结肠PDX HROC285 T0 M2（D）和胰腺PDX HROP10 T5 M2的癌细胞系，第4段（E）。胰腺癌HROP75、通道8（C）和纤维细胞过度生长（F）的成纤维细胞和癌细胞的混合培养。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
考虑到PDX生成协议的变化，使用小鼠菌株和实验者在几年内，以及可用于雕刻的肿瘤组织数量的巨大差异，给PDX生成的整体成功率是微不足道的。在最近由两位研究人员（S.M和F.B.）进行的一系列PDX生成实验中，观察到结肠直肠PDX（ 图3A中可以描绘出一种典型的组织学）和胰腺PDX（图3B）的原生生长率为63%。植入部位的穆林或人类淋巴瘤的生长相对罕见，但可以模仿成功的PDX生长（图3C）。除了组织病理检查外，PDX模型与其捐赠者患者之间的一致性也通过短串联重复（STR）分析（图3D）定期得到证实。时至今天，生物库包括>50个初级和>50个二级结直肠，3个初级和6个二级胰腺癌细胞系，以及>150结直肠和19个胰腺PDX模型。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> 图3：结肠直肠（A）和胰腺PDX（B）的代表性组织学比较。植入部位的人类淋巴瘤模仿PDX生长（C）。PDX 模型 （HROC430 T1 M2） 的遗传身份测试到原始患者肿瘤组织 （HROC430Tu） 通过短串联重复 （STR） 分析。在毛细纤维电泳确认PDX和供体肿瘤（D）的遗传一致性后，使用多路复用PCR的9个STR loci、vWA、THO1、TPOX、CSF1 PO（FAM染料）和D5S818、D13S317、D7S820、D16S539（HEX染料）与荧光标记引物进行比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>

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Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

在以下工作中，我们描述了建立结肠直肠癌和胰腺癌大型生物库所需的连续步骤。

活生物库的创建和维护 - 我们如何做到这一点

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

创建和维护一个活生生的生物库， 我们如何做到这一点。介绍。传统的生物库通常含有不可行的组织和血液样本。尽管充分反映了癌症患者群体的多样性，并允许进行遗传和组织学分析，但它们不适合临床前分析评估治疗策略。生物库集成了患者衍生的模型，克服了这些限制。从而实现精密医学的功能测试。样本采集。对于结肠直肠癌和胰腺癌的生物库，选择诊断证明良好且肿瘤大小充足的病例，必须告知患者的浓缩物。手术开始前，使用肝素化注射器抽取20毫升血液，并用血清单体注射7.5毫升。血清处理和 PBL 隔离。在1，128 RCF离心15分钟后，血清在四度被引用在预先标记的低温管中，并直接浸入液氮中。肝素化血液被转移到聚丙烯管中，用15ml PBS稀释。使用血清学移液器将混合物慢慢与 15ml Pancoll 混合。密度梯度离心后，含有单核细胞的不透明层被用血清移液器占用，并转移到新的PP管中。用PBS清洗后，通过离心清洗单核细胞，丢弃超核物，在冷冻介质中重新插入颗粒，并分配到预先标记的低温管中。将管子转移到适合每分钟一度缓慢冷冻的冷却容器中，并临时存放在 80 度。组织处理。外科医生一切除组织标本，就将其放入合适的容器中。避免在任何情况下，组织覆盖在形式素。尽快输送到肿瘤材料切除的病理学中，与切除边缘的病理评估无关。肿瘤片应尽可能处理。此外，获得健康组织的标本，并将两者放在冰上预加组织储存溶液的单独管中。立即返回实验室，在无菌条件下开始组织处理。组织片被放置在一个无菌塑料盘上，里面装满了组织储存溶液，以避免干燥。首先，根据获得的组织标本的大小，对一个或多个针头大小的碎片进行快速冷冻。将原生组织放入预先标记的低温管中，并立即浸入液氮中。将剩余的组织切成三乘三立方毫米的立方体。考虑到坏死组织必须完全解剖，但不应丢弃。将立方体排列为四倍，以确定重要存储的阿里报价数量。标记足够数量的低温管，并预填充它们与1.5毫升冰柜介质每个。由于冷冻介质中的DMSO是细胞毒性的，所以可以快速、不间断地执行后续步骤。使用手术刀刀片每管挖出四块组织件。确保所有部件完全浸入管底部的冰柜介质中，并使用冷冻容器快速冷冻管。以同样的方式进行健康标本。对于长期存储，将所有别名存储在液氮罐中。细胞培养。研磨肿瘤组织处理的残留物，包括尽可能小的手术刀片的坏死部分。将细胞过滤器放在无菌 PP 管的顶部，然后用血清移液器吸气悬架通过细胞过滤器。使用单次使用注射器的柱塞通过细胞过滤器按下组织残留物，以产生单个细胞悬架。用 PBS 冲洗并重复这些步骤，直到没有剩余材料。取出细胞过滤器，将悬架在 180 RCF 上离心7分钟。同时，准备一个胶原蛋白预涂层的六井板，具有不同的介质成分，以增加肿瘤生长的概率。丢弃超细剂，在PBS中补充颗粒，每口井分配500微升。之后，将盘子放在标准孵化器中。患者衍生的异种移植的生成。对于免疫功能低下的小鼠中患者衍生的异种移植物的生成，动物应保存在特定的无病原体环境中。佩戴由磨砂、围裙、面罩、护发罩和手套组成的个人防护装备。安排工作空间后，从液氮容器中取出欲望肿瘤标本。用 35ml PBS 填充新鲜的 PP 管，然后小心地清洗解冻过程，向上和向下倾斜冷冻管。一旦内容变得泥泞，倒入PBS和冲洗肿瘤片。丢弃大部分 PBS 并将立方体倒入盖子中。将无菌塑料盘放在冰袋上，并加入100微升矩阵。使用钳子将肿瘤片放在母体中，并孵育肿瘤10分钟。同时，麻醉两只老鼠。捏住动物的脚来检查麻醉的深度。任何运动都表示麻醉不足，需要等待或补充剂。涂上眼药膏，捏住老鼠的脖子，皮下注射微芯片。并行执行以下步骤。对老鼠的侧翼进行消毒，用条纹梅森鲍姆剪刀做一个小皮肤切口，并通过钝制剂形成皮下口袋。使用解剖钳插入肿瘤片。确保该件放在皮肤口袋的后端。吸气剩余的马特里格尔，并平等地分配给所有四个口袋。等待凝胶的固化，用单个按钮缝合关闭皮肤，而不会用针头损坏肿瘤片。在结上方尽可能缩短螺纹，并涂抹喷雾敷料以防止缝合线的结。扫描微芯片，并将肿瘤信息添加到数据库中，以便以后识别动物。准备一个笼子与新鲜的床上用品和筑巢材料，把老鼠放在红外灯前，并监测动物，直到麻醉消退。PDX 的去除。PDX肿瘤达到规定大小后，小鼠通过二氧化碳窒息和随后的宫颈错位进行安乐死。仔细解剖肿瘤的皮肤，并完全切除PDX。代表性结果。将肿瘤放在无菌塑料盘上，使用无菌手术刀片进行进一步加工。用切片切开孔，放入病理学盒中，并浸入形式素中，生成石蜡嵌入标本，以便日后进行组学评估。将肿瘤的其余部分转移到组织储存溶液中，为生物库创建新的重要保存和捕捉冷冻标本。此外，使用类似于章细胞培养的PDX肿瘤的残留物来建立继发性肿瘤细胞系。为了生成进一步的PDX，将两个或两个以上的肿瘤片段与Matrigel转移到一个新的接收鼠标，如前所示。结论。通过介绍的协议，我们迄今已建立了9个胰腺和100多个结肠直肠患者衍生的癌细胞系，以及19个胰腺和150多个结肠直肠PDX模型。

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