Name: creation and maintenance of a living biobank - how we do it
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

Vi anerkjenner Jenny Burmeister, vår grafiske assistent, for opptak og redigering av videoen. Videre takker vi våre kolleger av kirurgisk og patologisk avdeling for det langvarige samarbeidet. Vi vil også takke Marcus Müller, produksjonsleder for IT- og mediesenteret, Universitetet i Rostock, for å ha levert lydopptaksutstyret og raffinering av lydkvaliteten.
FINANSIERING: Den tyske Cancer Aid Foundation (DKH e.V.), tilskudd nummer 108446, og tilskudd nummer TBI-V-1-241-VBW-084 fra staten Mecklenburg-Vorpommern delvis finansiert denne forskningen.

Følgende studie er godkjent av den institusjonelle gjennomgangsstyret ved University Medical Center Rostock (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 og A 2019-0222). Videre har alle veterinærrelevante prosedyrer blitt godkjent av Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern under registreringsnumrene LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 og 7221.3-1-007/19.
1. Eksperimentelle forutsetninger
<ol><li>Oppfyller flere viktige rammebetingelser for å etablere og vedlikeholde en biobank.<ol>
<li>Bruk en klinikk med kirurgisk avdeling og tilstrekkelig antall onkologiske reseksjoner sammen med et velutstyrt laboratorium og tilstrekkelig akademisk personell. En god infrastruktur og en fast kontakt med en samarbeidende patologiavdeling er ytterligere forutsetninger.</li>
		<li>For in vivo forskning, bruk et dyreanlegg med boligforhold som passer til immunsviktfulle mus.</li>
		<li>Få autorisasjon til enhver forskning på pasientavledet materiale fra en helse- og etikkkomité. Få godkjenning på eventuell in vivo forskning fra den kompetente myndighet i henhold til lokale lovbestemte forskrifter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Eksempelsamling
<ol><li>Dagen før operasjonen<ol>
<li>Evaluer alle pasienter med resectable kolorektal eller bukspyttkjertelkreft og/eller tilsvarende metastaser for biobankberettigelse. Unngå å inkludere tilfeller med neoadjuvant forbehandling, svært små svulster, svulster med usikker verdighet eller lesjoner som delvis har blitt resected endoskopisk før.</li>
		<li>Få skriftlig godkjenning av deltakelse fra pasienten under den informerte samtykkediskusjonen om den kirurgiske prosedyren. Informer betidelig alle involverte kirurger, laboratorieteamet samt patologen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksempel på oppkjøp<ol>
<li>Informer alle ledsagere i operasjonsrommet (OR) om vevssamlingen for biobanken umiddelbart før starten av kirurgisk prosedyre. MERK: Det er avgjørende at vevet ikke må festes i formalin. Hvis vevet er nedsenket i formalin, blir det uegnet for integrert biobanking.</li>
		<li>Tegn 40 ml heparinisert blod (2 x 20 ml sprøyte) samt et standard 7,5 ml serumrør umiddelbart etter bedøvelsesinduksjon og overfør raskt til laboratoriet for PBL-isolasjon og serumbehandling (se trinn 3-4).</li>
		<li>Få den nye prøven direkte fra operasjonsbordet, plasser den i en passende beholder og ta den med til den patologiske avdelingen. Skriv ned tidspunktet for løsrivelse fra sirkulasjon, reseksjon og ankomst til patologi. MERK: Prøvens egnethet for biobank bør vurderes av den samarbeidende patologen som dissekerer et stykke svulst og ikke-ondartet vev. Ikke del noen deler av prøven selv som kan kompromittere den påfølgende patologiske rapporten.</li>
		<li>Legg begge vevsbitene i et separat 15 til 50 ml polypropylenrør med 10 til 30 ml vevlagringsløsning (eller DPBS) på is. Skriv ned tidspunktet for mottaket og overfør prøvene umiddelbart til laboratoriet. MERK: Følgende protokolltrinn 3-6 må utføres i et laminært strømningskabinett under strenge sterile forhold. Bruk alle væsker ved romtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Serumbehandling
<ol><li>Sentrifuger 7,5 ml serumrør ved 1128 x g og 4 °C i 15 min i en forhåndskjølt sentrifuge.</li>
	<li>Aliquot 1 ml serum per rør i forhåndsmerkede kryorør og fryse i flytende nitrogen.</li>
</ol>4. Isolering av PBL ved tetthetsgradering sentrifugering
MERK: Strikk parallelt med hver av de to 20 ml sprøytene.
<ol><li>Fyll 20 ml heparinisert blod i et 50 ml polypropylenrør og tilsett 15 ml DPBS.</li>
	<li>Ta 15 ml Pancoll med en serologisk pipette, sett pipetten forsiktig helt til bunnen av polypropylenrøret og slipp Pancoll veldig sakte for å danne et lag under blod /DBPS-kolonnen.</li>
	<li>Sentrifuge ved 375 x g i 15 min uten brems. </li>
	<li>Aspirer og overfør det ugjennomsiktige interfaselaget mellom midten og toppkolonnen av begge prøvene til et friskt 50 ml polypropylenrør og fyll opp med DPBS til 50 ml.</li>
	<li>Sentrifuge ved 270 x g i 15 min med brems. </li>
	<li>Aspirer og kast det overnaturlige, resuspend cellepellet i 4,5 ml frysemedium.</li>
	<li>Aliquot 1,5 ml suspensjon per kryorør, lukk rørene tett og legg dem i en frysebeholder egnet for langsom frysing og oppbevar ved -80 °C.</li>
</ol>5. Vev behandling
MERK: Start med generering av snap frosne prøver av svulst og sunt vev for å opprettholde integriteten til nukleinsyrer.
<ol><li>Tumor vev prøve<ol>
<li>Overfør tumorprøven med flere ml vevlagringsløsning fra polypropylenrøret til en petriskål. Skyll med DPBS om nødvendig. Unngå å berøre prøven og bruk to sterile skalpeller for å håndtere vevet. Unngå utskalking når som helst.</li>
		<li>Veie tumorprøven på en praktisk skala i en egen tallerken og noter vevsvekten.</li>
		<li>Evaluer størrelsen, formen og vevskvaliteten på tumorvevet før skjæring. Mål å få minst ett stykke om størrelsen på et pinhead for snap frysing og fire terninger på ca. 30 mm3 (kantlengde 3 x 3x 3 mm) hver for vital kryopreservation. Generer så mange 30 mm3-kuber i firedoble som mulig og generere ett stykke for snap frysing per 5 firemannsrom. Ta også hensyn til at nekrotiske deler må kuttes av slik at kuber bare består av vitalt vev.</li>
		<li>Generer skiver av 3 mm tykkelse. Klipp av nekrotiske porsjoner, skilles som gellignende eller flytende masse, og kutt skivene i terninger av de to ønskede størrelsene. MERK: Ikke kast noe vev på dette tidspunktet.
</li>
		<li>Snap frysing<ol>
<li>Merk kryorør tilsvarende (se trinn 7.7).</li>
			<li>Legg ett lite vevsstykke per forhåndsmerket kryotube. Senk prøvene umiddelbart ned i flytende nitrogen i flere minutter og oppbevar ved -80 °C senere.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kryopreservasjon av vitalt vev<ol>
<li>Merk kryorør tilsvarende (se trinn 7.7) og fyll hver med 1,5 ml frysemedium. Plasser frysebeholderen ved siden av benken. MERK: Følg de neste trinnene så raskt som mulig. Siden DMSO i frysemediet har cytotoksiske egenskaper, bør tiden for vevet som senkes ned i frysemediet uten riktig kjøling ikke overstige 2 minutter.</li>
			<li>Ordne 30 mm3 terninger i firemannsrom. Dytt nekrotisk vev og andre rester til kanten av parabolen, men ikke kast dem.</li>
			<li>Øse terningene med skalpellbladet og overfør 4 terninger per kryorør. Pass på at svulstbitene er helt nedsenket i frysemediet. Lukk rørene tett og legg dem i en frysebeholder som er egnet for langsom frysing og oppbevares i en -80 °C fryser.</li>
			<li>Overfør kryorør til et egnet lagringssystem for langtidslagring ved -140 °C eller lavere. Dokumentasjon i laboratorielagerstyringssystemet er obligatorisk.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sunn vevsprøve: Gjenta trinn 5.1.1. til 5,1,6,4 for den friske vevsprøven.</li>
</ol>6. Primær cellekultur
<ol><li>Oppløse restene av tumorvevet, inkludert nekrotisk skrap, i petriskålen med skalpellene i stykker så små som mulig.</li>
	<li>Plasser en steril cellesil (100 μm porestørrelse) på toppen av et 50 ml polypropylenrør.</li>
	<li>Bruk en serologisk pipette til å legge til 5-10 ml DPBS til petriskålen, flyte vevsrester og pipette opp og ned for å generere en suspensjon.</li>
	<li>Overfør suspensjonen med pipetten til cellesilen.</li>
	<li>Gjenta trinn 6.3-6.4 til alle vevsrester er løst fra petriskålen.</li>
	<li>Bruk stempelet på en 20 ml enveissprøyte for å klemme celle- og vevssuspensjonen gjennom cellesilen.</li>
	<li>Skyll med 5-10 ml frisk DPBS, kast cellesilen og lukk røret riktig.</li>
	<li>Sentrifuger suspensjonen ved 180 x g i 5-10 minutter.</li>
	<li>Forbered en kollagen-I precoated 6 brønnplate med 1,5 ml medium per brønn.</li>
	<li>Aspirer og kast det overnaturlige. Bruk pelleten i 3 ml DPBS eller medium og tilsett 500 μL av suspensjonen til hver brønn. Plasser platen i inkubatoren (100 % fuktighet, 5 % CO2,37 °C)</li>
	<li>Overvåk platen daglig for cellevekst og forurensning. MERK: Ytterligere celle culturing opp til etablering av en permanent cellelinje er ikke beskrevet her.</li>
</ol>7. PDX-generasjon
<ol><li>Gjennomføre eksperimenterbare ved passende kvalifiserte personer som oppfyller kravene til den kompetente myndigheten i din jurisdiksjon.</li>
	<li>Hus immunsviktelige mus under spesifikke patogenfrie (SPF) forhold som tilfredsstiller kravene til den brukte musestammen. De hygieniske tiltakene inkluderer individuelt ventilerte bur, autoklavet mat, vann og hekkende materiale, samt en sikkerhetsluftlås og bruk av personlig, verneutstyr.</li>
	<li>Autoklav alle instrumenter på forhånd og bruk bare ett sett med instrumenter for hver svulst sak for å unngå krysskontaminering. Håndter tumorvevet så aseptisk som mulig. Alle plastiske gjenstander som er navngitt nedenfor skal være sterile, engangsbruk og kassert etter hver operasjon. MERK: Bestemmes av metoden for frysing av fire tumorvevsstykker per kryorør, krever PDX-generasjonen alltid to mus per prøve, noe som ideelt sett resulterer i fire PDX-svulster.</li>
	<li>Velg ønsket primærsvulst for engraftment via laboratorielagerstyringssystemet og overfør prøven (vitalt bevart tumorvev) fra hovedlagertanken til en bærbar flytende nitrogenbeholder (Mellomlagring ved -80 °C på tørris er også praktisk).</li>
	<li>Ta på deg personlig verneutstyr før du går inn i SPF-seksjonen (skrubb, tresko, forkle, hårdeksel, kirurgisk maske og oversko), desinfiser hendene og alt utstyr.</li>
	<li>Matrigel soaking<ol>
<li>Fjern kryorøret fra den flytende nitrogenbeholderen og avvent tining av prøven.</li>
		<li>Merk et 50 ml polypropylenrør og fyll med 35 ml DPBS.</li>
		<li>Vipp kryorøret opp og ned og overfør innholdet umiddelbart til polypropylenrøret så snart vev-medium-slush kan skiftes. Skyll forsiktig tumorvevsbitene, kast hovedvolumet fra røret i et eget fartøy, lukk lokket og legg røret opp ned, slik at de fire vevsbitene samles i lokket.</li>
		<li>Sett en petriskål på kjøleakkumulatoren og legg 100 μL Matrigel som en enkelt dråpe i midten. Bruk anatomiske tang for å overføre svulstbitene til Matrigel. Pass på at hver brikke er dekket helt med Matrigel. Inkuber i 10 minutter ved 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Mus anestesi (2 mus per prøve, arbeid parallelt)<ol>
<li>Forbered en 3:1- lager av ketamin (100 mg / ml) og xylazin (20 mg / ml) bedøvelsesløsning. Anbefalt dose er 90/6 mg/kg kroppsvekt.</li>
		<li>Vei musen og trekk opp den nødvendige bedøvelsesoppløsningen i en engangsinsprøyte.</li>
		<li>Plasser musen på burets rutenett, trekk halen forsiktig med den ene hånden for å indusere en fremadrettet bevegelse og samtidig krabbe nakken med et klypegrep av den andre hånden. Løft musen i rutenettet og vri holdehånden, slik at dyrets rygg hviler på håndflaten. Immobilisere en av bakbenene med pinky og injisere narkotika intraperitoneally. Sett musen tilbake til buret og avvent narkotisk induksjon.</li>
		<li>Plasser den bedøvede musen på varmeplaten og dekk øynene med salve for å unngå hornhinneskade. Asses dybden av anestesi ved å forsiktig klemme baksiden av musen med kirurgiske tang. MERK: Fravær av bevegelse indikerer dyp narkose. Enhver form for bevegelse krever enten mer tid for å nå ønsket narkodybde eller en ekstra dose anestetika.</li>
	</ol></li>
	<li>Kirurgisk prosedyre<ol>
<li>Lag en hudfold ved å klemme musens hals og injiser mikrobrikken subkutant med applikatoren (Se trinn 9 for programmeringsdetaljer)</li>
		<li>Barbere musens flanker om nødvendig (NMRInu/nu mus krever ikke barbering), påfør povidon-jod med en bomullspinne og bruk kirurgisk drapering for å skape et sterilt felt.</li>
		<li>Løft huden på flanken med kirurgiske tang, lag et lite snitt på ca 4 mm og danner en liten subkutant lomme ved sløv forberedelse med saks.</li>
		<li>Sett ett tumorstykke i hver lomme og plasser den i bakenden.</li>
		<li>Klip enden av en 100 μL pipettespiss og aspirer den gjenværende Matrigel fra petriskålen og påfør den likt i hver hudlomme.</li>
		<li>Lukk sårene med enkle avbrutte suturer og påfør spraydressing.</li>
	</ol></li>
	<li>Skann mikrobrikken og kontroller gyldigheten av mus- og tumor-ID.</li>
	<li>Forbered et nytt bur med friskt sengetøy og hekkemateriale, samt en gnagepinne. Brett en "pute" ut av papirhåndklær og legg ned musen med forhøyet hode under en infrarød varmelampe.</li>
	<li>Bland 0,25 ml trimethoprim/sulfametoksazol (400 mg/80 mg) med 100 ml drikkevann og administrer via drikkeflasken. Tenk på at en mus bruker ca 150 ml per kg kroppsvekt daglig. MERK: Siden den subkutane PDX-modellen ikke er forbundet med postoperativ smerte, verken under sårhelingsprosessen eller under tumorvekst, er det ikke nødvendig med postoperativ analgesi. Vær oppmerksom på at retningslinjene for dyrevelferd for institusjonen/myndigheten din kan variere.</li>
	<li>Overvåking av eksperimentelle dyr<ol>
<li>Overvåk musene daglig for tegn på nød. Dette kan delegeres til kvalifiserte dyrevaktmestere.</li>
		<li>Hold opp den postoperative antibiotikabehandlingen med den nevnte dosen i 4 uker. Bytt antibiotikablandingen to ganger i uken.</li>
		<li>Mål tumorstørrelsen minst en gang i uken, ideelt daglig, med en kaliper (tumorvolum = 0,52 x lengde x bredde x høyde [mm3]) og ta opp i databasen.</li>
	</ol></li>
</ol>8. PDX høsting og prosessering
<ol><li>Høst og behandle PDX-svulsten, når: Tumorstørrelsen når målvolumet på 1,500 mm3. Svulstbærende dyr viser tegn på nød og / eller sykdom og behandling er nytteløst. Svulsten blir ulcerated eller trenger inn i musens hud.</li>
	<li>Les ut mikrobrikken for å identifisere riktig PDX.</li>
	<li>Euthanize musen ved hjelp av en juridisk metode (avhengig av nasjonale retningslinjer) som for eksempel CO2-kvelningeller ketamin / xylazin injeksjon etterfulgt av cervical forvridning.</li>
	<li>Løft huden med kirurgiske tang på flankene og incise med Metzenbaum saks noen få millimeter fjernt fra svulsten.</li>
	<li>Løsne huden over svulsten ved sløv forberedelse, og ta forsiktig tak i svulsten med anatomiske tang og løsne svulsten fra kroppens overfladiske fascia.</li>
	<li>Skyll svulsten med DPBS, legg den i en petriskål og fjern tilstøtende bindevev.</li>
	<li>Utfør på dette tidspunktet ett av følgende:<ol>
<li>Klipp 30 mm3 kuber og opprett ny PDX (Fortsett med protokollen på punkt 7.7.4).</li>
		<li>Skjær svulsten i skiver, som deretter overføres til histologikassetter og bevares i 4% formaldehyd for senere parafininnbygging.</li>
		<li>Bevar svulsten i et rør med vevlagringsløsning for å legge den til biobanken (Fortsett med protokollen i trinn 3.) og/eller opprett PDX-avledede cellelinjer (Fortsett med protokollen i trinn 4.)</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Biobank og databehandling
<ol><li>Tilordne en intern ID til hvert tumortile tilfelle i henhold til tabell 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Laboratorium plassering/navn</td>
			<td>kreft enhet</td>
			<td>påfølgende saksnummer</td>
			<td>Spesifikasjon</td>
			<td>påfølgende nummer</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td>C=kolorektal</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>_Met=Metastase</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>P=bukspyttkjertel</td>
			<td>_Tu=Svulst</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Eksempel: HROC389_Met2 = Rostock, kolorektal kreft, tilfelle 389, andre metastase</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Definisjon av eksempel-ID-en.
<ol start="2"><li>Oppbevar pasientens samtykke i elektronisk og papirform sammen med tumor-ID.</li>
	<li>Samle så mye kliniske data som mulig og lagre dem anonymisert og separat.</li>
	<li>Bruk en programvare for databehandling (f.eks. frysing) eller andre, og opprett et grensesnitt med en programvare for etikettutskrift for å generere temperaturbestandige, selvklebende strekkodeetiketter.</li>
	<li>Legg til en ny prøve ved å åpne databehandlingsprogramvaren, definere prøvetypen og registrere følgende informasjon: tumor-ID, vevstype, frysemetode, dato, ansvarlig ansatt, passasjenummer, muse-ID og musebelastning.</li>
	<li>Tilordne prøvene til bestemte posisjoner i oppbevaringstanken.</li>
	<li>Sporing og overvåking av PDX (Gjelder trinn 7-8)<ol>
<li>Bruk en MS Access-database (eller et lignende system) på en bærbar, Bluetooth-aktivert enhet (bærbar pc eller nettbrett) til å registrere tumor-ID, implantasjonsdato, dato for eutanasi, musealder og belastning samt tumorvekst over tid.</li>
		<li>Koble mikrobrikkeleseren til enheten og les ut mikrobrikken før implantasjon.</li>
		<li>Tilordne en bestemt ID til hver mus; vi bruker følgende skjema: ( setabell 2 nedenfor)</li>
		<li>Etter implantasjon registrerer du ID-en sammen med museegenskapene i databasebasen.</li>
		<li>Les mikrobrikken på igjen og kontroller om spesifikasjonene til mikrobrikken, databasebasen og kryotubeetiketten er konsistente.</li>
		<li>Opprett en etikett for hvert musebur tilsvarende. MERK: For å lage en fysisk sikkerhetskopiering, fest cryotube-etikettene med de tilsvarende mikrochipetikettene i et hefte og legg merke til dato og musebelastning.</li>
		<li>For å overvåke tumorveksten til den enkelte PDX, skann mikrobrikken på musen med leseren koblet til databaseenheten for identifikasjon og registrere tumorstørrelsen målt ved kaliper hver uke.</li>
		<li>Planlegg det ideelle tidspunktet for PDX høsting ved å analysere vekstkurven av svulsten.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tumor-ID</td>
			<td>Tidligere lagring i N2 (=f)</td>
			<td>Passasjenummer (=T)</td>
			<td>påfølgende musenummer (=M)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Eksempel: HROP12 fT0 M1 = Rostock, kreft i bukspyttkjertelen, tilfelle 12, generert fra frosset primærvev, første passasje, mus 1.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Definisjon av PDX-ID-en.

<ol>
	<li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies.">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies.">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer.">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li><li>Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+bacterial-immunotherapy+with+therapeutic+antibodies:+a+novel+therapeutic+concept.">Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept.</a> Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).</li><li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs.">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research.">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li><li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn's+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft.">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671 (2016).</li><li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts:+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features.">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li><li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models.">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).</li><li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+(PDX)+models:+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine.">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981 (2018).</li><li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research:+a+systematic+review.">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice.">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts:+a+potential+pitfall.">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li><li>Prall, F., Maletzki, C., H&#252;hns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment.">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).</li><li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability.">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li><li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics.">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), 1138-1150 (2013).</li><li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors.">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li><li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype.">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).</li><li>Katsiampoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+Patient-Derived+Xenografts+in+Colorectal+Cancer.">Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).</li><li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy.">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li><li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+model+supports+development,+function,+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells.">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li><li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts.">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Abe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+phosphoproteomic+analysis+for+phosphosignaling+and+active-kinome+profiling+in+Matrigel-embedded+spheroids+and+patient-derived+organoids.">Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids.</a> Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li></ol>

Generasjonen av en levende biobank forutsetter, bortsett fra å overholde de juridiske forskriftene for personvern, medisinsk lov og dyrevelferd, en god infrastruktur og et godt koordinert team. Det har vist seg fordelaktig å direkte involvere en del av kirurgisk personell i forskningsprosedyrene, siden de veldig godt kan vurdere egnetheten til den enkelte pasient for vevsdonasjon. Videre har pasientene en tendens til å samtykke med biobanking oftere, når deres skriftlige godkjenning er innhentet i løpet av den kirurgiske informerte samtykkediskusjonen. For å spare tid og ressurser, bør tilfeller som antagelig vil gi utilstrekkelige mengder tumorvev ikke velges for biobanking. Når det gjelder prøveoppkjøp, er maksimal "kommunikasjon nøkkelen" en enkel, men ofte oversett sannhet. Det tar bare en eneste uinformert teatersykepleier eller kirurgisk kollega å ødelegge prøven helt i utgangspunktet ved å fortsette som vanlig og legge til formaldehyd til reseksjonsprøven. Derfor er det helt avgjørende at hvert eneste medlem av de involverte ansatte blir kjent med SOP for biobanking. Kirurger bør bli lagt merke til dagen før og rett ved starten av prosedyren om planlagt vevsamling. Videre bør saker valgt for biobanking fremheves i den elektroniske ELLER-planen. Vevhøsting fra den kirurgiske prøven skal utføres av en patolog. For det første vil dette sikre at vevshøstingen ikke forstyrrer den endelige patologiske rapporten. For det andre øker dette sannsynligheten for å motta vev med tilstrekkelige mengder levedyktig kreftvev. Spesielt i bukspyttkjertelkreft med en uttalt desmoplastisk reaksjon og hyppige nekrotiske områder, er levedyktige deler vanskelige å identifisere makrooskopisk for det utrente øyet. Som et unntak fra denne regelen kan vevsblokker fra store lever- eller lungemetastaser til tider bli skåret ut "back-table" av kirurgen, hvis kirurgiske marginer kan defineres makrooskopisk. Rektal kreft resected av total mesorectal excision (TME), kan ikke være egnet for biobanking, siden vev høsting fra den nye prøven før parafin innebygging kan forstyrre TME kvalitetsvurdering. Alternativt kan vev for biobanking erverves ved transanal biopsi av rektal kreft.
Etableringsratene for primærcellekulturer avledet fra den opprinnelige svulsten er generelt lave. PDX-avledede, sekundære cellekulturer kan mer sannsynlig bli etablert. Vi anbefaler testing av forskjellige medier for hvert tilfelle og bruk av antibiotikatilskudd for de første passasjene for å redusere forurensning til et minimum siden høstet vev er sjelden sterilt. Etter vellykket forplantning bør hver enkelt cellelinje bekreftes som en kreftcellelinje ved FACS-analyse og regelmessig testet for mycoplasmaforurensning. For å utelukke krysskontaminering er regelmessig STR-analyse tilrådelig. Det bør bemerkes, at etableringsprotokollen for primære og sekundære cellelinjer blir stadig utsatt for optimalisering. Detaljer om sammensetningen og suksessratene til enkeltmediene er tydelig utenfor omfanget av dette arbeidet og vil bli publisert separat.
For PDX-engraftment kan tumorvev enten implanteres direkte etter reseksjon eller kryopreservert i fosterkalverum med 10% DMSO eller lignende frysemedier for forsinket implantasjon. Implantasjon umiddelbart ved tumorvev høsting setter en belastning på logistikk og laboratoriepersonell, og xenografting resultater etter kryopreservation er ikke dårligere i det hele tatt 10. Videre, inkubasjon av vevet i Matrigel før tumorimplantasjon, øker betydelig engraftment priser12. Vi anbefaler forsinket engraftment etter bestemt patologisk funn og umiddelbar avhending av feilaktig innsamlede vevsprøver. Siden suksessraten for primær engraftment øker med immunsvikt hos mottakermusen, har vi en tendens til å bruke NSG-mus for den aller første PDX-passasjen. Etter den første vellykkede PDX-engraftmentet kan NMRInu/nu-mus brukes til påfølgende passasjer og vevsutvidelse. Denne belastningen er mer robust, billigere og lettere å avle sammenlignet med NSG eller lignende immunsvikt, men viser fortsatt rimelige engraftment priser. Videre forenkler nakenheten implantasjon og tumorvekstovervåking. For å øke overføringsratene i påfølgende passasjer anbefaler vi direkte overføring av nyhøstet PDX-vev for å være vert for mus når det er mulig, spesielt for langsom voksende PDX og tilfeller med lav primær engraftment suksessrate. Collins og Lang har nylig gjennomgått 14 studier av kolorektal PDX-etablering og rapporterte engraftmentrater som varierer fra 14 til 100% med en median PDX-etableringsrate på 68%, sistnevnte er i samsvar medvåre funn 13. I tråd med litteraturen observerte vi lavere etableringsrater for bukspyttkjertel sammenlignet med kolorektal kreft PDX14. Uavhengig av vertens musstamme og tumorenhet utgjør utveksten av menneskelig, Epstein-Barr Virus (EBV)-assosiertE B-cellelymfomer og murinlymfomer ved implantasjonssiden en viktig fallgruve15,16. Hvis ukjent, kan slike svulster "forurense" etterfølgende passasjer og dermed forvirre påfølgende resultater. Uvanlig rask PDX vekst og hevelse av cervical, axillar og inguinal lymfeknuter er sterke indikatorer på murin lymfomvekst, men regelmessig histologisk undersøkelse av PDX er likevel tilrådelig. Videre bør genetisk konkordans mellom PDX og den tilsvarende donorpasienten testes regelmessig ved STR-analyse. Ideelt sett bør biobanken knyttes til en klinisk database bestående av pasientens egenskaper (generell informasjon, overlevelse, tilbakefallsfri overlevelse, terapi, sekundær neoplasi etc.). På grunn av juridiske forskrifter om personvernbeskyttelse og mangel på et slikt anonymisert datagrunnlag, administreres og oppdateres vårt kliniske datasett regelmessig og oppdateres manuelt av de samarbeidende legene.
Mens konvensjonelle biobanker er begrenset til observatoriumforskning, gir en levende biobank mulighet for in vitro- og in vivo-intervensjoner. Pasientavledede cellelinjer er et viktig verktøy for grunnleggende forskning, høy gjennomstrømning medikamentscreening og vurdering av nye farmasøytiske midler4. Tilsvarende PDX-modeller er imidlertid av økende betydning, siden de nøye rekafulerer histologien til den opprinneligesvulsten 17,18 ogviser høy genetisk stabilitet over flere passasjer19,20. Vår PDX biobank har vist seg som en utmerket plattform for preklinisk og grunnleggende forskning6,21. Videre, siden store PDX-samlinger tilstrekkelig gjenspeiler den inter-individuelle heterogeniteten til pasientpopulasjonen, har PDX klinisk studie (PCT) tilnærming (ett dyr per modell per behandling) fått betydning for narkotikautvikling siden det tillater trofast prediksjon av klinisk respons på nye legemidler og kombinatorisk regime8. Vi vurderer også for tiden nye eksperimentelle legemidler i små PCT-studier.
Til tross for disse lovende resultatene, innebærer median etableringsvarighet på 12,2 måned, den kliniske anvendeligheten til PDX-modeller som "avatarmus" for testing av behandlingsalternativer for kreft, i hvert fall for de pasientene som trenger umiddelbar adjuvant eller til og med neoadjuvant behandling22. En ekstra ulempe med standard PDX-modeller er mangelen på brukervennlighet for immunterapitesting på grunn av vert for musenes immunsvikt. For å overvinne disse begrensningene har flere "humaniserte" musestammer blitt utviklet. Disse musene er sterkt immunkompromitterte, men kan rekonstitueres med ulike typer humane benmargsavledede celler eller CD34+ hematopoetiske stamceller etter PDX-utvekst23, slik at evalueringen av lymfocyttmediert cytotoksisitet og terapirespons på immunkontrollpunkthemmerbehandling24,25.
De siste årene har pasientavledede organoider (PUD) fremstått som viktige kreftmodeller som konkurrerte med PDX. Avledet fra intakte tumorstykker og kultivert i et ekstracellulært matrisestillas, reflekterer disse tredimensjonale strukturene nøye de histologiske og genetiske egenskapene til den opprinnelige svulsten. Muligheten for langsiktig ekspansjon og kryopreservation gjør PUD et ideelt supplement til en levende biobank26,27. I tillegg til en relativt høy etableringsrate, har pålitelig legemiddelresponsprognose blitt rapportert for PUD av flere tumorenheter28. Videre har PDOer til og med blitt generert fra sirkulerende tumorceller, og også samtidig etablering av organoider fra tilsvarende sunt vev er mulig, slik at vurdering av terapirelatert toksisitet på pasient-individuell basis29,30. Men sammenlignet med konvensjonelle 2D-cellekulturer, er organoid kultur tid og ressurskrevende og kunstige ekstracellulære matriseforbindelser kan forstyrre visse analytiske prosedyrer31. Videre er kreft organoider utsatt for overvekst ved raskere voksende, ikke-ondartede organoider avledet fra sunt epitel30. På grunn av mangel på stroma, blodkar og immunceller, er PDOer for det meste uanvendelige for testing av antiangiogene immunterapeutiske midler. Likevel tillater nye kulteringsmetoder modellering av tumormikromiljøin vitro, noe som gjør PDOer til en sann utfordrer for PDX-modeller32. I nær fremtid vil pasient-individuelle tumormodeller, kombinert med kraftige genetiske verktøy som neste generasjons sekvensering, forhåpentligvis bane veien til ekte presisjonsmedisin og skreddersydde behandlingstilnærminger.

I de senere årene førte den akkumulerte kunnskapen om kreftens morfologiske, kliniske og genetiske egenskaper til oppfatningen av kreft som en heterogen, individuell sykdom. Følgelig har mutasjonskarakterisering av neoplasmer, foruten kliniske og patologiske egenskaper, fått betydning for klinisk beslutningstaking og mange målrettede terapier ble utviklet for ulike molekylære endringer. For eksempel kan effekten av cetuximab i kolorektal kreftbehandling forutsies ved analyse av KRAS og PIK3CA mutasjonsstatus1. Presisjonsmedisin tar sikte på en skreddersydd tilnærming for å gi den høyeste behandlingsresponsen hos hver pasient og unngå toksisitet av ineffektive behandlinger2. Biobanker inneholder vev, blod og andre biologiske materialer av kreftpasienter, som er knyttet til de kliniske dataene, og dermed er et utmerket verktøy for translasjonell kreftforskning. På grunn av det store antallet kliniske prøver muliggjør biobanker påvisning av sjeldne, men potensielt druggable mutasjoner, noe som gir nye behandlingsmuligheter for den enkeltepasient 3.
For å dekke så bredt som mulig et onkologisk forskningsspektrum, begrenset vi ikke vår aktivitet på prøvehøsting alene, men fokuserte på etablering av pasientavledede kreftcellelinjer og xenografter (PDX). Tradisjonelle 2D cellelinjer forblir hjørnesteinen av in vitro forskning og er det viktigste valget for storskala narkotikascreenings 4,5. Videre er cellelinjeanalyse ofte enklere, billigere og lettere tilgjengelig. I tillegg, siden pasientavledede perifere blodlymfocytter (PBL) er tilgjengelige, kan også tumorimmunologi studeres in vitro6. Imidlertid har flertallet av nyutviklede legemidler med lovende preklinisk effektivitet i cellebaserte in vitro- eller in vivo-eksperimenter, vist skuffende resultater i kliniske studier7. I motsetning har prekliniske studier basert på PDX in vivo-studier reflektert den kliniske aktiviteten til antineoplastiske midler mye mer trofast8. Siden PDX-vevet reflekterer de histologiske og molekylære egenskapene til donorsvulsten, er PDX-modeller en god måte å forplante de ofte svært begrensede mengdene levedyktig tumorvev for å opprettholde integriteten til en biobank og for å tillate utveksling av prøver mellom forskningsgrupper og institusjoner. Videre kan kreftcellelinjer avledet fra PDX-vev etableres betydelig enklere enn primære kreftcellelinjer9. De siste årene har vår arbeidsgruppe etablert en omfattende integrert kolorektal og bukspyttkjertelkreft biobank ved trinnvis standardisering og optimalisering av arbeidsflyten for alle biologiske prøver i spørsmålet (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> Figur 1:Arbeidsflyt og organisering av biobanken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacillol&#174; AF; 1L</td>
			<td>Bode, Hartmann</td>
			<td>REF 973380</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 15ml; sterile</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>GBO Cat. No.:188271</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 50ml, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Order number: 62.547.254</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 20ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 300296</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Item number: 01.1601</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological Pipette 10ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 86.1254.001</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy ratiolab&#174; accupetta</td>
			<td>Ratiolab</td>
			<td>Item number: RL3200300</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>VWR Cat.No: 613-4438</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS; w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-36500</td>
			<td>washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll human</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-60500</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-41500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P40-47500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-80100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P10-023100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>VWR Cat.No: A3672.0250</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)</td>
			<td>selfmade</td>
			<td>---</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotube- CryoPure 2ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well cell culture plate; steril; with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>Cat.-No.: 657 160</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Cat. No.: 82.1472.001</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blades</td>
			<td>B.Braun (Aesculap)</td>
			<td>REF BB510</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309110</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer; yellow; 100&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF 352360</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>biocision</td>
			<td>Item number: 210004</td>
			<td>cooling container with -1&#176;C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar&#160;transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm</td>
			<td>KGW</td>
			<td>Cat. No.: HT39.1</td>
			<td>transport system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.760.002</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.762.411</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200&#181;l, yellow</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.082</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000&#181;l, blue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.120</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator&#160; BB 6220 CU</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat.-No.: 51012839</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating plate PR&#196;ZITHERM</td>
			<td>Harry Gestigkeit GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Zeiss Primo Vert</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>Serial number. 3842000839</td>
			<td>imaging cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench Safe flow 1.8 nunc</td>
			<td>nunc GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>---</td>
			<td>sterile working bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer -80&#176;C</td>
			<td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance MP-300</td>
			<td>Chyo</td>
			<td>---</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine, U100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 324826</td>
			<td>injection anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%; 25ml</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>approval number: 6293841.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td>
			<td>CP-Pharma GmbH</td>
			<td>approval number: 401650.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GES3S Reader</td>
			<td>Datamars</td>
			<td>not available</td>
			<td>RFID reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td>
			<td>Peddymark</td>
			<td>---</td>
			<td>RFID chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotrim-ratiopharm&#174;&#160;Ampullen SF 480&#160;mg/5&#160;ml</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>PZN-03928197</td>
			<td>antibiotic drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate #FM-20 42x28cm</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Electric Petra, Burgau</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>PZN-01578675</td>
			<td>Eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anatomical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD21 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD50 1 R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BC05 6R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle&#160;holder</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BH1 1 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>XN8870.P32</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opsite moisture vapour permable spray dressing</td>
			<td>Smith&#38;Nephew</td>
			<td>REF 66004978, PZN- 02063507</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aperture drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>REF 904622</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze swap Gazin&#174;; steril; 10x10 cm</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 18506</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raucotupf cotton tipped applicators</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 11969</td>
			<td>applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat.-No.: 354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>Item number: 18839</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#174; Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>Order No.:130-100-008</td>
			<td>storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formafix 4%</td>
			<td>Grimm med. Logistik GmbH</td>
			<td>Item number: F10010G</td>
			<td>fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software FreezerworksBasic</td>
			<td>Dataworks Development, Inc</td>
			<td>---</td>
			<td>sample organization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra TLP 2844 printer</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>---</td>
			<td>label printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation and maintenance of a living biobank - how we do it

I lys av den økende kunnskapen om de mellomindiske egenskapene og heterogeniteten til kreft, krever det nye feltet av personlig medisin en plattform for preklinisk forskning. I løpet av de siste årene har vi etablert en biobank av kolorektal- og bukspyttkjertelkreft bestående av primærsvulstvev, normalt vev, sera, isolerte perifere blodlymfocytter (PBL), pasientavledede xenografter (PDX), samt primære og sekundære kreftcellelinjer. Siden originalt tumorvev er begrenset og etableringsraten for primære kreftcellelinjer fortsatt er relativt lav, tillater PDX ikke bare bevaring og forlengelse av biobanken, men også generering av sekundære kreftcellelinjer. Videre har PDX-modeller vist seg å være den ideelle in vivo-modellen for preklinisk narkotikatesting. Biobanking krever imidlertid nøye forberedelse, strenge retningslinjer og en godt tilpasset infrastruktur. Kolektomi, duodenopankrekretektomi eller resected metastaser prøvene samles umiddelbart etter reseksjon og overføres til patologi avdelingen. Respektere prioritet av en objektiv histopatologisk rapport, etter skjønn av den behandlende patologen som utfører disseksjonene, høstes små svulststykker og ikke-tumorvev. 
Nekrotiske deler kastes og det gjenværende tumorvevet kuttes i små, identiske terninger og kryopreservert for senere bruk. I tillegg er en liten del av svulsten hakket og anstrengt for primær kreftcellekultur. I tillegg behandles blodprøver fra pasienten pre- og postoperativt for å oppnå serum og PBLer. For PDX-engraftment blir de kryobserverte prøvene tint og implantert subkutant inn i flankene av immunsviktede mus. Den resulterende PDX nøye rekafulere histologien til "donor" svulster og kan enten brukes til etterfølgende xenografting eller kryopreservert for senere bruk. I det følgende arbeidet beskriver vi de enkelte trinnene for etablering, vedlikehold og administrasjon av en stor biobank av kolorektal og bukspyttkjertelkreft. Videre fremhever vi de avgjørende detaljene og advarslene knyttet til biobanking.

I våre hender var etableringsraten for primære cellekulturer (Figur 2A & B) 12,9% i en stor serie9. De fleste forsøk på å isolere utvidbare tumorceller fra friske kirurgiske resected prøver mislyktes på grunn av mangel på utvekst eller tidlig forurensning. Cell line etablering ble ansett som vellykket etter 3 passasjer med en jevn vekst under standard kulturforhold (DMEM, 10% FCS, standard kultur fartøy) og validering av epiteldilatering via FACS-analyse10. Cellelinjer avledet fra PDX svulster (Figur 2C & D) viste en høyere etablering sats på 23,6% som også skyldes muligheten for repeterende forsøk i motsetning til primære resected svulster9. Noen blandede kulturer (figur 2E) kan imidlertid ikke frigjøres for fibroblastisk vekst eller til og med gå tapt på grunn av fibroblastisk overvekst (figur 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> Figur 2: Cellekultur. Primære kreftcellelinjer, avledet fra en metastase av kolonkrefttilfelle HROC313, passasje 21 (A) og kreft i bukspyttkjertelen HROP88, passasje 5 (B). PDX-avledede kreftcellelinjer av tykktarm PDX HROC285 T0 M2 (D) og bukspyttkjertel PDX HROP10 T5 M2, passasje 4 (E). Blandet kultur av fibroblaster og kreftceller fra kreft i bukspyttkjertelen HROP75, passasje 8 (C) og fibroblastisk overvekst (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tatt i bruk endringer i PDX generasjonsprotokoll, musestammer som brukes og også eksperimenterere over flere år, samt store forskjeller i mengden tumorvev som er tilgjengelig for engraftment, er det ikke trivielt å gi den totale suksessraten for PDX-generering. I en svært nylig serie av PDX generasjon eksperimenter utført av to forskere (S.M. og F.B.), primære utvekstrater på 63% for kolorektal PDX (en eksemplarisk histologi kan avbildet fra figur 3A) og 48% for bukspyttkjertel PDX (figur 3B) ble observert. Utveksten av murin eller menneskelige lymfomer på implantasjonsstedet er relativt sjelden, men kan etterligne vellykket PDX-utvekst (figur 3C). Bortsett fra histopatologisk undersøkelse ble konkordans mellom PDX-modeller og deres donorpasienter regelmessig bekreftet av kort tandemgjegdsettelse (STR) analyse (figur 3D). Til i dag består biobanken av > 50 primære og > 50 sekundære kolorektal, 3 primære og 6 sekundære kreftcellelinjer i bukspyttkjertelen samt > 150 kolorektal- og 19 bukspyttkjertel-PDX-modeller.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> Figur 3: Representativ histologisk sammenligning av kolorektal (A) og bukspyttkjertel PDX (B). Humant lymfom på implantasjonsstedet som etterligner PDX-utvekst (C). Genetisk identitetstesting av en PDX-modell (HROC430 T1 M2) til det opprinnelige pasientsvulstvevet (HROC430Tu) ved kort tandemgjentsep(STR)-analyse. Sammenligning av de ni STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM fargestoff) og D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX fargestoff) ved hjelp av multiplex PCR med fluorescerende merkede primere etter kapillær elektroforese bekreftet genetisk kordans av PDX og donor svulst (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

I det følgende arbeidet beskriver vi de påfølgende trinnene som er nødvendige for etablering av en stor biobank av kolorektal og bukspyttkjertelkreft.

Opprettelse og vedlikehold av en levende biobank - Hvordan vi gjør det

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Opprettelse og vedlikehold av en levende biobank hvordan vi gjør det. Introduksjon. Tradisjonelle biobanker inneholder vanligvis ikke-levedyktig vev og blodprøver. Til tross for at de reflekterer tilstrekkelig mangfoldet av kreftpasientpopulasjoner og tillater genetiske og histologiske analyser, er de uegnet for prekliniske analyser som evaluerer terapeutiske strategier.En biobankintegrering av også pasientavledede modeller overvinner disse begrensningene. Dermed muliggjør funksjonell testing for presisjonsmedisin. Eksempel på anskaffelse.For biobanking av kolorektal og bukspyttkjertelkreft, velg tilfeller med bevist diagnose samt tilstrekkelig tumorstørrelse, informert koncent av pasienten er obligatorisk. Før starten av operasjonen, tegn 20 ml blod ved hjelp av en heparinisert sprøyte og ytterligere 7,5 ml med en serummonovette. Serumbehandling og PBL-isolasjon.Etter sentrifugering ved 1, 128 RCF i 15 minutter ved fire grader blir serumet aliquoted i en forhåndsmerket kryotube og direkte nedsenket i flytende nitrogen. Det hepariniserte blodet overføres til et polypropylenrør og fortynnes med 15 ml PBS. Bruk en serologisk pipette for sakte å underlegge blandingen med 15 ml Pancoll.Etter tetthet gradient sentrifugering, tas det ugjennomsiktige laget som inneholder mononukleære celler opp med en serologisk pipette og overføres til et nytt PP-rør. Etter vask med PBS og pelleting av mononukleære celler ved sentrifugering, kast supernatanten og resuspend pellet i frysemediet og dispenser inn i forhåndsmerkede kryorør. Overfør rørene til en kjølebeholder som er egnet for langsom frysing med en grad per minutt og oppbevar midlertidig ved 80 grader.Vevsbehandling. Så snart vevsprøven er resected av kirurgen, legg den i en passende beholder. Unngå under alle omstendigheter at vevet er dekket av formalin.Transport så raskt som mulig til patologien for eksisjon av tumormateriale som ikke er relevant for patologisk evaluering av reseksjonsmarginene. Tumorstykket skal håndteres så aseptisk som mulig. Videre, få et eksemplar av sunt vev og plasser begge i separate rør forhåndsfylt med vevslagringsløsning på is.Gå umiddelbart tilbake til laboratoriet for å starte vevsbehandling under sterile forhold. Vevsstykket er plassert på en steril plastfat fylt med vevslagringsløsning for å unngå uttørking. Først av alt, slukk ett eller flere pinhead-størrelse stykker for snapfrysing avhengig av størrelsen på vevsprøven som er oppnådd.Plasser det opprinnelige vevet i forhåndsmerkede kryorør og senk umiddelbart i flytende nitrogen. Klipp det gjenværende vevet i terninger på tre med tre med tre kubikkmillimeter. Ta hensyn til at nekrotisk vev må dissekeres helt, men bør ikke kastes.Ordne kubene i firedobler for å bestemme antall aliquots for vital lagring. Merk et tilstrekkelig antall kryorør og fyll dem med 1,5 ml frysemiddel hver. Siden DMSO i frysemediet er cytotoksisk, utførte de neste trinnene raskt og uten avbrudd.Bruk en skalpellblad til å øse opp fire vevstykker per rør. Pass på at alle delene er helt nedsenket i frysemediet ideelt på bunnen av røret og raskt fryse rør ved hjelp av en frysebeholder. Fortsett på samme måte med den sunne prøven.For langsiktig lagring, lagre alle aliquotes i en flytende nitrogentank. Cellekultur. Grind restene av tumorvevsbehandlingen, inkludert de nekrotiske delene med skalpellbladene så små som mulig.Plasser en cellesil på toppen av et sterilt PP-rør og aspirer suspensjonen med en serologisk pipette for å passere gjennom cellesilen. Bruk stempelet på en engangssprøyte for å trykke vevet forblir gjennom cellesilen for å generere en enkelt celle suspensjon. Skyll med PBS og gjenta disse trinnene til det ikke er noe materiale igjen.Fjern cellesilen og sentrifuger suspensjonen ved 180 RCF i syv minutter. I mellomtiden forbereder du en kollagen forhåndsbelagt seksbrønnsplate med forskjellige mediesammensetninger for å øke sannsynligheten for tumorutvekst. Kast supernatanten og resuspender pelletsen i PBS og dispenser 500 mikroliter per brønn.Deretter plasserer du platen i en standard inkubator. Generering av pasientavledede xenograft. For generering av pasientavledede xenografter i immunkompromitterte mus, bør dyr holdes i et bestemt patogenfritt miljø.Bruk personlig verneutstyr som består av skrubber, forkle, ansiktsmaske, hårdeksel og hansker. Etter å ha ordnet arbeidsområdet ditt, ta lystsvulstprøven fra den flytende nitrogenbeholderen. Fyll et friskt PP-rør med 35 ml PBS, vask deretter opptiningsprosessen forsiktig og vipp kryorøret opp og ned.Så snart innholdet blir slushy, helles det i PBS og skyll svulststykkene. Kast mesteparten av PBS og tøm kubene i lokket. Legg en steril plastfat på en ispakke og tilsett en dråpe med 100 mikroliter matrigel.Bruk tang til å plassere tumorstykkene i Matrigel og inkuber svulsten i 10 minutter. I mellomtiden bedøver du to mus. Kontroller dybden av anestesi ved å klemme dyrets fot.Enhver bevegelse indikerer utilstrekkelig anestesi og krever enten litt venting eller ekstra dosering. Påfør øyesalve, klem musen ved nakken og injiser en mikrochip subkutant. Utfør følgende trinn parallelt.Desinfiser musenes flanker og lag et lite hudsnitt med stripe Metzenbaum saks og danner en subkutan lomme ved stump forberedelse. Bruk anatomiske tang for å sette inn tumorstykkene. Pass på at stykket er plassert i bakenden av hudlommen.Aspirer den gjenværende Matrigel og fordel likt til alle fire lommene. Avvent herding av gelen og lukk huden med enkeltknapp suturer uten å skade svulststykkene med nålen. Klipp tråden så kort som mulig over knuten og påfør spraydressing for å forhindre nikking av suturene.Skann mikrochipen og legg til tumorinformasjonen i databasen for senere identifisering av dyret. Forbered et bur med ferskt sengetøy og hekkemateriale, plasser musene foran en infrarød lampe og overvåk dyret til anestesi har avtatt. Utvisning av PDX.Etter at PDX-svulsten har nådd ønsket størrelse, blir musen euthanized av CO2-kvelning og påfølgende cervical dislokasjon. Disseker huden forsiktig fra svulsten og fjern PDX helt. Representative resultater.Legg en svulst på en steril plastfat og bruk sterile skalpellblader for videre behandling. Klipp hull med skivene, legg dem i en histologikassett og senk i formalin for å generere parafin innebygd prøve for histologisk vurdering på et senere tidspunkt. Overfør resten av svulsten til vevslagringsløsning og lag ny vitalt bevart og snap frossen prøve for biobanken.I tillegg bruker du restene av PDX-svulsten analogt med kapittelcellekulturen for å etablere sekundære tumorcellelinjer. For å generere ytterligere PDX, overfør to eller flere tumorstykker med Matrigel til en ny mottakermus som vist tidligere. Konklusjon. Ved hjelp av den presenterte protokollen klarte vi så langt å etablere ni bukspyttkjertel og mer enn 100 kolorektale pasientavledede kreftcellelinjer, samt 19 bukspyttkjertel og over 150 kolorektale PDX-modeller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hvordan studere basalmembran Stivhet som Biofysikalsk Trigger i prostatakreft og andre aldersrelaterte patologi eller metabolske sykdommer

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Utvikling og vedlikehold av en Preklinisk Pasient Avledet Tumor Xenotransplantat Modell for Undersøkelse av Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musemodell av Fatigue indusert av Peripheral Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Med 22C 3 Anti-PD-L1 antistoff konsentrere seg om biopsi og cytologi eksempler fra ikke-småcellet lungekreft pasienter

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Undersøkelse av genetisk avhengigheter ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte konkurranse analyser

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Etablering og analyse av tredimensjonale (3D) organoider avledet fra pasient prostatakreft benmetastase prøver og deres Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

En reporteranalyse for å analysere intronisk mikroRNA-modning i pattedyrceller

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Molekylære og immunologiske teknikker i en genetisk konstruert musemodell av gastrointestinal stromal tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...