निर्माण और एक जीवित बायोबैंक के रखरखाव हम यह कैसे करते हैं । परिचय। पारंपरिक बायोबैंकों में आमतौर पर गैर-व्यवहार्य ऊतक और रक्त के नमूने होते हैं। कैंसर रोगी आबादी की विविधता को पर्याप्त रूप से प्रतिबिंबित करने और आनुवंशिक और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की अनुमति देने के बावजूद, वे चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने वाले प्रीक्लिनिकल परख के लिए अनुपयुक्त हैं।
एक बायोबैंक एकीकृत भी रोगी व्युत्पन्न मॉडल इन सीमाओं पर काबू पा । इस प्रकार सटीक दवा के लिए कार्यात्मक परीक्षण को सक्षम करना। नमूना अधिग्रहण।
कोलोरेक्टल और अग्नाशय के कैंसर के बायोबैंकिंग के लिए, सिद्ध निदान के साथ-साथ पर्याप्त ट्यूमर आकार के साथ मामलों का चुनाव करें, रोगी के सूचित concent अनिवार्य है। सर्जरी की शुरुआत से पहले, एक हेपरिनाइज्ड सिरिंज और सीरम मोनोवेट के साथ अतिरिक्त 7.5 मिलीलीटर का उपयोग करके 20 मिलीलीटर रक्त खींचें। सीरम प्रोसेसिंग और पीबीएल आइसोलेशन।
चार डिग्री पर 15 मिनट के लिए 1, 128 आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र के बाद सीरम को पूर्व-लेबल वाले क्रायोट्यूब में अलीकोट किया जाता है और सीधे तरल नाइट्रोजन में डूब जाता है। हेपरिनाइज्ड रक्त को पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है और 15 मिलीलीटर पीबीएस के साथ पतला किया जाता है। मिश्रण को धीरे-धीरे 15 मिलीलीटर पैनकोल के साथ रेखांकित करने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र के बाद, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं वाली अपारदर्शी परत को सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ लिया जाता है और एक नई पीपी ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है। पीबीएस से धोने और अपकेंद्री द्वारा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को गोली करने के बाद, सुपरनैंट को त्यागें और फ्रीजर माध्यम में गोली को फिर से खर्च करें और पूर्व-लेबल वाले क्रायोट्यूब में वितरित करें। ट्यूबों को एक ठंडा कंटेनर में स्थानांतरित करें जो धीमी ठंड के लिए उपयुक्त है और एक डिग्री प्रति मिनट के साथ और अस्थायी 80 डिग्री पर स्टोर करें।
ऊतक प्रसंस्करण। जैसे ही ऊतक का नमूना सर्जन द्वारा फिर से डाला जाता है, इसे एक उपयुक्त कंटेनर में डाल दें। सभी परिस्थितियों में बचें कि ऊतक फॉर्मेलिन में कवर किया जाता है।
रिसेक्शन मार्जिन के रोग मूल्यांकन के लिए प्रासंगिक नहीं ट्यूमर सामग्री के निष्कासन के लिए विकृति के लिए जितनी जल्दी हो सके परिवहन। ट्यूमर टुकड़ा संभव के रूप में aseptic के रूप में संभाला जाना चाहिए। इसके अलावा, स्वस्थ ऊतक का एक नमूना प्राप्त करें और बर्फ पर ऊतक भंडारण समाधान से पहले से भरे अलग ट्यूबों में दोनों रखें।
बाँझ परिस्थितियों में ऊतक प्रसंस्करण शुरू करने के लिए प्रयोगशाला में तुरंत लौटें। ऊतक टुकड़ा एक बाँझ प्लास्टिक ऊतक भंडारण समाधान से भरा पकवान पर रखा गया है desiccation से बचने के लिए । सबसे पहले, उत्पाद शुल्क एक या एक से अधिक पिनहेड-तस्वीर ठंड के लिए टुकड़े आकार ऊतक नमूना प्राप्त के आकार के आधार पर ।
देशी ऊतक को पूर्व-लेबल वाले क्रायोट्यूब में रखें और तरल नाइट्रोजन में तुरंत जलमग्न हो जाएं। शेष ऊतकों को तीन से तीन घन मिलीमीटर के क्यूब्स में काट लें। ध्यान रखें कि परिगलित ऊतक को पूरी तरह से विच्छेदित किया जाना चाहिए लेकिन इसे त्याग नहीं दिया जाना चाहिए।
महत्वपूर्ण भंडारण के लिए अलीकोट की संख्या निर्धारित करने के लिए चौगुनी में क्यूब्स की व्यवस्था करें। पर्याप्त संख्या में क्रायोट्यूब लेबल करें और उन्हें 1.5 मिलीलीटर फ्रीजर माध्यम से प्री-फिल करें। चूंकि फ्रीजर माध्यम में डीएमएसओ साइटोटॉक्सिक है, इसलिए अगले चरणों को जल्दी और बिना किसी रुकावट के किया।
प्रति ट्यूब चार ऊतक टुकड़ों को स्कूप करने के लिए स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि सभी टुकड़े पूरी तरह से फ्रीजर माध्यम में पूरी तरह से ट्यूब के तल पर आदर्श रूप से डूबे हुए हैं और तेजी से फ्रीज ट्यूब एक फ्रीज कंटेनर का उपयोग कर रहे हैं। स्वस्थ नमूने के साथ उसी तरह आगे बढ़ें।
दीर्घकालिक भंडारण के लिए, सभी एलिकोट्स को तरल नाइट्रोजन टैंक में स्टोर करें। सेल संस्कृति। ट्यूमर ऊतक प्रसंस्करण के अवशेष पीसें, जिसमें स्केलपेल ब्लेड के साथ परिगल भाग शामिल हैं।
एक स्टरल पीपी ट्यूब के शीर्ष पर एक कोशिका छलनी रखें और कोशिका छलनी के माध्यम से पारित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ निलंबन को एस्पिरेट करें। एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए कोशिका छलनी के माध्यम से ऊतक रहता है प्रेस करने के लिए एक एकल उपयोग सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करें। पीबीएस के साथ कुल्ला करें और इन चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि कोई सामग्री न बची न हो।
सेल छन्नी निकालें और सात मिनट के लिए 180 आरसीएफ पर निलंबन अपकेंद्रित्र करें। इस बीच, ट्यूमर वृद्धि की संभावना को बढ़ाने के लिए विभिन्न मीडिया रचनाओं के साथ एक कोलेजन प्री-लेपित छह-वेल प्लेट तैयार करें। सुपरनैंट को त्यागें और पीबीएस में गोली को फिर से खर्च करें और प्रति अच्छी तरह 500 माइक्रोलीटर वितरित करें।
बाद में, प्लेट को एक मानक इनक्यूबेटर में रखें। रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा का उत्पादन। इम्यूनोसमझौता चूहों में रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट की पीढ़ी के लिए, जानवरों को एक विशिष्ट रोगजनक मुक्त वातावरण में रखा जाना चाहिए।
स्क्रब, एप्रन, फेस मास्क, हेयर कवर और दस्ताने शामिल व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। अपने कार्यक्षेत्र की व्यवस्था करने के बाद, तरल नाइट्रोजन कंटेनर से इच्छा ट्यूमर नमूना लें। 35 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक ताजा पीपी ट्यूब भरें फिर विगलन प्रक्रिया को ध्यान से धोएं और क्रायो ट्यूब को ऊपर और नीचे झुकाएं।
जैसे ही सामग्री कीचड़ हो जाती है, पीबीएस में डाला और ट्यूमर के टुकड़े कुल्ला। अधिकांश पीबीएस को त्यागें और क्यूब्स को ढक्कन में खाली करें। एक आइस पैक पर एक बाँझ प्लास्टिक पकवान रखें और 100 माइक्रोलीटर मैट्रिक्स की एक बूंद जोड़ें।
ट्यूमर के टुकड़ों को मैट्रिगेल में रखने और ट्यूमर को 10 मिनट तक इनक्यूबेट करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। इस दौरान दो चूहों को एनेस्थेटाइज करते हैं। जानवर के पैर को चुटकी बजाकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें।
कोई भी आंदोलन अपर्याप्त संज्ञाहरण को इंगित करता है और या तो कुछ प्रतीक्षा या अतिरिक्त डोजिंग की आवश्यकता होती है। आंखों का मरहम लगाएं, गर्दन से माउस को चुटकी लें और एक माइक्रोचिप को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें। निम्नलिखित चरणों को समानांतर रूप से आचरण करें।
चूहों के पार्श्व को कीटाणुरहित करें और धारी मेटज़ेनबॉम कैंची के साथ एक छोटी त्वचा चीरा बनाएं और कुंद तैयारी द्वारा एक चमड़े के नीचे की जेब बनाएं। ट्यूमर के टुकड़े डालने के लिए शारीरिक संदंश का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि टुकड़ा त्वचा की जेब के पीछे के छोर पर रखा गया है।
शेष मातृगील को एस्पिरेट करें और सभी चार जेबों में समान रूप से वितरित करें। जेल के इलाज का इंतजार करें और सुई के साथ ट्यूमर के टुकड़ों को नुकसान पहुंचाए बिना एकल बटन टांके के साथ त्वचा को बंद करें। गाँठ के ऊपर जितना संभव हो उतना कम धागा काटें और टांके के न जाने से रोकने के लिए स्प्रे ड्रेसिंग लागू करें।
माइक्रोचिप को स्कैन करें और जानवर की बाद में पहचान के लिए डेटाबेस में ट्यूमर की जानकारी जोड़ें। ताजा बिस्तर और घोंसले की सामग्री के साथ एक पिंजरे तैयार करें, चूहों को एक अवरक्त दीपक के सामने रखा जाए और जानवर की निगरानी करें जब तक कि संज्ञाहरण थम न जाए। पीडीएक्स का निष्कासन।
पीडीएक्स ट्यूमर के आवश्यक आकार तक पहुंचने के बाद, माउस को सीओ 2 एस्फिक्सेशन और बाद में सर्वाइकल अपभ्रंश द्वारा इच्छामृत्यु दी जाती है। ध्यान से ट्यूमर से त्वचा को काटना और पीडीएक्स को पूरी तरह से हटा दें। प्रतिनिधि परिणाम।
एक बाँझ प्लास्टिक डिश पर एक ट्यूमर रखें और आगे की प्रक्रिया के लिए बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें। स्लाइस के साथ छेद काटें, उन्हें एक हिस्टोलॉजी कैसेट में रखें और बाद के समय में हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए पैराफिन एम्बेडेड नमूना उत्पन्न करने के लिए फॉर्मेलिन में डूब जाएं। ऊतक भंडारण समाधान के लिए ट्यूमर के बाकी हस्तांतरण और बायोबैंक के लिए नए महत्वपूर्ण संरक्षित और तस्वीर जमे हुए नमूना बनाते हैं ।
इसके अतिरिक्त, माध्यमिक ट्यूमर सेल लाइनों की स्थापना के लिए अध्याय सेल संस्कृति के अनुरूप PDX ट्यूमर के अवशेष का उपयोग करें। आगे पीडीएक्स उत्पन्न करने के लिए, पहले दिखाए गए एक नए प्राप्तकर्ता माउस में मैट्रिगेल के साथ दो या अधिक ट्यूमर टुकड़ों को स्थानांतरित करें। निष्कर्ष। प्रस्तुत प्रोटोकॉल के माध्यम से, हम अब तक नौ अग्नाशय और 100 से अधिक कोलोरेक्टल रोगी-व्युत्पन्न कैंसर सेल लाइनों, साथ ही 19 अग्नाशय और 150 से अधिक कोलोरेक्टल पीडीएक्स मॉडल स्थापित करने में कामयाब रहे।