Name: creation and maintenance of a living biobank - how we do it
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

אנו מודים בחביבות לג'ני בורמייסטר, העוזרת הגרפית שלנו, על ההקלטה והעריכה של הסרטון. בנוסף, אנו מודים לעמיתינו במחלקה הכירורגית והפתולוגית על שיתוף הפעולה ארוך השנים. ברצוננו גם להודות למרקוס מולר, מנהל ההפקה של מרכז ה- IT והמדיה, אוניברסיטת רוסטוק, על אספקת ציוד הקלטת השמע וזיקוק איכות הצליל.
מימון מימון: הקרן הגרמנית לסיוע לסרטן (DKH e.V.), מענק מספר 108446, ומספר המענק TBI-V-1-241-VBW-084 מהמדינה מקלנבורג-וורפומרן מימנו חלקית מחקר זה.

<ol>
	<li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies.">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies.">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer.">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li><li>Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+bacterial-immunotherapy+with+therapeutic+antibodies:+a+novel+therapeutic+concept.">Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept.</a> Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).</li><li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs.">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research.">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li><li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn's+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft.">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671 (2016).</li><li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts:+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features.">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li><li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models.">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).</li><li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+(PDX)+models:+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine.">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981 (2018).</li><li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research:+a+systematic+review.">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice.">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts:+a+potential+pitfall.">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li><li>Prall, F., Maletzki, C., H&#252;hns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment.">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).</li><li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability.">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li><li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics.">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), 1138-1150 (2013).</li><li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors.">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li><li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype.">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).</li><li>Katsiampoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+Patient-Derived+Xenografts+in+Colorectal+Cancer.">Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).</li><li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy.">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li><li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+model+supports+development,+function,+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells.">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li><li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts.">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Abe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+phosphoproteomic+analysis+for+phosphosignaling+and+active-kinome+profiling+in+Matrigel-embedded+spheroids+and+patient-derived+organoids.">Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids.</a> Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li></ol>

הדור של ביו-בנק חי מניח מראש, מלבד עמידה בתקנות החוקיות של פרטיות, משפט רפואי ורווחת בעלי חיים, תשתית טובה וצוות מתואם היטב. זה הוכיח יתרון ישירות לערב חלק מהצוות הכירורגי בהליכי המחקר, שכן הם יכולים מאוד להעריך את ההתאמה של המטופל הפרט לתרומת רקמות. יתר על כן, חולים נוטים להסכים עם biobanking בתדירות גבוהה יותר, כאשר האישור בכתב שלהם מתקבל במהלך הדיון בהסכמה מדעת כירורגית. כדי לחסוך זמן ומשאבים, מקרים כי יהיה ככל הנראה להניב כמויות מספיקות של רקמת הגידול לא צריך להיבחר עבור biobanking. כשמדובר ברכישת דגימה, המקסימום "תקשורת היא המפתח" הוא אמת פשוטה, אך לעתים קרובות מתעלמים ממנה. זה לוקח רק אחות תיאטרון אחת חסרת ידע או עמית כירורגי להרוס את הדגימה ממש בהתחלה על ידי המשך כרגיל והוספת פורמלדהיד לדגימה כריתה. לכן, זה חיוני לחלוטין כי כל אחד מחברי הצוות המעורב מקבל היכרות עם SOP עבור biobanking. מנתחים יש לשים לב יום לפני וממש בתחילת ההליך על איסוף רקמות מתוזמן. יתר על כן, מקרים שנבחרו עבור biobanking, צריך להיות מודגש בתוכנית או אלקטרונית. קצירת רקמות מהדגימה הכירורגית צריכה להתבצע על ידי פתולוג. ראשית, זה יבטיח כי קצירת הרקמות אינה מפריעה לדו"ח הפתולוגי הסופי. שנית, זה מגדיל את ההסתברות של קבלת רקמה עם כמויות נאותות של רקמת סרטן קיימא. במיוחד בסרטן הלבלב עם תגובה desmoplastic בולט ואזורים נמקיים תכופים, חלקים קיימא קשה לזהות מקרוסקופית עבור העין לא מאומן. כחריג לכלל זה, בלוקי רקמה מגרורות גדולות בכבד או בפולמונלה, עשויים לפעמים להיות מגורשים "שולחן אחורי" על ידי המנתח, אם שוליים כירורגיים יכולים להיות מוגדרים מקרוסקופית. סרטן פי הטבעת resected על ידי כריתה mesorectal הכולל (TME), לא יכול להיות מתאים biobanking, שכן קצירת רקמות מן הדגימה resected לפני הטמעת פרפין עלול להפריע להערכת איכות TME. לחלופין, רקמה עבור biobanking ניתן לרכוש על ידי ביופסיה טרנסאנלית של סרטן פי הטבעת.
שיעורי ההקמה של תרביות תאים ראשוניות הנגזרות מהגידול המקורי הם בדרך כלל נמוכים. PDX נגזר, תרביות תא משני יכול להיות הוקמה בהצלחה רבה יותר. אנו ממליצים לבדוק מדיה שונה עבור כל מקרה ושימוש תוספי אנטיביוטיקה עבור הקטעים הראשונים כדי להפחית את הזיהום למינימום מאז הרקמה שנקטפו הוא לעתים רחוקות סטרילי. לאחר התפשטות מוצלחת, כל קו תאים בודד צריך להיות מאושר כקו תאים סרטניים על ידי ניתוח FACS ונבדק באופן קבוע לזיהום mycoplasma. כדי לא לכלול זיהום צולב, ניתוח STR רגיל מומלץ. יש לציין, כי פרוטוקול ההקמה עבור קווי תאים ראשיים ומשניים נתון כל הזמן לאופטימיזציה. פרטים על ההרכב ושיעורי ההצלחה של המדיה הבודדת הם בבירור מעבר להיקף עבודה זו ויפורסמו בנפרד.
עבור תחריט PDX, רקמת הגידול יכולה להיות מושתלת ישירות לאחר כריתה או cryopreserved בסרום עגל העובר עם 10% DMSO או מדיה הקפאה דומה להשתלה מאוחרת. ההשתלה מיד עם קצירת רקמת הגידול מכבידה על צוות הלוגיסטיקה והמעבדה, ותוצאות קסנוגרפטינג לאחר ההקפאה אינן נחותות כלל 10. יתר על כן, דגירה של הרקמה Matrigel לפני השתלת הגידול, מגדיל באופן משמעותי את שיעורי החריטה12. אנו ממליצים על חריטה מאוחרת בעקבות ממצא פתולוגי מובהק וסילוק מיידי של דגימות רקמה שנאספו בטעות. מאז שיעור ההצלחה של תחריט ראשי עולה עם כשל חיסוני של העכבר הנמען, אנו נוטים להשתמש בעכברי NSG עבור המעבר PDX הראשון. לאחר תחריט PDX המוצלח הראשון, עכברי NMRInu/nu יכולים ויש להשתמש בהם למעברים הבאים ולהרחבת רקמות. זן זה הוא חזק יותר, זול יותר וקל יותר להתרבות בהשוואה NSG או זנים immunodeficient דומה, אבל עדיין מראה שיעורי חריטה סבירים. יתר על כן, העירום שלה מקל על השתלה וניטור צמיחת הגידול. כדי להגדיל את שיעורי החריטה במעברים הבאים, אנו ממליצים על העברה ישירה של רקמות PDX שנקטפו לאחרונה כדי לארח עכברים במידת האפשר, במיוחד עבור PDX הגדל לאט ומקרים עם שיעור הצלחה תחריט ראשוני נמוך. קולינס ולאנג סקרו לאחרונה 14 מחקרים של הקמת PDX המעי הגס ודיווחו על שיעורי חריטה הנעים בין 14 ל -100% עם שיעור הקמה PDX חציוני של 68%, האחרון עולה בקנה אחד עם הממצאים שלנו13. בקנה אחד עם הספרות, ראינו שיעורי הקמה נמוכים יותר של הלבלב לעומת סרטן המעי הגס PDX14. ללא קשר לזן העכבר המארח וישות הגידול, צמיחתו של האדם, וירוס אפשטיין-בר (EBV) הקשורים לימפומות B-cell ולימפומות מורין בצד ההשתלה מהווה מכשול חשוב15,16. אם לא מזוהה, גידולים כאלה יכולים "לזהם" קטעים הבאים ובכך לבלבל תוצאות רצופות. צמיחה PDX מהירה יוצאת דופן ונפיחות של בלוטות לימפה צוואר הרחם, בית השחי, מפשעתי הם אינדיקטורים חזקים של צמיחת לימפומה מורין, אבל בדיקה היסטולוגית קבועה של PDX מומלץ בכל זאת. יתר על כן, קונקורדנציה גנטית בין PDX לבין המטופל התורם המתאים צריך להיבדק באופן קבוע על ידי ניתוח STR. באופן אידיאלי, biobank צריך להיות קשור למסד נתונים קליני הכולל מאפייני חולים (מידע כללי, הישרדות, הישרדות ללא הישנות, טיפול, neoplasia משני וכו '). בשל תקנות משפטיות של הגנת פרטיות והיעדר בסיס נתונים אנונימיות כזה, ערכת הנתונים הקליניים שלנו מנוהלת ומתעדכנת באופן קבוע על ידי הרופאים המשתפים פעולה.
בעוד ביובנקים קונבנציונליים מוגבלים למחקר מצפה כוכבים, ביובנק חי מספק את ההזדמנות להתערבויות במבחנה ובוויו. קווי תאים שמקורם בחולה הם כלי חשוב למחקר בסיסי, הקרנות תרופות בתפוקה גבוהה והערכה של סוכני תרופות חדשים4. מודלים PDX המקביל, עם זאת, הם בעלי חשיבות גוברת, שכן הם מסכמים מקרוב את ההיסטולוגיה של הגידול המקורי17,18 ולהראות יציבות גנטית גבוהה על פני מספר קטעים19,20. ה-PDX biobank שלנו הוכיח את עצמו כפלטפורמה מצוינת למחקר פרה-קליני ויסודי6,21. יתר על כן, מאז אוספי PDX גדולים כראוי לשקף את ההטרוגניות הבין-אינדיבידואלית של אוכלוסיית המטופלים, הגישה ניסוי קליני PDX (PCT) (חיה אחת לכל מודל לכל טיפול) צברה חשיבות לפיתוח תרופות שכן היא מאפשרת חיזוי נאמן של תגובה קלינית לתרופות חדשות משטר קומבינטורי8. אנו גם מעריכים כעת תרופות ניסיוניות חדשות בניסויים קטנים PCT.
למרות תוצאות מבטיחות אלה, משך ההקמה החציוני של 12.2 חודשים, מעכב את הישימות הקלינית של מודלים PDX כמו "עכברי גלגול" לבדיקת אפשרויות טיפול נגד סרטן, לפחות עבור אותם חולים הזקוקים לטיפול אדג'ובנטי מיידי או אפילו neoadjuvant22. חיסרון נוסף של דגמי PDX סטנדרטיים הוא היעדר שימושיות לבדיקות אימונותרפיות בשל כשל חיסוני של עכברים מארחים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו מספר זני עכבר "אנושיים". עכברים אלה הם immunocompromised בכבדות, אבל ניתן לשקם עם סוגים שונים של תאים נגזר מח עצם אנושי או CD34+ תאי גזע hematopoietic לאחר PDX outgrowth23, המאפשר הערכה של cytotoxicity בתיווך לימפוציטים של תגובה טיפולית לטיפול מעכבי מחסום חיסוני24,25.
בשנים האחרונות, אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) התגלו כמודלים חשובים לסרטן המתחרים ב- PDX. מבנים תלת-ממדיים אלה, המופקים מחתיכות גידול שלמות ומתורבתים בפיגום מטריצה חוץ-תאית, משקפים באופן הדוק את התכונות ההיסטולוגיות והגנטיות של הגידול המקורי. האפשרות של התרחבות ארוכת טווח ו cryopreservation הופך PDO תוסף אידיאלי של biobank חי26,27. בנוסף לשיעור הקמה גבוה יחסית, דווח על חיזוי תגובת תרופות אמינה עבור PDO של מספר ישויות גידול28. יתר על כן, PDOs אפילו נוצרו מתאי הגידול במחזור וגם הקמת בו זמנית של אורגנואידים מרקמה בריאה תואמת אפשרי, המאפשר הערכה של רעילות הקשורות לטיפול על בסיס חולה-אדם29,30. עם זאת, בהשוואה לתרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות, תרבות האורגנואידים היא זמן ותרכובות מטריצה חוץ-תאית מלאכותיות יכולות להפריע להליכים אנליטיים מסוימים31. יתר על כן, אורגנואידים סרטניים רגישים לצמיחת יתר על ידי גידול מהיר יותר, אורגנואידים שאינם ממאירים נגזר אפיתל בריא30. בשל מחסור בסטרומה, כלי דם ותאי חיסון, PDOs הם בעיקר בלתי ניתנים לתיישנות לבדיקה של סוכנים אימונותרפיים אנטי אנגיוגניים. עם זאת, שיטות culturing חדש לאפשר מידול של microenvironment הגידול במבחנה, מה שהופכים PDOs מתחרה אמיתי עבור מודלים PDX32. בעתיד הקרוב, מודלים של גידולים מטופלים-אינדיבידואליים, בשילוב עם כלים גנטיים רבי עוצמה כמו רצף הדור הבא, יסללו בתקווה את הדרך לרפואה מדויקת אמיתית וגישות מותאמות אישית.

בשנים האחרונות, הידע המצטבר על התכונות המורפולוגיות, הקליניות והגנטיות של סרטן הוביל לתפיסת הסרטן כמחלה הטרוגנית ואינדיבידואלית. כתוצאה מכך, אפיון מוטציה של neoplasms, מלבד תכונות קליניות ופתולוגיות, צברה חשיבות לקבלת החלטות קליניות וטיפולים ממוקדים רבים פותחו עבור שינויים מולקולריים שונים. לדוגמה, את היעילות של cetuximab בטיפול בסרטן המעי הגס ניתן לחזות על ידי ניתוח של מצב מוטציה KRAS ו PIK3CA 1. רפואה מדויקת שואפת לגישה מותאמת אישית כדי לספק את המענה הטיפולי הגבוה ביותר בכל מטופל ולהימנע מרעילות של טיפולים לא יעילים2. Biobanks מכילים רקמות, דם וחומרים ביולוגיים אחרים של חולי סרטן, אשר קשורים לנתונים הקליניים, ולכן הם כלי מצוין לחקר סרטן תרגום. בשל מספר רב של דגימות קליניות, biobanks לאפשר גילוי של מוטציות נדירות, אך פוטנציאל לתרופות, אשר מספק הזדמנויות טיפול חדשות עבור המטופל הפרט3.
כדי לכסות רחב ככל האפשר ספקטרום מחקר אונקולוגי, לא לרסן את הפעילות שלנו על קציר מדגם לבד, אבל התמקד בהקמת קווי תאים סרטניים שמקורם בחולה וקסנוגרפטים (PDX). קווי תאים דו-מימדיים מסורתיים נשארים האבן הפינתית של מחקר במבחנה והם הבחירה העיקרית להקרנות סמים בקנהמידהגדול 4,5. יתר על כן, ניתוח קו התא הוא לעתים קרובות קל יותר, זול יותר וזמין יותר. בנוסף, מאז לימפוציטים בדם היקפי שמקורו בחולה (PBL) זמינים, גם אימונולוגיה הגידול ניתן ללמוד במבחנה6. עם זאת, רוב התרופות שפותחו לאחרונה עם השפעה פרה-קלינית מבטיחה בניסויים מבוססי תאים במבחנה או ב- vivo, הראו תוצאות מאכזבות בניסויים קליניים7. לעומת זאת, מחקרים פרה-קליניים המבוססים על PDX במחקרי vivo שיקפו את הפעילות הקלינית של סוכנים אנטי-ניאופלסטיים הרבה יותר בנאמנות8. מאז רקמת PDX משקף מקרוב את המאפיינים היסטולוגיים ומולקולריים של הגידול התורם, מודלים PDX הם דרך טובה להפיץ את כמויות מוגבלות מאוד לעתים קרובות של רקמת גידול קיימא כדי לשמור על השלמות של ביובנק ולאפשר חילופי דגימות בין קבוצות מחקר ומוסדות. יתר על כן, קווי תאים סרטן נגזר רקמת PDX ניתן להקים באופן משמעותי קל יותר מאשר קווי תאים סרטני ראשוני9. בשנים האחרונות הקימה קבוצת העבודה שלנו ביו-בנק משולב מקיף של סרטן המעי הגס והלבלב על ידי סטנדרטיזציה ואופטימיזציה של זרימת העבודה עבור כל הדגימות הביולוגיות המדוברות (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה וארגון של הביובנק <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacillol&#174; AF; 1L</td>
			<td>Bode, Hartmann</td>
			<td>REF 973380</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 15ml; sterile</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>GBO Cat. No.:188271</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 50ml, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Order number: 62.547.254</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 20ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 300296</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Item number: 01.1601</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological Pipette 10ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 86.1254.001</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy ratiolab&#174; accupetta</td>
			<td>Ratiolab</td>
			<td>Item number: RL3200300</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>VWR Cat.No: 613-4438</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS; w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-36500</td>
			<td>washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll human</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-60500</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-41500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P40-47500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-80100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P10-023100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>VWR Cat.No: A3672.0250</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)</td>
			<td>selfmade</td>
			<td>---</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotube- CryoPure 2ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well cell culture plate; steril; with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>Cat.-No.: 657 160</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Cat. No.: 82.1472.001</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blades</td>
			<td>B.Braun (Aesculap)</td>
			<td>REF BB510</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309110</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer; yellow; 100&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF 352360</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>biocision</td>
			<td>Item number: 210004</td>
			<td>cooling container with -1&#176;C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar&#160;transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm</td>
			<td>KGW</td>
			<td>Cat. No.: HT39.1</td>
			<td>transport system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.760.002</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.762.411</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200&#181;l, yellow</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.082</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000&#181;l, blue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.120</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator&#160; BB 6220 CU</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat.-No.: 51012839</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating plate PR&#196;ZITHERM</td>
			<td>Harry Gestigkeit GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Zeiss Primo Vert</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>Serial number. 3842000839</td>
			<td>imaging cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench Safe flow 1.8 nunc</td>
			<td>nunc GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>---</td>
			<td>sterile working bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer -80&#176;C</td>
			<td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance MP-300</td>
			<td>Chyo</td>
			<td>---</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine, U100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 324826</td>
			<td>injection anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%; 25ml</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>approval number: 6293841.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td>
			<td>CP-Pharma GmbH</td>
			<td>approval number: 401650.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GES3S Reader</td>
			<td>Datamars</td>
			<td>not available</td>
			<td>RFID reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td>
			<td>Peddymark</td>
			<td>---</td>
			<td>RFID chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotrim-ratiopharm&#174;&#160;Ampullen SF 480&#160;mg/5&#160;ml</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>PZN-03928197</td>
			<td>antibiotic drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate #FM-20 42x28cm</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Electric Petra, Burgau</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>PZN-01578675</td>
			<td>Eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anatomical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD21 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD50 1 R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BC05 6R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle&#160;holder</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BH1 1 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>XN8870.P32</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opsite moisture vapour permable spray dressing</td>
			<td>Smith&#38;Nephew</td>
			<td>REF 66004978, PZN- 02063507</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aperture drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>REF 904622</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze swap Gazin&#174;; steril; 10x10 cm</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 18506</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raucotupf cotton tipped applicators</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 11969</td>
			<td>applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat.-No.: 354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>Item number: 18839</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#174; Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>Order No.:130-100-008</td>
			<td>storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formafix 4%</td>
			<td>Grimm med. Logistik GmbH</td>
			<td>Item number: F10010G</td>
			<td>fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software FreezerworksBasic</td>
			<td>Dataworks Development, Inc</td>
			<td>---</td>
			<td>sample organization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra TLP 2844 printer</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>---</td>
			<td>label printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation and maintenance of a living biobank - how we do it

לאור הידע הגובר על המאפיינים הבין-אינדיבידואליים וההטרוגניות של סרטן, התחום המתפתח של רפואה מותאמת אישית דורש פלטפורמה למחקר פרה-קליני. במהלך השנים האחרונות, הקמנו biobank של סרטן המעי הגס והלבלב המורכב רקמת הגידול העיקרי, רקמה נורמלית, סרה, לימפוציטים בדם היקפי מבודד (PBL), קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX), כמו גם קווי תאים סרטניים ראשוניים ומשניים. מאז רקמת הגידול המקורי מוגבל ואת קצב הקמת של קווי תאים סרטניים ראשוניים הוא עדיין נמוך יחסית, PDX לאפשר לא רק שימור והרחבת biobank אלא גם את הדור של קווי תאים סרטניים משניים. יתר על כן, דגמי PDX הוכחו להיות המודל האידיאלי vivo עבור בדיקות סמים פרה-קוליניות. עם זאת, ביובנקינג דורש הכנה קפדנית, הנחיות קפדניות ותשתית מכווננת היטב. Colectomy, תריסריון או גרורות resected דגימות נאספים מיד לאחר כריתה ומועברים למחלקה הפתולוגית. כיבוד העדיפות של דו"ח היסטופטולוגי משוחד, על פי שיקול דעתו של הפתולוג המטפל שמבצע את הניתוחים, חתיכות גידול קטנות ורקמה שאינה גידול נקצרים. 
חלקים נמקיים מושלכים ורקמת הגידול הנותרת נחתכת לקוביות קטנות וזהות וקריפטופדית לשימוש מאוחר יותר. בנוסף, חלק קטן של הגידול הוא טחון ומתוח עבור תרבות תאים סרטניים ראשונית. בנוסף, דגימות דם שנלקחו מהמטופל לפני ואחרי הניתוח, מעובדות כדי להשיג סרום ו- PBLs. עבור תחריט PDX, הדגימות cryopreserved מופשרים ומושתלים תת עורית לתוך האגפים של עכברים immunodeficient. PDX וכתוצאה מכך recapitulate מקרוב את ההיסטולוגיה של "התורם" גידולים והוא יכול לשמש גם עבור קסנוגרפטינג הבאים או cryopreserved לשימוש מאוחר יותר. בעבודה הבאה, אנו מתארים את השלבים האינדיבידואליים של יצירה, תחזוקה וניהול של ביובנק גדול של סרטן המעי הגס והלבלב. יתר על כן, אנו מדגישים את הפרטים החיוניים ואת האזהרות הקשורות biobanking.

בידינו, שיעור ההקמה של תרביות תאים ראשוניות (איור 2A &amp; B) היה 12.9% בסדרה גדולה9. רוב הניסיונות לבודד תאים סרטניים הניתנים להרחבה מדגימות כירורגיות טריות שנכשלו נכשלו בשל חוסר התרחבות או זיהום מוקדם. הקמת קו התא נחשב מוצלח לאחר 3 קטעים עם צמיחה יציבה בתנאי תרבות סטנדרטיים (DMEM, 10% FCS, כלי תרבות סטנדרטי) ואימות של בידול אפיתל באמצעות FACS-ניתוח10. קווי התאים הנגזרים מגידולי PDX (איור 2C &D) הראו שיעור הקמה גבוה יותר של 23.6% אשר נובע גם מהאפשרות של ניסיונות חוזרים ונשנים לעומת גידולים ראשוניים9. עם זאת, חלק מהתרבויות המעורבות (איור 2E)אינן יכולות להשתחרר מצמיחה פיברובלסטית או אפילו ללכת לאיבוד עקב צמיחת יתר פיברובלסטית(איור 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> איור 2: תרבות התאים. קווי תאים סרטניים ראשוניים, נגזר גרורות של מקרה סרטן המעי הגס HROC313, מעבר 21 (A) ומקרה סרטן הלבלב HROP88, קטע 5 (B). PDX נגזר קווי תאים סרטניים של המעי הגס PDX HROC285 T0 M2 (D) ולבלב PDX HROP10 T5 M2, מעבר 4 (E). תרבות מעורבת של פיברובלסטים ותאי סרטן מסרטן הלבלב HROP75, מעבר 8 (C) וגימת יתר פיברובלסטית (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בהתחשב בשינויים בפרוטוקול הדור PDX, זנים העכבר בשימוש וגם ניסויים על פני מספר שנים, כמו גם הבדלים גדולים בכמות רקמת הגידול זמין עבור חריטה, זה לא טריוויאלי לתת את שיעור ההצלחה הכולל של דור PDX. בסדרה עדכנית מאוד של ניסויי דור PDX שבוצעו על ידי שני חוקרים (S.M. ו- F.B.), נצפו שיעורי שגשוג ראשוניים של 63% עבור PDX המעי הגס (היסטולוגיה למופת ניתן לתאר מאיור 3A) ו -48% עבור PDX הלבלב (איור 3B). תולדות הלימפומה המורינית או האנושית באתר ההשתלה נדירות יחסית, אך יכולות לחקות את תנופת PDX המוצלחת(איור 3C). מלבד בדיקה היסטופתולוגית, קונקורדנציה בין מודלים PDX לבין המטופלים התורמים שלהם אושרה באופן קבוע על ידי ניתוח חוזר טנדם קצר (STR) (איור 3D). עד היום הביובנק כולל >50 צבעים ראשוניים ו->50 משניים, 3 קווי תאים משניים לסרטן הלבלב ו-6 קווים משניים של סרטן הלבלב, כמו גם >150 דגמי PDX המעי הגס ו-19 דגמי PDX בלבלב.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> איור 3: השוואה היסטולוגית מייצגת של המעי הגס (A) ושל PDX הלבלב (B). לימפומה אנושית באתר ההשתלה מחקה את PDX מצמח (C). בדיקות זהות גנטית של מודל PDX (HROC430 T1 M2) לרקמת הגידול המקורית של המטופל (HROC430Tu) על ידי ניתוח חוזר טנדם קצר (STR). השוואה בין תשעת הלוקוסים STR, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (צבע FAM) ו- D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (צבע HEX) באמצעות PCR מולטיפלקס עם פריימרים עם תווית פלואורסצנטית בעקבות אלקטרופורזה נימי אישר קונקורציה גנטית של PDX וגידול (DDX) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

בעבודה הבאה, אנו מתארים את הצעדים הרצופים הדרושים להקמת ביובנק גדול של סרטן המעי הגס והלבלב.

יצירה ותחזוקה של ביובנק חי - איך אנחנו עושים את זה

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

יצירה ותחזוקה של ביובנק חי איך אנחנו עושים את זה. מבוא. ביובנקים מסורתיים מכילים בדרך כלל דגימות רקמות ודם שאינן בנות קיימא. למרות המשקף כראוי את המגוון של אוכלוסיות חולי סרטן ומאפשר ניתוחים גנטיים והיסטולוגיים, הם אינם מתאימים מבחנים פרה-קוליניים להערכת אסטרטגיות טיפוליות.ביובנק המשלב גם מודלים שמקורם בחולה מתגבר על מגבלות אלה. ובכך מאפשר בדיקות פונקציונליות לרפואה מדויקת. רכישה לדוגמה.עבור biobanking של סרטן המעי הגס והלבלב, לבחור מקרים עם אבחון מוכח, כמו גם גודל גידול מספיק, תבלין הודיע של המטופל הוא חובה. לפני תחילת הניתוח, לצייר 20 מ"ל של דם באמצעות מזרק הפריני ו 7.5 מ"ל נוספים עם מונובט בסרום. עיבוד סרום ובידוד PBL.לאחר צנטריפוגה ב 1, 128 RCF במשך 15 דקות בארבע מעלות הסרום הוא aliquoted ב cryotube שכותרתו מראש שקוע ישירות חנקן נוזלי. הדם הפריני מועבר לצינור פוליפרופילן ומדולל עם PBS 15 מ"ל. השתמש פיפטה סרולוגית לאט underlay את התערובת עם 15ml Pancoll.לאחר צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, השכבה האטומה המכילה את התאים המונו-גרעיניים נלקחת עם פיפטה סרולוגית ומועברת לצינור PP חדש. לאחר שטיפה עם PBS ו pelleting את התאים mononuclear על ידי צנטריפוגה, להשליך את supernatant ו resuspend גלולה במדיום מקפיא לוותר על cryotubes שכותרתו מראש. מעבירים את הצינורות למיכל קירור המתאים להקפאה איטית עם מעלה אחת לדקה ומאחסנים זמנית ב-80 מעלות.עיבוד רקמות. ברגע שדגימה רקמה הוא resected על ידי המנתח, לשים אותו לתוך מיכל מתאים. הימנע בכל הנסיבות כי הרקמה מכוסה פורמלין.הובלה מהירה ככל האפשר לפתולוגיה לכריתת חומר הגידול אינה רלוונטית להערכה פתולוגית של שולי הריתוס. חתיכת הגידול צריך להיות מטופל אספטי ככל האפשר. יתר על כן, להשיג דגימה של רקמה בריאה ומניחים הן בצינורות נפרדים ממולאים מראש עם פתרון אחסון רקמות על קרח.חזור מיד למעבדה כדי להתחיל עיבוד רקמות בתנאים סטריליים. חתיכת הרקמה מונחת על צלחת פלסטיק סטרילית מלאה בתמיסת אחסון רקמות כדי למנוע התייבשות. קודם כל, בלו אחד או יותר חתיכות בגודל pinhead עבור הצמד הקפאה בהתאם לגודל של דגימת הרקמה המתקבלת.מניחים את הרקמה המקומית לתוך cryotubes שכותרתו מראש לטבול מיד חנקן נוזלי. חותכים את הרקמה הנותרת לקוביות של שלוש על שלוש על שלושה מילימטרים מעוקבים. קח בחשבון כי רקמה נמקית חייב להיות מנותח לחלוטין אבל לא צריך להיות מושלך.סדר את הקוביות בארבעה כדי לקבוע את מספר aliquots עבור אחסון חיוני. תווית מספר נאות של cryotubes ולמלא אותם מראש עם 1.5 מ"ל מקפיא בינוני כל אחד. מאז DMSO במדיום המקפיא הוא ציטוטוקסי, ביצע את השלבים הבאים במהירות וללא הפרעה.השתמש להבי אזמל כדי לגרוף את ארבע חתיכות רקמה לכל צינור. ודא כי כל החלקים שקועים לחלוטין במקפיא בינוני באופן אידיאלי בתחתית הצינור במהירות להקפיא צינורות באמצעות מיכל הקפאה. המשך באותו אופן עם הדגימה הבריאה.לאחסון ארוך טווח, אחסנו את כל האליטרוטים במיכל חנקן נוזלי. תרבות תאים. טוחנים את שרידי עיבוד רקמת הגידול, כולל החלקים הנמקיים עם להבי האזמל קטנים ככל האפשר.מניחים מסננת תאים בחלק העליון של צינור PP סטרילי ושואפים את ההשעיה עם פיפטה סרולוגית לעבור דרך מסננת התא. השתמש בוכנה של מזרק לשימוש יחיד ללחוץ על הרקמה נשאר דרך מסננת התא כדי ליצור השעיה תא יחיד. יש לשטוף באמצעות PBS ולחזור על שלבים אלה עד שלא יישאר חומר.הסר את מסננת התא וצנטריפוגה ההשעיה ב 180 RCF במשך שבע דקות. בינתיים, להכין קולגן מצופה מראש שש באר צלחת עם קומפוזיציות מדיה שונות כדי להגדיל את ההסתברות של גידול לגדול. השלך את supernatant ו resuspend גלולה ב PBS ולחלק 500 microliters לכל באר.לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור סטנדרטי. דור של קסנוגרפט שמקורו בחולה. עבור הדור של קסנוגרפטים שמקורם בחולה בעכברים immunocompromised, בעלי חיים צריכים להישמר בסביבה ספציפית ללא פתוגן.ללבוש ציוד מגן אישי הכולל קרצוף, סינר, מסכת פנים, כיסוי שיער וכפפות. לאחר סידור סביבת העבודה שלך, לקחת את דגימת הגידול תשוקה ממיכל חנקן נוזלי. מלא צינור PP טרי עם PBS 35 מ"ל ולאחר מכן לשטוף את תהליך ההפשרה בזהירות להטות את צינור cryo למעלה ולמטה.ברגע התוכן הופך רפוי, שפכו לתוך PBS ולשטוף את חתיכות הגידול. השלך את רוב PBS ורוקן את הקוביות לתוך המכסה. מניחים צלחת פלסטיק סטרילית על חבילת קרח ומוסיפים טיפה של 100 מיקרוליטר Matrigel.השתמש מלקחיים למקם את חתיכות הגידול Matrigel ולהדגיר את הגידול במשך 10 דקות. בינתיים, תחטא שני עכברים. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת הרגל של החיה.כל תנועה מצביעה על הרדמה לא מספקת ודורשת המתנה מסוימת או מינון נוסף. החל משחת עיניים, לצבוט את העכבר על ידי הצוואר ולהזריק שבב תת עורי. בצע את השלבים הבאים במקביל.לחטא את האגפים של העכברים ולעשות חתך עור קטן עם מספריים Metzenbaum פסים וליצור כיס תת עורי על ידי הכנה בוטה. השתמש מלקחיים אנטומיים כדי להכניס את חתיכות הגידול. ודא כי החתיכה ממוקמת בקצה האחורי של כיס העור.שאפתן את Matrigel הנותרים ולחלק באופן שווה לכל ארבעת הכיסים. המתינו לריפוי הג'ל וסגרו את העור בתפרים עם כפתור יחיד מבלי לפגוע בחלקי הגידול עם המחט. חותכים את החוט קצר ככל האפשר מעל הקשר ולהחיל רוטב ספריי כדי למנוע נוי של התפרים.סרוק את השבב והוסיף את מידע הגידול למסד הנתונים לזיהוי מאוחר יותר של החיה. מכינים כלוב עם מצעים טריים וחומר קינון, מניחים את העכברים מול מנורת אינפרא אדום ומנטרים את החיה עד שההרדמתה שככה. הסבר של PDX.לאחר הגידול PDX הגיע לגודל הנדרש, העכבר הוא מורדם על ידי חנק CO2 ונקע צוואר הרחם הבאים. לנתח בזהירות את העור מהגידול ולהסיר את PDX לחלוטין. תוצאות מייצגות.מניחים גידול על צלחת פלסטיק סטרילית ומשתמשים בלהבי אזמל סטריליים לעיבוד נוסף. חותכים חור עם הפרוסות, מניחים אותם בקלטת היסטולוגיה ושקעים בפורמלין כדי ליצור דגימה משובצת פרפין להערכה היסטולוגית במועד מאוחר יותר. מעבירים את שאר הגידול לתמיסת אחסון רקמות ויוצרים דגימה קפואה חדשה שהשתמרה באופן חיוני ונשברת עבור הביובנק.בנוסף, השתמש בשרידי הגידול PDX מקביל לתרבות תא הפרק כדי להקים קווי תאים סרטניים משניים. כדי ליצור PDX נוסף, להעביר שתי חתיכות גידול או יותר עם Matrigel לעכבר נמען חדש כפי שמוצג קודם לכן. מסקנה. באמצעות הפרוטוקול שהוצג, הצלחנו עד כה להקים תשעה דגמי PDX של הלבלב ויותר מ-100 חולי המעי הגס, כמו גם 19 דגמי PDX בלבלב ומעל 150 צבעים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

פיתוח ותחזוקה של גידול נגזר החולה פרה xenograft דגם לחקירת Novel טיפולים נגד סרטן

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

באמצעות 22C 3 נוגדן Anti-PD-L1 להתרכז ביופסיה ודוגמאות ציטולוגיה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

טכניקות מולקולריות ואימונולוגיות במודל עכבר מהונדס גנטית של גידול סטרומלי במערכת העיכול

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...