Name: creation and maintenance of a living biobank - how we do it
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

私たちは、ビデオの録画と編集のために、私たちのグラフィカルアシスタントであるジェニー・バーマイスターを親切に認めます。さらに、長年の協力に対する外科および病理学部門の同僚に感謝します。また、ロストック大学ITメディアセンターの制作マネージャーであるマーカス・ミュラーが、オーディオ録音機器を供給し、音質を向上させてくれたことに感謝します。
資金調達: ドイツがん援助財団(DKH e.V.)、助成金番号108446、および州メクレンブルク・フォアポンメルン州からの助成金番号TBI-V-1-241-VBW-084は、部分的にこの研究に資金を提供しました。

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	<li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies.">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies.">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li><li>Wilding, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy.">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li><li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+model+supports+development,+function,+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells.">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li><li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts.">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. 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生きたバイオバンクの世代は、プライバシー、医療法、動物福祉、良好なインフラ、そしてよく調整されたチームの法的規制を遵守することとは別に、前提としています。彼らは非常によく組織の寄付のための個々の患者の適合性を評価することができるので、研究手順に直接外科スタッフの一部を関与することが有利であることが証明されています。さらに、患者は、外科的インフォームド・コンセント・ディスカッションの過程で書面による承認が得られると、バイオバンキングに同意する傾向が高い。時間とリソースを節約するために、おそらく不十分な量の腫瘍組織を生み出す症例は、バイオバンキングのために選択すべきではない。検体の取得に関しては、最大の「コミュニケーションが鍵」は単純ですが、見落とされがちな真実です。それは単一の無知な劇場の看護師または外科の同僚がいつものように進み、切除標本にホルムアルデヒドを加えることによって、最初に標本を台無しにする必要があります。したがって、関与するスタッフの一人一人がバイオバンキングのSOPに精通することは絶対に重要です。外科医は、スケジュールされた組織採取に関する処置の開始時に前日と正しいことに注意する必要があります。さらに、バイオバンキングのために選択されたケースは、電子OR計画で強調表示されるべきです。外科標本からの組織採取は病理学者によって行われるべきである。まず、組織の収穫が最終的な病理学的報告に干渉しないことを保証する。第二に、これは、生存可能な癌組織の十分な量を有する組織を受け取る確率を増加させる。特に顕著なデスモプラスチック反応および頻繁な壊死領域を有する膵癌において、実行可能な部分は、訓練されていない眼のためにマクロ的に識別することは困難である。この規則の例外として、大肝またはプルモナリ転移からの組織ブロックは、外科的マージンがマクロ的に定義できるならば、時には外科医によって「後表」を切除され得る。パラフィン埋め込み前に切除標本から組織採取するとTME品質評価を妨げる可能性があるため、全心間腸切除(TME)によって切除された直腸癌はバイオバンキングには適さない可能性がある。あるいは、バイオバンキング用組織は、直腸癌の経肛門生検によって取得することができる。
元の腫瘍に由来する原発細胞培養の確立率は、一般的に低い。PDX由来の、二次細胞培養は、より正常に確立され得る。採取した組織は滅菌がめったにないので、汚染を最小限に抑えるために、ケースごとに異なる培地をテストし、最初の通路に抗生物質サプリメントを使用することをお勧めします。伝播に成功した後、個々の細胞株はFACS分析によって癌細胞株として確認され、マイコプラズマ汚染について定期的に試験される。クロスコンタミネーションを除外するには、定期的なSTR分析をお勧めします。なお、一次および二次細胞株の確立プロトコルは常に最適化を受ける。単一メディアの構成と成功率に関する詳細は、明らかにこの作品の範囲を超えており、別々に公開されます。
PDX生着の場合、腫瘍組織は、切除後に直接移植されるか、または10%DMSOまたは同様の凍結培地を用いて胎児の子牛血清に凍結保存して遅延移植を行うことができる。腫瘍組織採取直後の移植は、物流や研究室のスタッフに負担をかけ、凍結保存後の異種移植結果は全10人で劣らない。また、腫瘍移植前のマトリゲルにおける組織のインキュベーションは、生着率12を有意に増加させる。我々は、明確な病理学的発見および誤って収集された組織標本の即時処分に続く遅延生着をお勧めします。一次生着の成功率は、レシピエントマウスの免疫不全に伴って増加するため、我々は非常に最初のPDX通過のためにNSGマウスを使用する傾向がある。最初の成功したPDXの生着の後、NMRInu/nuマウスは、その後の通路および組織拡張に使用され、使用されるべきである。この株は、NSGまたは同様の免疫不全株に比べて、より堅牢で安価で繁殖が容易であるが、それでも合理的な生着率を示す。さらに、そのヌードは、移植および腫瘍増殖モニタリングを促進する。その後の通路での生着率を高めるために、特に成長が遅いPDXおよび低い原発生成功率を有する症例のために、可能な限り採取したばかりのPDX組織を宿主マウスに直接移すことをお勧めします。コリンズとラングは最近、大腸PDX確立の14の研究を見直し、PDXの確立率の中央値が68%で14〜100%の異なる生着率を報告し、後者は我々の知見13と一致している。文献に沿って、我々は、大腸癌PDX14と比較して膵臓の確立率が低い観察した。宿主マウス株および腫瘍実体に関わらず、ヒトの成長は、エプスタイン・バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫および移植側のマウスリンパ腫が重要な落とし穴15、16をもたらす。認識されない場合、このような腫瘍は、後続の通路を「汚染」し、連続した結果を混乱させる可能性があります。子宮頸部、腋窩およびインジナーリンパ節の異常な速いPDX成長および腫脹は、マウスリンパ腫の成長の強力な指標であるが、PDXの規則的な組織学的検査はそれにもかかわらず推奨される。さらに、PDXと対応するドナー患者との間の遺伝的一相関は、STR-分析によって定期的に検査されるべきである。理想的には、バイオバンクは、患者の特性(一般情報、生存、再発自由生存、治療、二次新生物など)を含む臨床データベースにリンクされるべきである。プライバシー保護の法的規制とそのような匿名化されたデータ・ベースの欠如のために、当社の臨床データセットは定期的に管理され、協力医師によって手動で更新されます。
従来のバイオバンクは天文台の研究に限られていますが、生きたバイオバンクはインビトロとインビボ介入の機会を提供します。患者由来細胞株は、基礎研究、ハイスループット薬物スクリーニング、新薬薬剤4の評価のための重要なツールである。しかし、対応するPDXモデルは、元の腫瘍17,18の組織学を密接に再現し、いくつかの通路19,20に対して高い遺伝的安定性を示すため、重要性が増している。私たちのPDXバイオバンクは、前臨床と基礎研究6、21のための優れたプラットフォームとして自分自身を証明しています。さらに、PDXコレクションは患者集団の個人間不均一性を十分に反映しているため、PDX臨床試験(PCT)アプローチ(1つの治療につき1つの動物)は、新薬およびコンビナトリアルレジメン8に対する臨床的反応の忠実な予測を可能にするので、薬剤開発において重要となっている。また、現在、小規模なPCT試験で新しい実験薬を評価しています。
これらの有望な結果にもかかわらず、12.2ヶ月の中央値の樹立期間は、抗癌治療選択肢をテストするための「アバターマウス」としてPDXモデルの臨床適用性を妨げる、少なくとも即時アジュバントまたはネオアジュバント治療22を必要としている患者に対しては。標準的なPDXモデルの追加の欠点は、宿主マウスの免疫不全による免疫療法試験のユーザビリティの欠如である。これらの制限を克服するために、いくつかの「ヒト化された」マウス株が開発されている。これらのマウスは、免疫不全性が大きく、PDXの成長23に続く様々なタイプのヒト骨髄由来細胞またはCD34+造血幹細胞と再構成することができるが、免疫チェックポイント阻害剤治療24,25に対するリンパ球媒介性細胞傷害性および治療応答の評価を可能にする。
近年、PDXと競合する重要ながんモデルとして患者由来オルガノイド(PDO)が登場しました。無傷の腫瘍片に由来し、細胞外マトリックス足場で培養されたこれらの三次元構造は、元の腫瘍の組織学的および遺伝的特性を密接に反映している。長期にわたる拡大と凍結保存の可能性は、PDOを生きたバイオバンク26,27の理想的なサプリメントにします。比較的高い確立率に加えて、いくつかの腫瘍実体28のPDOに対する信頼できる薬物応答予測が報告されている。また、PPOは循環腫瘍細胞からも生成されており、また、対応する健康組織からのオルガノイドの同時樹立も可能であり、患者個人ベース29,30での治療関連毒性の評価を可能にする。しかしながら、従来の2D細胞培養物と比較して、オルガノイド培養は時間と資源を消費し、人工的な細胞外マトリックス化合物は、特定の分析手順31を妨害し得る。また、癌オルガノイドは、健康上皮30に由来する、より速く増殖する非悪性オルガノイドによって過剰増殖を受けやすい。ストロマ、血管および免疫細胞の不足のために、PPOはほとんど抗血管新生免疫療法剤のテストには適用されません。しかし、新しい培養法は、腫瘍微小環境のモデル化をvitroで可能にし、PPOをPDXモデル32の真の候補にする。近い将来、患者と個々の腫瘍モデルは、次世代シーケンシングのような強力な遺伝的ツールと組み合わせることで、真の精密医療とカスタマイズされた治療アプローチへの道を開くことを願っています。

近年、がんの形態学的、臨床的、遺伝的特性に関する蓄積された知識が、異種の個々の疾患としての癌の概念につながった。その結果、新生物の変異特性は、臨床的および病理学的特徴に加えて、臨床意思決定の重要性を増し、様々な分子変化のために多くの標的療法が開発された。例えば、大腸癌治療におけるセツキシマブの効力は 、KRASおよびPIK3CA 突然変異状態1の分析によって予測することができる。精密医療は、各患者で最高の治療応答を提供し、効果の及び治療の毒性を回避するためのカスタマイズされたアプローチを目指しています2.バイオバンクは、臨床データにリンクされているがん患者の組織、血液および他の生物学的材料を含み、したがって、翻訳癌研究のための優れたツールです。臨床サンプルの数が多いため、バイオバンクは、個々の患者3に新しい治療機会を提供する稀だが潜在的に薬物性の突然変異の検出を可能にする。
腫瘍学的研究スペクトルを可能な限り広くカバーするために、我々はサンプル採取だけに関する活動を抑制するのではなく、患者由来の癌細胞株および異種移植片(PDX)の確立に焦点を当てた。従来の2D細胞株は、インビトロ研究の礎石であり、大規模な薬物スクリーニングのための主要な選択肢である4、5。さらに、細胞株分析は、多くの場合、より簡単で安価で、より容易に入手できます。さらに、患者由来末梢血リンパ球(PBL)が利用可能であるため、腫瘍免疫学もvitro6で研究することができる。しかしながら、インビトロまたはインビボ実験に基づく細胞ベースで有望な前臨床効果を有する新開発薬の大半は、臨床試験7で失望的な結果を示している。対照的に、インビボ研究におけるPDXに基づく前臨床試験は、抗腫瘍剤の臨床活性をより忠実に反映している8.PDX組織はドナー腫瘍の組織学的および分子的性質を密接に反映しているため、PDXモデルは、バイオバンクの完全性を維持し、研究グループと機関間のサンプル交換を可能にするために、しばしば非常に限られた量の生存可能な腫瘍組織を伝播させる良い方法である。また、PDX組織に由来するがん細胞株は、原発癌細胞株9よりも有意に容易に確立できる。近年、当研究室では、問題の全生物試料のワークフローを段階的に標準化・最適化することにより、総合的な大腸がん・膵臓がんバイオバンクを総合的に構築しています(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> 図1: バイオバンクのワークフローと組織 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">は、こちらをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacillol&#174; AF; 1L</td>
			<td>Bode, Hartmann</td>
			<td>REF 973380</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 15ml; sterile</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>GBO Cat. No.:188271</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 50ml, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Order number: 62.547.254</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 20ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 300296</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Item number: 01.1601</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological Pipette 10ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 86.1254.001</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy ratiolab&#174; accupetta</td>
			<td>Ratiolab</td>
			<td>Item number: RL3200300</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>VWR Cat.No: 613-4438</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS; w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-36500</td>
			<td>washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll human</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-60500</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-41500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P40-47500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-80100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P10-023100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>VWR Cat.No: A3672.0250</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)</td>
			<td>selfmade</td>
			<td>---</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotube- CryoPure 2ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well cell culture plate; steril; with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>Cat.-No.: 657 160</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Cat. No.: 82.1472.001</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blades</td>
			<td>B.Braun (Aesculap)</td>
			<td>REF BB510</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309110</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer; yellow; 100&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF 352360</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>biocision</td>
			<td>Item number: 210004</td>
			<td>cooling container with -1&#176;C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar&#160;transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm</td>
			<td>KGW</td>
			<td>Cat. No.: HT39.1</td>
			<td>transport system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.760.002</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.762.411</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200&#181;l, yellow</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.082</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000&#181;l, blue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.120</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator&#160; BB 6220 CU</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat.-No.: 51012839</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating plate PR&#196;ZITHERM</td>
			<td>Harry Gestigkeit GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Zeiss Primo Vert</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>Serial number. 3842000839</td>
			<td>imaging cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench Safe flow 1.8 nunc</td>
			<td>nunc GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>---</td>
			<td>sterile working bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer -80&#176;C</td>
			<td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance MP-300</td>
			<td>Chyo</td>
			<td>---</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine, U100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 324826</td>
			<td>injection anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%; 25ml</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>approval number: 6293841.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td>
			<td>CP-Pharma GmbH</td>
			<td>approval number: 401650.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GES3S Reader</td>
			<td>Datamars</td>
			<td>not available</td>
			<td>RFID reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td>
			<td>Peddymark</td>
			<td>---</td>
			<td>RFID chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotrim-ratiopharm&#174;&#160;Ampullen SF 480&#160;mg/5&#160;ml</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>PZN-03928197</td>
			<td>antibiotic drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate #FM-20 42x28cm</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Electric Petra, Burgau</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>PZN-01578675</td>
			<td>Eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anatomical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD21 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD50 1 R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BC05 6R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle&#160;holder</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BH1 1 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>XN8870.P32</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opsite moisture vapour permable spray dressing</td>
			<td>Smith&#38;Nephew</td>
			<td>REF 66004978, PZN- 02063507</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aperture drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>REF 904622</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze swap Gazin&#174;; steril; 10x10 cm</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 18506</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raucotupf cotton tipped applicators</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 11969</td>
			<td>applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat.-No.: 354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>Item number: 18839</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#174; Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>Order No.:130-100-008</td>
			<td>storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formafix 4%</td>
			<td>Grimm med. Logistik GmbH</td>
			<td>Item number: F10010G</td>
			<td>fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software FreezerworksBasic</td>
			<td>Dataworks Development, Inc</td>
			<td>---</td>
			<td>sample organization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra TLP 2844 printer</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>---</td>
			<td>label printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation and maintenance of a living biobank - how we do it

個人間の特性と癌の異質性に関する知識の高まりを踏まえて、パーソナライズされた医療の新しい分野には、前臨床研究のためのプラットフォームが必要です。近年、我々は、原発性腫瘍組織、正常組織、血清、単離末梢血リンパ球(PBL)、患者由来の異種移植片(PDX)、ならびに原発および二次癌細胞株からなる大腸癌および膵臓癌のバイオバンクを確立した。元の腫瘍組織は限られており、原発癌細胞株の樹立率は依然として比較的低いため、PDXはバイオバンクの保存と拡張だけでなく、二次癌細胞株の生成も可能にする。さらに、PDXモデルは前臨床薬物検査のための理想的な in vivo モデルであると証明されている。しかし、バイオバンキングには慎重な準備、厳格なガイドライン、十分に調整されたインフラストラクチャが必要です。受痛病、十二指腸不全切起切除術または切除された転移標本は、切除後直ちに採取され、病理部に移される。偏りのない病理組織学的報告の優先順位を尊重し、解剖を行う病理医の裁量で、小さな腫瘍片および非腫瘍組織が収穫される。 
壊死部分は廃棄され、残りの腫瘍組織は小さく、同一の立方体に切断され、後で使用するために凍結保存される。さらに、腫瘍のごく一部は、原発癌細胞培養のために細かく、緊張している。さらに、術前および術後に患者から採取された血液サンプルは、血清およびPDLを得るために処理される。PDX生着の場合、凍結保存標本は解凍され、免疫不全マウスの側面に皮下に移植される。得られたPDXは、「ドナー」腫瘍の組織学を密接に再現し、その後の異種移植または後で使用するために凍結保存に使用することができる。以下の研究では、大腸癌および膵臓癌の大型バイオバンクの作成、維持および投与の個々のステップについて説明する。さらに、バイオバンキングに関連する重要な詳細と注意事項を強調します。

我々の手では、一次細胞培養の確立率(図2A及びB)は、大きなシリーズ9で12.9%であった。新しい外科的切除標本から拡張可能な腫瘍細胞を単離する試みの大半は、成長または早期汚染の欠如のために失敗した。細胞株の樹立は、標準的な培養条件下で着実に成長した3つの通路(DMEM、10%FCS、標準培養容器)およびFACS解析10を介した上皮分化の検証の後に成功したと考えられた。PDX腫瘍に由来する細胞株(図2C&D)は、原発性切除腫瘍9とは対照的に反復試みの可能性に起因する23.6%の高い確立率を示した。しかしながら、いくつかの混合培養物(図2E)は線維芽細胞の成長から解放されることも、線維芽細胞の過剰増殖のためにも失われる(図2F)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> 図2:細胞培養原発癌細胞株は、大腸癌症例HROC313の転移に由来し、継腸21(A)及び膵臓癌症例HROP88、通過5(B)に由来する。PDX由来癌細胞株は、大腸PDX HROC285 T0 M2(D)および膵臓PDX HROP10 T5 M2、パッセージ4(E)膵臓癌HROP75由来の線維芽細胞と癌細胞の混合培養、継代8(C)及び線維芽細胞過剰増殖(F)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
PDX生成プロトコルの変化を考慮すると、使用されたマウス株および数年間の実験者、ならびに生着に利用可能な腫瘍組織の量の大きな違いは、PDX生成の全体的な成功率を与えることを容易ではない。2人の研究者(S.MとF.B)によって行われた非常に最近の一連のPDX生成実験では、大腸PDXの63%の一次成長率(例示的な神学は 図3Aから描写することができる)および膵臓PDX(図3B)の48%が観察された。移植部位におけるマウスまたはヒトリンパ腫の成長は比較的まれであるが、PDXの増殖を模倣することができる(図3C)。組織病理学的検査とは別に、PDXモデルとそのドナー患者との間の一致は、短いタンデム反復(STR)分析によって定期的に確認された(図3D)。現在、バイオバンクは>50原発および>50二次大腸、3つの一次および6つの二次膵臓癌細胞株ならびに>150大腸および19の膵臓PDXモデルから成る。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> 図3:大腸(A)と膵臓PDX(B)の代表的な組織学的比較。PDXの成長を模倣する移植部位におけるヒトリンパ腫(C)。PDXモデル(HROC430 T1 M2)を元の患者腫瘍組織(HROC430Tu)に対する遺伝子識別試験を、短いタンデム反復(STR)解析による。9つのSTR遺伝子座、vWA、THO1、TPOX、CSF1 PO(FAM色素)およびD5S818、D13S317、D7S820、D16S539(HEX色素)の比較は、多重PCRを用いて、ケイピラ電気泳動症およびドナー(PDXおよびD(腫瘍)の遺伝的コンコーダンスを確認した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

以下の研究では、大腸癌および膵臓癌の大型バイオバンクの確立に必要な連続したステップについて述べています。

生きたバイオバンクの創造と維持 - 私たちはそれを行う方法

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

私たちがそれを行う方法を生きているバイオバンクの作成とメンテナンス。紹介。従来のバイオバンクは、一般的に生存不可能な組織および血液サンプルを含む。がん患者集団の多様性を十分に反映し、遺伝的および組織学的分析を可能にするにもかかわらず、治療戦略を評価する前臨床アッセイには適していない。また、患者由来モデルを統合するバイオバンクは、これらの制限を克服します。このように精密医療のための機能試験を可能にする。サンプル取得。大腸癌および膵臓癌のバイオバンキングのために、証明された診断と十分な腫瘍サイズを有する症例を選出し、患者の情報に基づいた短所が必須である。手術開始前に、ヘパリン化注射器を使用して20mlの血液を引き出し、血清モノベットで7.5mlを追加します。血清処理とPBL分離。1で遠心分離した後、128 RCFは4度で15分間、血清を事前に標識されたクライオチューブでアリクォートし、液体窒素に直接沈める。ヘパリン化された血液をポリプロピレンチューブに移し、15mlPBSで希釈する。血清ピペットを使用して、15mlパンコルでゆっくりと混合物を下敷きにします。密度勾配遠心分離後、単核細胞を含む不透明層を血清ピペットで取り上げ、新しいPPチューブに移す。PBSで洗浄し、遠心分離によって単核細胞をペレット化した後、上清を捨て、冷凍培地中のペレットを再懸濁し、事前にラベル付けされたクライオチューブに分配する。1分あたり1度でゆっくりと凍結するのに適した冷却容器にチューブを移し、80度で一時的に保管してください。組織処理。組織標本が外科医によって切除されるとすぐに、適切な容器に入れる。組織がホルマリンで覆われているすべての状況下で避けてください。切除マージンの病理評価に関係ない腫瘍材料の切除のための病理にできるだけ速く輸送する。腫瘍片は、できるだけ無菌として扱われるべきである。さらに、健康な組織の標本を得て、氷の上に組織貯蔵溶液をあらかじめ充填した別々のチューブに両方を入れる。すぐにラボに戻り、滅菌条件下で組織処理を開始します。組織片は、乾燥を避けるために、組織貯蔵溶液で満たされた滅菌プラスチック皿の上に置かれます。まず、得られた組織標本の大きさに応じて、凍結をスナップするための1つ以上のピンヘッドサイズの部分を物品切りする。ネイティブ組織を事前に標識されたクライオチューブに入れ、液体窒素にすぐに沈めます。残りの組織を3立方ミリメートルで3立方体に切ります。壊死組織は完全に解剖されなければならないが、廃棄すべきではないことを考慮に入れて.四足立方体を 4 つに並べて、重要な保管のためのアリコートの数を決定します。適切な数の凍結チューブにラベルを付け、それぞれ1.5ml冷凍培地で事前に充填します。冷凍媒体中のDMSOは細胞毒性であるので、次のステップを迅速かつ中断することなく行う。チューブあたり4つのティッシュ片をすくうためにメスの刃を使用してください。すべての部分が理想的にはチューブの底に冷凍媒体に完全に沈め、凍結容器を使用してチューブを急速に凍結することを確認してください。健康な標本と同じように進みます。長期保存のために、液体窒素タンク内のすべてのアリクォートを保管してください。細胞培養。できるだけ小さいメスの刃を持つ壊死部分を含む腫瘍組織処理の残骸を粉砕する。細胞ストレーナーを滅菌PPチューブの上部に置き、細胞ストレーナーを通過するために血清ピペットで懸濁液を吸引します。単一の使用シリンジのプランジャーを使用して、細胞ストレーナーを通して残る組織を押して、単一の細胞懸濁液を生成する。PBSでリンスし、材料が残らなくなるまでこれらの手順を繰り返します。細胞ストレーナーを取り出し、180 RCFで7分間懸濁液を遠心分離します。その間、異なる培地組成物を備えたコラーゲンプレコートされた6ウェルプレートを準備して、腫瘍の成長の確率を高めます。上清を捨て、PBSでペレットを再懸濁し、1ウェルあたり500マイクロリットルを分配します。その後、プレートを標準インキュベーターに入れる。患者由来異種移植片の生成。免疫不全マウスにおける患者由来の異種移植片の生成のために、動物は特定の病原体のない環境で飼われるべきである。スクラブ、エプロン、フェイスマスク、ヘアカバー、手袋からなる個人用保護具を着用してください。ワークスペースを配置した後、液体窒素容器から欲求腫瘍標本を取る。35ml PBSで新鮮なPPチューブを充填し、慎重に解凍プロセスを洗浄し、クライオチューブを上下に傾けます。内容物がスラッシーになるとすぐに、PBSに注ぎ、腫瘍片をすすいだ。PBS の大部分を破棄し、キューブをふたの中に空にします。アイスパックに無菌プラスチック皿を置き、100マイクロリットルマトリゲルの液滴を追加します。鉗子を使用してマトリゲルに腫瘍片を入れ、腫瘍を10分間インキュベートする。その間に、2匹のマウスを麻酔する。動物の足をつまんで麻酔の深さを確認してください。任意の動きは、不十分な麻酔を示し、いくつかの待っているか、追加のドージングを必要とします.目の軟膏を塗布し、首でマウスをつまみ、マイクロチップを皮下に注入する。次の手順を並行して実行します。マウスの側面を消毒し、ストライプメッツェンバウムはさみで小さな皮膚切開を行い、鈍い調製によって皮下ポケットを形成する。解剖鉗子を使用して腫瘍片を挿入する。ピースがスキンポケットの後端に置かれておきます。残りのマトリゲルを吸引し、4つのポケットすべてに均等に分配します。ゲルの治癒を待ち、針で腫瘍片を損傷することなく、単一のボタン縫合で皮膚を閉じます。結び目の上にできるだけ短く糸をカットし、縫合糸のうずくまを防ぐためにスプレードレッシングを適用します。マイクロチップをスキャンし、後で動物を識別するためにデータベースに腫瘍情報を追加します。新鮮な寝具とネスティング材料でケージを準備し、赤外線ランプの前にマウスを置き、麻酔が治まるまで動物を監視します。PDXの排泄物。PDX腫瘍が必要なサイズに達した後、マウスはCO2窒息とその後の子宮頸部脱臼によって安楽死させる。慎重に腫瘍から皮膚を解剖し、PDXを完全に除去する。代表結果。無菌プラスチック皿に腫瘍を置き、さらに処理するために無菌メスの刃を使用してください。スライスで穴をカットし、それらを組織学的カセットに入れ、ホルマリンに沈め、後で組織学的評価のためにパラフィン埋め込まれた標本を生成する。腫瘍の残りの部分を組織貯蔵溶液に移し、バイオバンク用の新しい重要に保存され、凍結した標本を作成する。さらに、第二次腫瘍細胞株を確立するために、章細胞培養に類似したPDX腫瘍の残存を使用する。さらにPDXを生成するには、前に示したように、マトリゲルを用いた2つ以上の腫瘍片を新しいレシピエントマウスに移す。結論。これまでに提示されたプロトコルによって、我々はこれまでに9膵臓および100以上の大腸患者由来の癌細胞株、ならびに19の膵臓および150以上の大腸PDXモデルを確立することができた。

Research

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Cancer Research

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