Name: creation and maintenance of a living biobank - how we do it
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
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Nous reconnaissons volontiers Jenny Burmeister, notre assistante graphique, pour l'enregistrement et le montage de la vidéo. En outre, nous remercions nos collègues du département chirurgical et pathologique pour la collaboration de longue date. Nous tenons également à remercier Marcus Müller, directeur de production du Centre informatique et des médias de l'Université de Rostock, d'avoir fourni l'équipement d'enregistrement audio et d'avoir affiné la qualité sonore.
FINANCEMENT : La Fondation allemande d'aide au cancer (DKH e.V.), le numéro de subvention 108446 et le numéro de subvention TBI-V-1-241-VBW-084 de l'État du Mecklembourg-Vorpommern ont financé en partie cette recherche.

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La génération d'une biobanque vivante présuppose, outre le respect des réglementations légales en matière de vie privée, de droit médical et de bien-être animal, une bonne infrastructure et une équipe bien coordonnée. Il s'est avéré avantageux d'impliquer directement une partie du personnel chirurgical dans les procédures de recherche, car ils peuvent très bien évaluer l'adéquation du patient individuel pour le don de tissus. En outre, les patients ont tendance à consentir avec le biobanque plus fréquemment, lorsque leur approbation écrite est obtenue dans le cadre de la discussion sur le consentement éclairé chirurgical. Pour gagner du temps et des ressources, les cas qui donneront vraisemblablement des quantités insuffisantes de tissu tumoral ne devraient pas être sélectionnés pour le biobancaire. Quand il s'agit de l'acquisition de spécimens, la maxime « la communication est la clé » est une vérité simple, mais souvent négligée. Il suffit d'une seule infirmière de théâtre ou d'un collègue chirurgical non informé pour ruiner le spécimen dès le départ en procédant comme d'habitude et en ajoutant du formaldéhyde à l'échantillon de résection. Par conséquent, il est absolument crucial que chaque membre du personnel concerné se familiarise avec le SOP pour la biobanque. Les chirurgiens devraient être remarqués la veille et dès le début de l'intervention au sujet de la collecte prévue des tissus. De plus, les cas sélectionnés pour le biobanque devraient être mis en évidence dans le plan électronique de la SA. La récolte des tissus de l'échantillon chirurgical doit être effectuée par un pathologiste. Tout d'abord, cela permettra de s'assurer que la récolte des tissus n'interfère pas avec le rapport pathologique final. Deuxièmement, cela augmente la probabilité de recevoir des tissus avec des quantités suffisantes de tissu cancéreux viable. Particulièrement dans les cancers pancréatiques avec une réaction desmoplastic prononcée et les secteurs nécrotiques fréquents, les parties viables sont difficiles à identifier macroscopically pour l'oeil non formé. À titre d'exception à cette règle, les blocs tissulaires provenant de grandes métastases hépatiques ou pulmonales peuvent parfois être excisés « table arrière » par le chirurgien, si les marges chirurgicales peuvent être définies macroscopiquement. Le cancer rectal réséqué par excision mésorectale totale (TME), pourrait ne pas convenir au biobancaire, puisque la récolte de tissu du spécimen réséqué avant l'intégration de paraffine pourrait interférer avec l'évaluation de qualité de TME. Alternativement, le tissu pour le biobancaire peut être acquis par biopsie transanale du cancer rectal.
Les taux d'établissement pour les cultures de cellules primaires dérivées de la tumeur originale sont généralement faibles. Les cultures cellulaires secondaires dérivées du PDX peuvent plus probablement être établies avec succès. Nous recommandons l'essai de différents médias pour chaque cas et l'utilisation des suppléments antibiotiques pour les premiers passages pour réduire la contamination au minimum puisque le tissu récolté est rarement stérile. Après propagation réussie, chaque lignée cellulaire individuelle doit être confirmée comme lignée de cellules cancéreuses par analyse FACS et régulièrement testée pour la contamination par le mycoplasma. Pour exclure la contamination croisée, une analyse régulière de str est conseillée. Il convient de noter que le protocole d'établissement des lignées cellulaires primaires et secondaires est constamment soumis à l'optimisation. Les détails concernant la composition et les taux de réussite des médias simples dépassent clairement le cadre de ce travail et seront publiés séparément.
Pour l'engraftment de PDX, le tissu de tumeur peut être implanté directement après résection ou cryopréservé dans le sérum foetal de calve avec 10% DMSO ou médias semblables de congélation pour l'implantation retardée. L'implantation immédiatement après la récolte de tissu de tumeur met une contrainte sur la logistique et le personnel de laboratoire, et les résultats de xénogreffe après cryopreservation ne sont pas inférieurs du tout 10. En outre, l'incubation du tissu dans Matrigel avant l'implantation de tumeur, augmente de manière significative des taux d'engraftment12. Nous recommandons l'engraftment retardé suivant la conclusion pathologique définie et l'élimination immédiate des spécimens erronément rassemblés de tissu. Puisque le taux de succès de l'engraftment primaire augmente avec l'immunodéficience de la souris destinataire, nous avons tendance à employer des souris de NSG pour le tout premier passage de PDX. Après le premier engraftment réussi de PDX, les sourisnu/nu de NMRI peuvent et devraient être employées pour les passages suivants et l'expansion de tissu. Cette souche est plus robuste, moins chère et plus facile à reproduire par rapport au NSG ou à des souches immunodéficientes similaires, mais montre toujours des taux d'engreffe raisonnables. En outre, sa nudité facilite l'implantation et la surveillance de la croissance tumorale. Pour augmenter les taux d'engraftment dans les passages suivants, nous recommandons le transfert direct des tissus pdx fraîchement récoltés aux souris hôtes chaque fois que possible, particulièrement pour le PDX à croissance lente et les cas avec un taux primaire bas de succès d'engraftment. Collins et Lang ont récemment passé en revue 14 études de l'établissement côlorectal de PDX et ont rapporté des taux d'engraftment variant de 14 à 100% avec un taux médian d'établissement de PDX de 68%, ce dernier étant compatible avec nos résultats13. Conformément à la littérature, nous avons observé des taux d'établissement plus faibles de pancréas par rapport au cancer colorectal PDX14. Indépendamment de la souche de souris hôte et de l'entité tumorale, la croissance des lymphomes à cellules B et des lymphomes murins associés au virus d'Epstein-Barr (EBV) du côté de l'implantation pose un piège important15,16. Si elles ne sont pas reconnues, ces tumeurs peuvent « contaminer » les passages ultérieurs et ainsi confondre les résultats consécutifs. La croissance rapide peu commune de PDX et le gonflement des ganglions lymphatiques cervicaux, axillaires et inguinaux sont des indicateurs forts de la croissance de lymphome murine, mais l'examen histologique régulier de PDX est néanmoins conseillé. En outre, la concordance génétique entre PDX et le patient donneur correspondant devrait être testée régulièrement par analyse STR. Idéalement, la biobanque devrait être liée à une base de données clinique comprenant les caractéristiques des patients (information générale, survie, survie sans rechute, thérapie, néoplasie secondaire, etc.). En raison des réglementations légales en matière de protection de la vie privée et de l'absence d'une telle base de données anonymisée, notre ensemble de données cliniques est régulièrement administré et mis à jour manuellement par les médecins coopérants.
Alors que les biobanques conventionnelles se limitent à la recherche en observatoire, une biobanque vivante offre la possibilité d'interventions in vitro et in vivo. Les lignées cellulaires dérivées du patient sont un outil important pour la recherche fondamentale, les dépistages de médicaments à haut débit et l'évaluation de nouveaux agentspharmaceutiques 4. Les modèles pdx correspondants, cependant, sont d'une importance croissante, puisqu'ils récapitulent étroitement l'histologie de la tumeuroriginale 17,18 et montrent une stabilité génétique élevée sur plusieurs passages19,20. Notre biobanque PDX a fait ses preuves en tant qu'excellente plate-forme pour la recherchepréclinique et fondamentale 6,21. De plus, étant donné que les grandes collections pdx reflètent adéquatement l'hétérogénéité interindéterminée de la population de patients, l'approche de l'essai clinique PDX (PCT) (un animal par modèle par traitement) a gagné en importance pour le développement de médicaments puisqu'elle permet la prédiction fidèle de la réponse clinique aux nouveaux médicaments et au régime combinatoire8. Nous évaluons également actuellement de nouveaux médicaments expérimentaux dans le cas de petits essais sur le PCT.
En dépit de ces résultats prometteurs, la durée médiane d'établissement de 12.2 mois, empêche l'applicabilité clinique des modèles de PDX en tant que « souris d'avatar » pour tester des options de traitement anticancéreux, au moins pour ces patients ayant besoin du traitement immédiat d'adjuvant ou même de neoadjuvant22. Un autre inconvénient des modèles PDX standard est le manque d'utilisabilité pour les tests d'immunothérapie en raison de l'immunodéficience des souris hôtes. Pour surmonter ces limitations, plusieurs souches de souris « humanisées » ont été développées. Ces souris sont fortement immunocompromised, mais peuvent être reconstituées avec divers types de cellules humaines dérivées de moelle ou CD34+ cellules souches hématopoïétiques suivant la excroissance de PDX23,permettant l'évaluation de la cytotoxicité lymphocyte-médiée et de la réponse de thérapie au traitement immunitaire d'inhibiteur de pointde contrôle 24,25.
Au cours des dernières années, les organoïdes d'origine patiente (AOP) sont apparus comme d'importants modèles de cancer en concurrence avec pdx. Dérivées des morceaux intacts de tumeur et cultivés dans un échafaudage extracellulaire de matrice, ces structures tridimensionnelles reflètent étroitement les propriétés histologiques et génétiques de la tumeur originale. La possibilité d'expansion et de cryopréservation à long terme fait de l'AOP un complément idéal d'une biobanquevivante 26,27. En plus d'un taux relativement élevé d'établissement, la prévision fiable de réponse de drogue a été rapportée pour AOP de plusieurs entités detumeur 28. En outre, des PDOs ont même été générés à partir des cellules tumorales circulantes et également l'établissement simultané des organoïdes du tissu sain correspondant est possible, permettant l'évaluation de la toxicité thérapie-connexe sur une basepatient-individu 29,30. Cependant, comparé aux cultures conventionnelles de cellules 2D, la culture organoïde prend du temps et les composés matriciels extracellulaires artificiels peuvent interférer avec certaines procéduresanalytiques 31. En outre, les organoïdes du cancer sont sensibles à la surcroissance par des organoïdes non malins à croissance plus rapide dérivés de l'épithéliumsain 30. En raison d'un manque de stroma, de vaisseaux sanguins et de cellules immunitaires, les PPO sont pour la plupart inapplicables pour l'essai des agents immunothérapeutiques antiangiogéniques. Pourtant, de nouvelles méthodes de culture permettent la modélisation du microenvironnement tumoral in vitro, faisantdes PDA un véritable concurrent pour les modèles PDX32. Dans un proche avenir, les modèles tumoraux patients-individuels, combinés à de puissants outils génétiques comme le séquençage de prochaine génération, ouvriront, espérons-le, la voie vers une véritable médecine de précision et des approches de traitement sur mesure.

Au cours des dernières années, les connaissances accumulées sur les propriétés morphologiques, cliniques et génétiques des cancers ont mené à la conception du cancer comme une maladie hétérogène et individuelle. Par conséquent, la caractérisation mutationnelle des néoplasmes, outre les caractéristiques cliniques et pathologiques, a gagné en importance pour la prise de décision clinique et de nombreuses thérapies ciblées ont été développées pour diverses altérations moléculaires. Par exemple, l'efficacité du cétuximab dans le traitement du cancer colorectal peut être prédite par l'analyse du statut mutationnel KRAS et PIK3CA 1. La médecine de précision vise une approche sur mesure pour fournir la réponse de traitement la plus élevée chez chaque patient et éviter la toxicité des thérapies inefficaces2. Les biobanques contiennent des tissus, du sang et d'autres matériaux biologiques des patients atteints de cancer, qui sont liés aux données cliniques, et sont donc un excellent outil pour la recherche translationnelle sur le cancer. En raison du grand nombre d'échantillons cliniques, les biobanques permettent la détection de mutations rares, mais potentiellement médicamentables, qui offrent de nouvelles possibilités de traitement pour le patientindividuel 3.
Pour couvrir un spectre de recherche oncologique aussi large que possible, nous n'avons pas limité notre activité sur la seule récolte d'échantillons, mais nous nous sommes concentrés sur l'établissement de lignées cellulaires cancéreuses et de xénogreffes dérivées du patient (PDX). Les lignées cellulaires 2D traditionnelles demeurent la pierre angulaire de la recherche in vitro et sont le premier choix pour les dépistages de médicaments à grande échelle4,5. De plus, l'analyse des lignées cellulaires est souvent plus facile, moins coûteuse et plus facilement accessible. En outre, puisque les lymphocytes périphériques de sang patients-dérivés (PBL) sont disponibles, l'immunologie de tumeur peut également être étudiée in vitro6. Cependant, la majorité des médicaments nouvellement développés avec l'effectivité préclinique prometteuse dans les expériences in vitro ou in vivo basées sur la cellule, ont montré des résultats décevants dans les essais cliniques7. En revanche, les études précliniques basées sur des études in vivo de PDX ont reflété l'activité clinique des agents antineoplastic beaucoup plusfidèlement 8. Puisque le tissu pdx reflète étroitement les propriétés histologiques et moléculaires de la tumeur donneuse, les modèles pdx sont un bon moyen de propager les quantités souvent très limitées de tissu tumoral viable pour maintenir l'intégrité d'une biobanque et permettre l'échange d'échantillons entre les groupes de recherche et les institutions. En outre, les lignées de cellules cancéreuses dérivées du tissu PDX peuvent être établies significativement plus facilement que les lignées primaires de cellules cancéreuses9. Au cours des dernières années, notre groupe de travail a mis sur pied une biobanque intégrée complète contre le cancer colorectal et pancréatique en normalisant et en optimisant par étapes le flux de travail de tous les échantillons biologiques en question (figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> Figure 1 :Flux de travail et organisation de la biobanque <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacillol&#174; AF; 1L</td>
			<td>Bode, Hartmann</td>
			<td>REF 973380</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 15ml; sterile</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>GBO Cat. No.:188271</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 50ml, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Order number: 62.547.254</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 20ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 300296</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Item number: 01.1601</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological Pipette 10ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 86.1254.001</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy ratiolab&#174; accupetta</td>
			<td>Ratiolab</td>
			<td>Item number: RL3200300</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>VWR Cat.No: 613-4438</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS; w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-36500</td>
			<td>washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll human</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-60500</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-41500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P40-47500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-80100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P10-023100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>VWR Cat.No: A3672.0250</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)</td>
			<td>selfmade</td>
			<td>---</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotube- CryoPure 2ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well cell culture plate; steril; with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>Cat.-No.: 657 160</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Cat. No.: 82.1472.001</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blades</td>
			<td>B.Braun (Aesculap)</td>
			<td>REF BB510</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309110</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer; yellow; 100&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF 352360</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>biocision</td>
			<td>Item number: 210004</td>
			<td>cooling container with -1&#176;C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar&#160;transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm</td>
			<td>KGW</td>
			<td>Cat. No.: HT39.1</td>
			<td>transport system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.760.002</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.762.411</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200&#181;l, yellow</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.082</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000&#181;l, blue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.120</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator&#160; BB 6220 CU</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat.-No.: 51012839</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating plate PR&#196;ZITHERM</td>
			<td>Harry Gestigkeit GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Zeiss Primo Vert</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>Serial number. 3842000839</td>
			<td>imaging cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench Safe flow 1.8 nunc</td>
			<td>nunc GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>---</td>
			<td>sterile working bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer -80&#176;C</td>
			<td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance MP-300</td>
			<td>Chyo</td>
			<td>---</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine, U100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 324826</td>
			<td>injection anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%; 25ml</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>approval number: 6293841.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td>
			<td>CP-Pharma GmbH</td>
			<td>approval number: 401650.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GES3S Reader</td>
			<td>Datamars</td>
			<td>not available</td>
			<td>RFID reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td>
			<td>Peddymark</td>
			<td>---</td>
			<td>RFID chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotrim-ratiopharm&#174;&#160;Ampullen SF 480&#160;mg/5&#160;ml</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>PZN-03928197</td>
			<td>antibiotic drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate #FM-20 42x28cm</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Electric Petra, Burgau</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>PZN-01578675</td>
			<td>Eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anatomical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD21 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD50 1 R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BC05 6R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle&#160;holder</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BH1 1 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>XN8870.P32</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opsite moisture vapour permable spray dressing</td>
			<td>Smith&#38;Nephew</td>
			<td>REF 66004978, PZN- 02063507</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aperture drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>REF 904622</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze swap Gazin&#174;; steril; 10x10 cm</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 18506</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raucotupf cotton tipped applicators</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 11969</td>
			<td>applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat.-No.: 354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>Item number: 18839</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#174; Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>Order No.:130-100-008</td>
			<td>storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formafix 4%</td>
			<td>Grimm med. Logistik GmbH</td>
			<td>Item number: F10010G</td>
			<td>fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software FreezerworksBasic</td>
			<td>Dataworks Development, Inc</td>
			<td>---</td>
			<td>sample organization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra TLP 2844 printer</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>---</td>
			<td>label printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation and maintenance of a living biobank - how we do it

À la lumière des connaissances croissantes sur les propriétés inter-individuelles et l'hétérogénéité des cancers, le domaine émergent de la médecine personnalisée nécessite une plate-forme pour la recherche préclinique. Au cours des dernières années, nous avons établi une biobanque de cancers colorectaux et pancréatiques comprenant des tissus tumoraux primaires, des tissus normaux, du sera, des lymphocytes sanguins périphériques isolés (PBL), des xénogreffes dérivées du patient (PDX), ainsi que des lignées cellulaires cancéreuses primaires et secondaires. Puisque le tissu tumoral original est limité et le taux d'établissement des lignes primaires de cellules cancéreuses est encore relativement bas, PDX permettent non seulement la conservation et l'extension de la biobanque mais également la génération des lignes secondaires de cellules cancéreuses. En outre, les modèles PDX se sont avérés être le modèle in vivo idéal pour le dépistage préclinique des médicaments. Toutefois, le biobanque nécessite une préparation minutieuse, des lignes directrices strictes et une infrastructure bien adaptée. Des spécimens de colectomy, de duodenopancreatectomy ou de métastases réséqués sont rassemblés immédiatement après résection et transférés au département de pathologie. Respectant la priorité d'un rapport histopathologique impartial, à la discrétion du pathologiste traitant qui effectue les dissections, de petits morceaux de tumeur et des tissus non tumoraux sont récoltés. 
Les parties nécrotiques sont jetées et le tissu tumoral restant est coupé en petits cubes identiques et cryopréservé pour une utilisation ultérieure. En outre, une petite partie de la tumeur est hachée et tendue pour la culture primaire de cellules cancéreuses. En outre, des échantillons de sang prélevés sur le patient avant et postopératoirement, sont traités pour obtenir le sérum et les PBLs. Pour l'engraftment PDX, les spécimens cryopréservés sont décongelés et implantés sous-cutanément sur les flancs de souris immunodéficientes. Le PDX résultant récapitule étroitement l'histologie des tumeurs « de donateur » et peut être employé pour la xénogreffe suivante ou cryopréserved pour l'usage ultérieur. Dans les travaux suivants, nous décrivons les différentes étapes de la création, de l'entretien et de l'administration d'une grande biobanque de cancer colorectal et pancréatique. En outre, nous soulignons les détails cruciaux et les mises en garde associés au biobanque.

Entre nos mains, le taux d'établissement des cultures de cellules primaires (Figure 2A & B) était de 12,9% dans une grande série9. La majorité des tentatives d'isoler les cellules tumorales extensibles des spécimens réséqués chirurgicaux frais ont échoué en raison d'un manque d'excroissance ou d'une contamination précoce. L'établissement de la lignée cellulaire a été considéré comme réussi après 3 passages avec une croissance régulière dans des conditions de culture standard (DMEM, 10% FCS, vaisseau de culture standard) et la validation de la différenciation épithéliale via FACS-analyse10. Les lignées cellulaires dérivées de tumeurs PDX (Figure 2C & D) ont montré un taux d'établissement plus élevé de 23,6%, ce qui est également dû à la possibilité de tentatives répétitives contrairement aux tumeurs primaires réséquées9. Toutefois, certaines cultures mixtes (figure 2E) ne peuvent pas être libérées de la croissance fibroblastique ou sont même perdues en raison de la prolifération fibroblastique (Figure 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> Figure 2: Culture cellulaire. Lignées primaires de cellules cancéreuses, dérivées d'une métastase du cas de cancer du côlon HROC313, passage 21 (A) et cas de cancer pancréatique HROP88, passage 5 (B). Lignées de cellules cancéreuses dérivées du PDX du côlon PDX HROC285 T0 M2 (D) et pancréatiques PDX HROP10 T5 M2, passage 4 (E). Culture mixte des fibroblastes et des cellules cancéreuses du cancer du pancréas HROP75, passage 8 (C) et surcroissance fibroblastique (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Compte tenu des changements dans le protocole de génération PDX, souches de souris utilisées et aussi expérimentateurs sur plusieurs années, ainsi que de grandes différences dans la quantité de tissu tumoral disponible pour l'engraftment, il n'est pas trivial de donner le taux de réussite global de la génération PDX. Dans une série très récente d'expériences de génération PDX réalisées par deux chercheurs (S.M. et F.B.), des taux de croissance primaire de 63 % pour le PDX colorectal (une histologie exemplaire peut être représentée à partir de la figure 3A)et de 48 % pour le PDX pancréatique(figure 3B)ont été observés. L'repousse des lymphomes murins ou humains au site d'implantation est relativement rare, mais peut imiter la croissance réussie de PDX (figure 3C). Outre l'examen histopathologique, la concordance entre les modèles PDX et leurs patients donneurs a été régulièrement confirmée par une courte analyse de répétition en tandem (STR) (Figure 3D). À ce jour, la biobanque comprend >50 lignées primaires et >50 lignées de cellules cancéreuses pancréatiques primaires et 6 lignées cellulaires pancréatiques secondaires ainsi que des modèles pdx >150 colorectal et 19 modèles pdx pancréatiques.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> Figure 3: Comparaison histologique représentative du PDX colorectal (A) et pancréatique (B). Lymphome humain au site d'implantation imitant la croissance de PDX (C). Test d'identité génétique d'un modèle PDX (HROC430 T1 M2) au tissu tumoral patient d'origine (HROC430Tu) par courte répétition en tandem (STR) analyse. Comparaison des neuf loci STR, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (colorant FAM) et D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (colorant HEX) utilisant le multiplex PCR avec amorce fluorescente-étiquetée suivant l'électrophoresis capillaire a confirmé la concordance génétique de la PDX et de la tumeur donneuse (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

Dans les travaux suivants, nous décrivons les étapes consécutives nécessaires à l'établissement d'une grande biobanque de cancer colorectal et pancréatique.

Création et entretien d&apos;une biobanque vivante - Comment nous le faisons

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Création et entretien d’une biobanque vivante comment nous le faisons. Introduction. Les biobanques traditionnelles contiennent généralement des échantillons de tissus et de sang non viables. Bien qu’ils reflètent adéquatement la diversité des populations de patients atteints de cancer et qu’ils permettent des analyses génétiques et histologiques, ils ne conviennent pas aux essais précliniques évaluant les stratégies thérapeutiques.Une biobanque intégrant également des modèles dérivés du patient surmonte ces limitations. Permettant ainsi des tests fonctionnels pour la médecine de précision. Exemple d’acquisition.Pour le biobancaire du cancer colorectal et pancréatique, élire des cas avec le diagnostic prouvé aussi bien que la taille suffisante de tumeur, concent informé du patient est obligatoire. Avant le début de la chirurgie, tirer 20ml de sang à l’aide d’une seringue héparinée et 7,5ml supplémentaires avec une monovette sérique. Traitement sérique et isolement PBL.Après centrifugation à 1 128 RCF pendant 15 minutes à quatre degrés, le sérum est aliquoted dans un cryotube pré-étiqueté et directement immergé dans de l’azote liquide. Le sang héparinisé est transféré dans un tube de polypropylène et dilué avec 15ml de PBS. Utilisez une pipette sérologique pour sous-coucher lentement le mélange avec 15ml Pancoll.Après centrifugation du gradient de densité, la couche opaque contenant les cellules mononucléaires est prise avec une pipette sérologique et transférée dans un nouveau tube PP. Après lavage avec PBS et pelletage des cellules mononucléaires par centrifugation, jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans le milieu du congélateur et distribuer dans des cryotubes pré-étiquetés. Transférer les tubes dans un récipient de refroidissement adapté au gel lent avec un degré par minute et conserver temporairement à 80 degrés.Traitement des tissus. Dès que le spécimen de tissu est réséqué par le chirurgien, mettez-le dans un récipient approprié. Évitez en toutes circonstances que le tissu soit recouvert de formaline.Transport aussi vite que possible à la pathologie pour l’excision du matériel de tumeur non pertinent pour l’évaluation pathologique des marges de résection. La pièce tumorale doit être manipulée aussi aseptique que possible. En outre, obtenir un spécimen de tissu sain et placer les deux dans des tubes séparés pré-remplis avec la solution de stockage des tissus sur la glace.Retournez immédiatement au laboratoire pour commencer le traitement des tissus dans des conditions stériles. Le morceau de tissu est placé sur un plat en plastique stérile rempli de solution de stockage des tissus pour éviter la dessiccation. Tout d’abord, exciser une ou plusieurs pièces de la taille d’une tête d’épingle pour obtenir une congélation en fonction de la taille de l’échantillon de tissu obtenu.Placez le tissu indigène dans des cryotubes pré-étiquetés et plongez immédiatement dans de l’azote liquide. Couper le reste du tissu en cubes de trois par trois par trois millimètres cubes. Tenir compte du fait que les tissus nécrotiques doivent être complètement disséqués, mais ne doivent pas être jetés.Disposer les cubes en quadruplés pour déterminer le nombre d’aliquots pour le stockage vital. Étiquetez un nombre suffisant de cryotubes et remplissez-les à l’œlire d’un milieu de congélation de 1,5 ml chacun. Puisque le DMSO dans le milieu de congélateur est cytotoxique, a exécuté les étapes suivantes rapidement et sans interruption.Utilisez une lame de scalpel pour ramasser quatre morceaux de tissu par tube. Assurez-vous que tous les morceaux sont complètement immergés dans le congélateur moyen idéalement au fond du tube et congelez rapidement les tubes à l’aide d’un contenant de congélation. Procéder de la même manière avec le spécimen sain.Pour le stockage à long terme, conserver tous les aliquotes dans un réservoir d’azote liquide. Culture cellulaire. Moudre les restes du traitement des tissus tumoraux, y compris les parties nécrotiques avec les lames de scalpel aussi petit que possible.Placez une passoire cellulaire au sommet d’un tube PP stérilisé et aspirez la suspension avec une pipette sérologique pour passer à travers la passoire cellulaire. Utilisez le piston d’une seringue à usage unique pour appuyer sur les restes de tissu à travers la passoire cellulaire pour générer une suspension cellulaire unique. Rincer à l’aide de PBS et répéter ces étapes jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de matériau.Retirer la passoire cellulaire et centrifuger la suspension à 180 RCF pendant sept minutes. En attendant, préparez une plaque pré-enduite de collagène de six puits avec différentes compositions de médias pour augmenter la probabilité de croissance de tumeur. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans PBS et distribuez 500 microlitres par puits.Ensuite, placez la plaque dans un incubateur standard. Génération de xénogreffe dérivée du patient. Pour la génération de xénogreffes dérivées du patient chez les souris immunocompromisées, les animaux doivent être gardés dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes.Portez de l’équipement de protection individuelle composé de gommages, tablier, masque facial, housse de cheveux et gants. Après avoir organisé votre espace de travail, prenez le spécimen de tumeur de désir du récipient liquide d’azote. Remplissez un tube PP frais avec 35ml PBS puis lavez soigneusement le processus de décongélation et inclinez le tube cryo de haut en bas.Dès que le contenu devient slushy, versé dans le PBS et rincer les morceaux de tumeur. Jeter la majorité du PBS et vider les cubes dans le couvercle. Déposer un plat en plastique stérile sur un sac de glace et ajouter une gouttelette de 100 microlitres Matrigel.Utilisez des forceps pour placer les morceaux de tumeur dans le Matrigel et incuber la tumeur pendant 10 minutes. En attendant, anesthésier deux souris. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant le pied de l’animal.Tout mouvement indique une anesthésie insuffisante et nécessite soit une certaine attente ou un dosage supplémentaire. Appliquer l’onguent pour les yeux, pincer la souris par le cou et injecter une micropuce sous-cutanée. Effectuez les étapes suivantes en parallèle.Désinfecter les flancs des souris et faire une petite incision cutanée avec des ciseaux Metzenbaum rayé et former une poche sous-cutanée par préparation émoussée. Utilisez des forceps anatomiques pour insérer les morceaux de tumeur. Assurez-vous que la pièce est placée à l’arrière de la poche de la peau.Aspirer le Matrigel restant et répartir également dans les quatre poches. Attendez le durcissement du gel et fermez la peau avec des sutures à bouton unique sans endommager les morceaux de tumeur avec l’aiguille. Couper le fil aussi court que possible au-dessus du nœud et appliquer un pansement de pulvérisation pour empêcher l’exaison des sutures.Scannez la puce et ajoutez l’information sur la tumeur à la base de données pour une identification ultérieure de l’animal. Préparer une cage avec de la literie fraîche et du matériel de nidification, placer les souris devant une lampe infrarouge et surveiller l’animal jusqu’à ce que l’anesthésie se soit calmée. Explantation de PDX.Après que la tumeur de PDX ait atteint la taille exigée, la souris est euthanasiée par asphyxie de CO2 et dislocation cervicale suivante. Disséquer soigneusement la peau de la tumeur et enlever complètement le PDX. Résultats représentatifs.Placez une tumeur sur un plat en plastique stérile et utilisez des lames stériles de scalpel pour un traitement ultérieur. Couper le trou avec les tranches, les placer dans une cassette d’histologie et plonger dans la formaline pour générer de la paraffine spécimen incorporé pour l’évaluation histologique à un moment ultérieur. Transférer le reste de la tumeur à la solution de stockage des tissus et de créer de nouveaux spécimens congelés conservés de façon vitale et snap pour la biobanque.En outre, utilisez les restes de la tumeur pdx analogue à la culture cellulaire chapitre pour établir des lignées cellulaires tumorales secondaires. Pour générer d’autres PDX, transférez deux morceaux de tumeur ou plus avec Matrigel à une nouvelle souris destinataire comme indiqué précédemment. conclusion. Au moyen du protocole présenté, nous avons jusqu’ici réussi à établir neuf lignées pancréatiques et plus de 100 lignées côlorectals de cellules cancéreuses patient-dérivées, aussi bien que 19 modèles pancréatiques et plus de 150 modèles côlorectaux de PDX.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Comment étudier la membrane basale Rigidité comme Biophysical Trigger dans le cancer de la prostate et d&#39;autres pathologies liées à l&#39;âge ou les maladies métaboliques

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Développement et maintenance d&#39;une tumeur du patient Préclinique dérivé modèle de xénogreffe de l&#39;enquête de Novel Anti-Cancer Therapies

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Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Établissement et analyse des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés des spécimens de métastasie osseuse du cancer de la prostate du patient et de leurs Xénogreffes

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Techniques moléculaires et immunologiques dans un modèle murin génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...