Name: creation and maintenance of a living biobank - how we do it
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

Nós gentilmente reconhecemos Jenny Burmeister, nossa assistente gráfica, para a gravação e edição do vídeo. Além disso, agradecemos aos nossos colegas do departamento cirúrgico e patológico pela colaboração de longa data. Agradecemos também a Marcus Müller, gerente de produção do Centro de TI e Mídia da Universidade de Rostock, pelo fornecimento do equipamento de gravação de áudio e pelo refino da qualidade do som.
FINANCIAMENTO: A Fundação Alemã de Auxílio ao Câncer (DKH e.V.), o número de subvenção 108446, e o número de subvenção TBI-V-1-241-VBW-084 do estado Mecklenburg-Vorpommern financiaram parcialmente esta pesquisa.

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	<li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies.">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies.">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li><li>Wilding, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research:+a+systematic+review.">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice.">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>Moyer, A. 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A geração de um biobanco vivo pressupõe, além de cumprir as normas legais de privacidade, direito médico e bem-estar animal, uma boa infraestrutura e uma equipe bem coordenada. Tem se mostrado vantajoso envolver diretamente uma parte da equipe cirúrgica nos procedimentos de pesquisa, uma vez que eles podem avaliar muito bem a adequação do paciente individual para a doação de tecidos. Além disso, os pacientes tendem a consentir com o biobanco com mais frequência, quando sua aprovação por escrito é obtida no curso da discussão de consentimento informado cirúrgico. Para economizar tempo e recursos, casos que presumivelmente produzirão quantidades insuficientes de tecido tumoral não devem ser selecionados para biobancar. Quando se trata de aquisição de espécimes, a máxima "comunicação é fundamental" é uma verdade simples, mas muitas vezes negligenciada. Basta uma única enfermeira de teatro não informada ou colega cirúrgico para arruinar o espécime logo no início, procedendo como de costume e adicionando formaldeído ao espécime de ressecção. Portanto, é absolutamente crucial que cada membro da equipe envolvida se familiarize com o SOP para biobancar. Os cirurgiões devem ser notados no dia anterior e logo no início do procedimento sobre a coleta programada de tecidos. Além disso, os casos selecionados para biobancarização devem ser destacados no plano or eletrônico. A colheita de tecidos da amostra cirúrgica deve ser realizada por um patologista. Em primeiro lugar, isso garantirá que a colheita de tecidos não interfira no relatório patológico final. Em segundo lugar, isso aumenta a probabilidade de receber tecido com quantidades adequadas de tecido cancerígeno viável. Especialmente em cânceres pancreáticos com uma reação desmoplástica pronunciada e áreas necrosadas frequentes, partes viáveis são difíceis de identificar macroscopicamente para o olho destreinado. Como exceção a esta regra, os blocos teciduais de grandes metástases hepáticas ou pulmonais, podem, por vezes, ser extirpados "back-table" pelo cirurgião, se as margens cirúrgicas podem ser definidas macroscopicamente. O câncer retal ressecado pela excisão mesorectal total (TME), pode não ser adequado para biobancar, uma vez que a colheita de tecidos da amostra resseced antes da incorporação da parafina pode interferir na avaliação da qualidade do TME. Alternativamente, o tecido para biobancarina pode ser adquirido por biópsia transanal de câncer retal.
As taxas de estabelecimento para culturas celulares primárias derivadas do tumor original são geralmente baixas. Culturas de células secundárias derivadas do PDX podem ser mais provavelmente estabelecidas com sucesso. Recomendamos o teste de diferentes mídias para cada caso e o uso de suplementos antibióticos para as primeiras passagens para reduzir a contaminação ao mínimo, uma vez que o tecido colhido raramente é estéril. Após a propagação bem sucedida, cada linha celular individual deve ser confirmada como uma linha celular cancerosa pela análise FACS e regularmente testada para contaminação por micoplasma. Para excluir a contaminação cruzada, é aconselhável a análise regular de STR. Deve-se notar que o protocolo de estabelecimento para linhas de células primárias e secundárias está constantemente sujeito à otimização. Os detalhes sobre a composição e as taxas de sucesso da mídia única estão claramente além do escopo deste trabalho e serão publicados separadamente.
Para o enxerto PDX, o tecido tumoral pode ser implantado diretamente após a ressecção ou criopreservado no soro de bezerro fetal com 10% de DMSO ou mídia de congelamento similar para implantação retardada. A implantação imediatamente após a colheita de tecido tumoral coloca uma pressão sobre a logística e a equipe de laboratório, e os resultados de xenoenxerto após a criopreservação não são inferiores em todos os 10. Além disso, a incubação do tecido em Matrigel antes da implantação do tumor, aumenta significativamente as taxas de enenxerção12. Recomendamos o enxerto atrasado após o achado patológico definitivo e o descarte imediato de amostras de tecido coletadas erroneamente. Uma vez que a taxa de sucesso do enenerxamento primário aumenta com a imunodeficiência do mouse receptor, tendemos a usar ratos NSG para a primeira passagem PDX. Após o primeiro enxerto PDX bem sucedido, os ratosnMRI nu/nu podem e devem ser usados para passagens subsequentes e expansão tecidual. Esta cepa é mais robusta, mais barata e mais fácil de procriar em comparação com nsg ou cepas imunodeficientes semelhantes, mas ainda mostra taxas razoáveis de enenxerção. Além disso, sua nudez facilita a implantação e o monitoramento do crescimento do tumor. Para aumentar as taxas de engraftment em passagens subsequentes, recomendamos a transferência direta de tecidos PDX recém-colhidos para camundongos de hospedagem sempre que possível, especialmente para PDX de crescimento lento e casos com baixa taxa de sucesso de engrafamento primário. Collins e Lang revisaram recentemente 14 estudos do estabelecimento colorretal de PDX e relataram taxas de engraftment variando de 14 a 100% com uma taxa mediana de estabelecimento PDX de 68%, sendo este último consistente com nossos achados13. Em consonância com a literatura, observamos taxas de estabelecimento mais baixas de pâncreas em comparação com o câncer colorretal PDX14. Independentemente da variedade de camundongos hospedeiros e da entidade tumoral, o crescimento do vírus humano, linfomas de células B associados ao Epstein-Barr (EBV) e linfomas murinas no lado da implantação representa uma importante armadilha15,16. Se não forem reconhecidos, tais tumores podem "contaminar" passagens subsequentes e, assim, confundir resultados consecutivos. O crescimento rápido incomum do PDX e o inchaço dos linfonodos cervicais, axilares e inguinais são fortes indicadores de crescimento de linfoma murino, mas o exame histológico regular do PDX é, no entanto, aconselhável. Além disso, a concordância genética entre pdx e o paciente doador correspondente deve ser testada regularmente pela análise str. Idealmente, o biobanco deve estar vinculado a um banco de dados clínico composto por características dos pacientes (informação geral, sobrevivência, sobrevida livre de recaídas, terapia, neoplasia secundária etc.). Devido às regulamentações legais de proteção à privacidade e à falta de uma base de dados anonimizada, nosso conjunto de dados clínicos é regularmente administrado e atualizado manualmente pelos médicos que cooperam.
Enquanto os biobancos convencionais estão limitados à pesquisa do observatório, um biobanco vivo oferece a oportunidade para intervenções in vitro e in vivo. As linhas celulares derivadas do paciente são uma ferramenta importante para pesquisas fundamentais, triagens de medicamentos de alto rendimento e avaliação de novos agentes farmacêuticos4. Os modelos PDX correspondentes, no entanto, são de importância crescente, uma vez que recapitulam de perto a histologia do tumor original17,18 e mostram alta estabilidade genética ao longo de várias passagens19,20. Nosso biobanco PDX provou-se como uma excelente plataforma para pesquisas pré-científicas e fundamentais6,21. Além disso, uma vez que grandes coleções de PDX refletem adequadamente a heterogeneidade inter-individual da população paciente, a abordagem do ensaio clínico PDX (PCT) (um animal por modelo por tratamento) ganhou importância para o desenvolvimento de medicamentos, uma vez que permite a previsão fiel da resposta clínica a novos medicamentos e ao regime combinatório8. Também estamos avaliando novas drogas experimentais em pequenos testes de PCT.
Apesar desses resultados promissores, a duração mediana do estabelecimento de 12,2 meses, impede a aplicabilidade clínica dos modelos PDX como "camundongos avatares" para testar opções de tratamento anticancerígeno, pelo menos para aqueles pacientes que necessitam de tratamento adjuvante imediato ou mesmo neoadjuvante22. Uma desvantagem adicional dos modelos PDX padrão é a falta de usabilidade para testes de imunoterapia devido à imunodeficiência dos camundongos hospedeiros. Para superar essas limitações, várias cepas de camundongos "humanizadas" foram desenvolvidas. Estes camundongos são fortemente imunocomprometidos, mas podem ser reconstituídos com vários tipos de células derivadas da medula óssea humana ou células-tronco hematopoiéticas após o crescimento do PDX23, permitindo a avaliação da citotoxicidade mediada pela linfócito e da resposta terapêutica ao tratamento inibidor de ponto de verificação imunológico24,25.
Nos últimos anos, organoides derivados do paciente (PDO) surgiram como importantes modelos de câncer competindo com pdx. Derivadas de pedaços tumorais intactos e cultivadas em um andaime de matriz extracelular, essas estruturas tridimensionais refletem de perto as propriedades histológicas e genéticas do tumor original. A possibilidade de expansão e criopreservação a longo prazo torna o PDO um suplemento ideal de um biobanco vivo26,27. Além de uma taxa de estabelecimento relativamente alta, a previsão de resposta confiável a medicamentos foi relatada para PDO de várias entidades tumorais28. Além disso, os PDOs têm sido gerados a partir de células tumorais circulantes e também o estabelecimento simultâneo de organoides a partir de tecido sadio correspondente é possível, permitindo a avaliação da toxicidade relacionada à terapia em uma base paciente-individual29,30. No entanto, em comparação com as culturas convencionais de células 2D, a cultura organoide é o consumo de tempo e os compostos de matriz extracelular artificial podem interferir em certos procedimentos analíticos31. Além disso, os organoides cancerígenos são suscetíveis ao crescimento excessivo por organoides não malignos de crescimento mais rápido derivados do epitéliosaudável 30. Devido à falta de estroma, vasos sanguíneos e células imunes, os PDOs são em sua maioria inaplicáveis para o teste de agentes imunoterapêuticos antiangiogênicos. No entanto, novos métodos de cultivo permitem a modelagem do microambiente tumoral in vitro,tornando os PDOs um verdadeiro concorrente para os modelos PDX32. Em um futuro próximo, modelos de tumores individuais do paciente, combinados com poderosas ferramentas genéticas como o sequenciamento da próxima geração, esperançosamente abrirão o caminho para a verdadeira medicina de precisão e abordagens de tratamento sob medida.

Nos últimos anos, o conhecimento acumulado das propriedades morfológicas, clínicas e genéticas dos cânceres levou à concepção do câncer como uma doença heterogênea e individual. Consequentemente, a caracterização mutacional das neoplasias, além de características clínicas e patológicas, ganhou importância para a tomada de decisões clínicas e muitas terapias-alvo foram desenvolvidas para diversas alterações moleculares. Por exemplo, a eficácia do cetuximabe no tratamento do câncer colorretal pode ser prevista pela análise do estado mutacional KRAS e PIK3CA 1. A medicina de precisão visa uma abordagem personalizada para fornecer a maior resposta ao tratamento em cada paciente e evitar a toxicidade de terapias ineficientes2. Os biobancos contêm tecidos, sangue e outros materiais biológicos de pacientes com câncer, que estão ligados aos dados clínicos e, portanto, são uma excelente ferramenta para a pesquisa de câncer translacional. Devido ao grande número de amostras clínicas, os biobancos permitem a detecção de mutações raras, mas potencialmente drogáveis, o que proporciona novas oportunidades de tratamento para o paciente individual3.
Para cobrir o mais amplo possível um espectro de pesquisa oncológica, não restringimos nossa atividade apenas na colheita de amostras, mas focamos no estabelecimento de linhas de células cancerígenas derivadas do paciente e xenoenxertos (PDX). As linhas tradicionais de células 2D continuam a ser a pedra de canto da pesquisa in vitro e são a principal escolha para os exames de drogas em larga escala4,5. Além disso, a análise da linha celular é muitas vezes mais fácil, mais barata e mais facilmente disponível. Além disso, uma vez que os linfócitos periféricos derivados do paciente (PBL) estão disponíveis, também a imunologia tumoral pode ser estudada in vitro6. No entanto, a maioria dos medicamentos recém-desenvolvidos com uma promissora efetividade pré-clínica em experimentos in vitro ou in vivo, têm mostrado resultados decepcionantes em ensaios clínicos7. Em contrapartida, estudos pré-clínicos baseados em estudos PDX in vivo têm refletido a atividade clínica de agentes antineoplásicos muito mais fielmente8. Uma vez que o tecido PDX reflete de perto as propriedades histológicas e moleculares do tumor doador, os modelos PDX são uma boa maneira de propagar as quantidades muitas vezes muito limitadas de tecido tumoral viável para manter a integridade de um biobanco e permitir a troca de amostras entre grupos de pesquisa e instituições. Além disso, as linhas celulares cancerígenas derivadas do tecido PDX podem ser estabelecidas significativamente mais fáceis do que as linhas primárias de célulascancerígenas 9. Nos últimos anos, nosso grupo de trabalho estabeleceu um biobanco integrado integral de câncer colorretal e pâncreas, padronizando e otimizando o fluxo de trabalho para todas as amostras biológicas em questão(Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho e organização do biobanco <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacillol&#174; AF; 1L</td>
			<td>Bode, Hartmann</td>
			<td>REF 973380</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 15ml; sterile</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>GBO Cat. No.:188271</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 50ml, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Order number: 62.547.254</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 20ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 300296</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Item number: 01.1601</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological Pipette 10ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 86.1254.001</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy ratiolab&#174; accupetta</td>
			<td>Ratiolab</td>
			<td>Item number: RL3200300</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>VWR Cat.No: 613-4438</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS; w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-36500</td>
			<td>washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll human</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-60500</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-41500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P40-47500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-80100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P10-023100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>VWR Cat.No: A3672.0250</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)</td>
			<td>selfmade</td>
			<td>---</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotube- CryoPure 2ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well cell culture plate; steril; with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>Cat.-No.: 657 160</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Cat. No.: 82.1472.001</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blades</td>
			<td>B.Braun (Aesculap)</td>
			<td>REF BB510</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309110</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer; yellow; 100&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF 352360</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>biocision</td>
			<td>Item number: 210004</td>
			<td>cooling container with -1&#176;C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar&#160;transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm</td>
			<td>KGW</td>
			<td>Cat. No.: HT39.1</td>
			<td>transport system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.760.002</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.762.411</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200&#181;l, yellow</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.082</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000&#181;l, blue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.120</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator&#160; BB 6220 CU</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat.-No.: 51012839</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating plate PR&#196;ZITHERM</td>
			<td>Harry Gestigkeit GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Zeiss Primo Vert</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>Serial number. 3842000839</td>
			<td>imaging cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench Safe flow 1.8 nunc</td>
			<td>nunc GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>---</td>
			<td>sterile working bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer -80&#176;C</td>
			<td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance MP-300</td>
			<td>Chyo</td>
			<td>---</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine, U100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 324826</td>
			<td>injection anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%; 25ml</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>approval number: 6293841.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td>
			<td>CP-Pharma GmbH</td>
			<td>approval number: 401650.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GES3S Reader</td>
			<td>Datamars</td>
			<td>not available</td>
			<td>RFID reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td>
			<td>Peddymark</td>
			<td>---</td>
			<td>RFID chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotrim-ratiopharm&#174;&#160;Ampullen SF 480&#160;mg/5&#160;ml</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>PZN-03928197</td>
			<td>antibiotic drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate #FM-20 42x28cm</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Electric Petra, Burgau</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>PZN-01578675</td>
			<td>Eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anatomical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD21 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD50 1 R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BC05 6R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle&#160;holder</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BH1 1 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>XN8870.P32</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opsite moisture vapour permable spray dressing</td>
			<td>Smith&#38;Nephew</td>
			<td>REF 66004978, PZN- 02063507</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aperture drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>REF 904622</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze swap Gazin&#174;; steril; 10x10 cm</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 18506</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raucotupf cotton tipped applicators</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 11969</td>
			<td>applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat.-No.: 354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>Item number: 18839</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#174; Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>Order No.:130-100-008</td>
			<td>storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formafix 4%</td>
			<td>Grimm med. Logistik GmbH</td>
			<td>Item number: F10010G</td>
			<td>fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software FreezerworksBasic</td>
			<td>Dataworks Development, Inc</td>
			<td>---</td>
			<td>sample organization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra TLP 2844 printer</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>---</td>
			<td>label printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation and maintenance of a living biobank - how we do it

À luz do crescente conhecimento sobre as propriedades inter-individuais e a heterogeneidade dos cânceres, o campo emergente da medicina personalizada requer uma plataforma para pesquisas pré-clínicas. Nos últimos anos, estabelecemos um biobanco de cânceres colorretais e pancreáticos compostos por tecido tumoral primário, tecido normal, soro, linfócitos sanguíneos periféricos isolados (PBL), xenoenxertos derivados do paciente (PDX), bem como linhas de células cancerígenas primárias e secundárias. Como o tecido tumoral original é limitado e a taxa de estabelecimento de linhas primárias de células cancerígenas ainda é relativamente baixa, o PDX permite não apenas a preservação e extensão do biobanco, mas também a geração de linhas de células cancerígenas secundárias. Além disso, os modelos PDX provaram ser o modelo in vivo ideal para testes de drogas pré-clínicos. No entanto, o biobanco requer uma preparação cuidadosa, diretrizes rigorosas e uma infraestrutura bem sintonizada. Colectomia, duodenopancreatectomia ou amostras de metástases resseccionadas são coletadas imediatamente após a ressecção e transferidas para o departamento de patologia. Respeitando a prioridade de um relatório histopatológico imparcial, a critério do patologista assistente que realiza as dissecções, pequenas peças tumorais e tecido não tumoral são colhidos. 
Partes necrosas são descartadas e o tecido tumoral restante é cortado em cubos pequenos e idênticos e criopreservados para uso posterior. Além disso, uma pequena parte do tumor é picada e tensa para a cultura primária das células cancerígenas. Além disso, amostras de sangue colhidas do paciente pré e pós-operatório são processadas para obtenção de soro e PBLs. Para o enxerto PDX, os espécimes criopreservados são descongelados e implantados subcutâneamente nos flancos de camundongos imunodeficientes. O PDX resultante recapitula a histologia dos tumores "doadores" e pode ser usado para xenoenxerto subsequente ou criopreservado para uso posterior. No trabalho a seguir, descrevemos as etapas individuais de criação, manutenção e administração de um grande biobanco de câncer colorretal e pâncreas. Além disso, destacamos os detalhes cruciais e ressalvas associados ao biobanco.

Em nossas mãos, a taxa de estabelecimento de culturas celulares primárias (Figura 2A & B) foi de 12,9% em uma grande série9. A maioria das tentativas de isolar células tumorais expansíveis de amostras resseccionadas cirúrgicas recentes falhou devido à falta de crescimento ou contaminação precoce. O estabelecimento de linha celular foi considerado bem-sucedido após 3 passagens com crescimento constante em condições de cultura padrão (DMEM, 10% FCS, navio de cultura padrão) e validação da diferenciação epitelial via FACS-analysis10. As linhas celulares derivadas dos tumores PDX (Figura 2C & D) apresentaram maior taxa de estabelecimento de 23,6%, o que também se deve à possibilidade de tentativas repetitivas em contraste com os tumores primários ressecados9. No entanto, algumas culturas mistas (Figura 2E) não podem ser livres do crescimento fibroblástico ou mesmo são perdidas devido ao crescimento fibroblástico(Figura 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> Figura 2: Cultura celular. Linhas primárias de células cancerígenas, derivadas de uma metástase do caso de câncer de cólon HROC313, passagem 21 (A) e caso de câncer de pâncreas HROP88, passagem 5 (B). Linhas cancerígenas derivadas do PDX do PDX HROC285 T0 M2 (D) e do pâncreas PDX HROP10 T5 M2, passagem 4 (E). Cultura mista de fibroblastos e células cancerígenas do câncer de pâncreas HROP75, passagem 8 (C) e crescimento excessivo fibroblástico (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Considerando mudanças no protocolo de geração de PDX, cepas de camundongos usadas e também experimentadores ao longo de vários anos, bem como grandes diferenças na quantidade de tecido tumoral disponível para enxercimento, não é trivial dar a taxa de sucesso global da geração PDX. Em uma série muito recente de experimentos de geração PDX realizados por dois pesquisadores (S.M. e F.B.), foram observadas taxas primárias de crescimento de 63% para PDX colorretal (uma histologia exemplar que pode ser retratada a partir da Figura 3A) e 48% para pdx pancreático (Figura 3B). O crescimento de linfomas murinos ou humanos no local da implantação é relativamente raro, mas pode imitar o crescimento bem sucedido do PDX(Figura 3C). Além do exame histopatológico, a concordância entre os modelos PDX e seus pacientes doadores foi regularmente confirmada pela análise de repetição de tandem curto (STR)(Figura 3D). Até os dias atuais, o biobanco compreende >50 modelos colorretal primário e >50 secundários, 3 linhas primárias e 6 de células cancerígenas pancreáticas secundárias, bem como >150 modelos PDX colorático e 19 pancreáticos.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> Figura 3: Comparação histológica representativa do colorretal (A) e do PDX pancreático (B). Linfoma humano no local de implantação imitando o crescimento do PDX (C). Teste de identidade genética de um modelo PDX (HROC430 T1 M2) para o tecido tumoral do paciente original (HROC430Tu) por análise de repetição de tandem curto (STR). Comparação dos nove STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (corante FAM) e D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (corante HEX) usando MULTIPLEX PCR com primers fluorescentes rotulados após a eletroforese capilar confirmou concordância genética do PDX e tumor de doadores (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

No trabalho a seguir, descrevemos os passos consecutivos necessários para o estabelecimento de um grande biobanco de câncer colorretal e pâncreas.

Criação e Manutenção de um Biobanco Vivo - Como Fazemos

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Criação e manutenção de um biobanco vivo como fazemos. Introdução. Os biobancos tradicionais geralmente contêm amostras de tecido e sangue não viáveis. Apesar de refletir adequadamente a diversidade das populações de pacientes com câncer e permitir análises genéticas e histológicas, elas são inadequadas para ensaios pré-clínicos que avaliam estratégias terapêuticas.Um biobanco integrador também a modelos derivados do paciente supera essas limitações. Permitindo assim testes funcionais para medicina de precisão. Aquisição de amostras.Para o biobanco do câncer colorretal e pancreático, eleger casos com diagnóstico comprovado, bem como tamanho tumoral suficiente, concent informado do paciente é obrigatório. Antes do início da cirurgia, desenhe 20ml de sangue usando uma seringa heparinizada e 7,5ml adicionais com uma monovette de soro. Processamento de soro e isolamento de PBL.Após centrifugação a 1, 128 RCF por 15 minutos a quatro graus o soro é aliquotado em um crioboto pré-rotulado e diretamente submerso em nitrogênio líquido. O sangue heparinizado é transferido para um tubo de polipropileno e diluído com 15ml de PBS. Use uma pipeta sorológica para lentamente colocar a mistura com 15ml de Pancoll.Após centrifugação gradiente de densidade, a camada opaca contendo as células mononucleares é tomada com uma pipeta sorológica e transferida para um novo tubo PP. Depois de lavar com PBS e pelotar as células mononucleares por centrifugação, descarte o supernatante e resuspenque a pelota em meio congelador e dispense em criotubos pré-rotulados. Transfira os tubos para um recipiente de resfriamento adequado para congelamento lento com um grau por minuto e armazene temporariamente a 80 graus.Processamento de tecidos. Assim que a amostra de tecido for resseccionada pelo cirurgião, coloque-a em um recipiente adequado. Evite em todas as circunstâncias que o tecido esteja coberto de formalina.Transporte o mais rápido possível para a patologia para excisão de material tumoral não relevante para avaliação patológica das margens de ressecção. A peça do tumor deve ser tratada o mais asséptica possível. Além disso, obtenha uma amostra de tecido saudável e coloque ambos em tubos separados pré-preenchidos com solução de armazenamento de tecidos no gelo.Retorne imediatamente ao laboratório para iniciar o processamento de tecidos em condições estéreis. A peça de tecido é colocada em um prato plástico estéril cheio de solução de armazenamento de tecidos para evitar a proficação. Em primeiro lugar, extireta uma ou mais peças do tamanho de pinhead para congelamento de estalos, dependendo do tamanho da amostra de tecido obtida.Coloque o tecido nativo em criotubos pré-rotulados e submerse imediatamente em nitrogênio líquido. Corte o tecido restante em cubos de três por três por três milímetros cúbicos. Leve em conta que o tecido necrosado deve ser dissecado completamente, mas não deve ser descartado.Organize os cubos em quadruplos para determinar o número de alíquotas para armazenamento vital. Rotule um número adequado de criotubos e preencha-os com meio de congelador de 1,5ml cada. Uma vez que o DMSO no meio congelador é citotóxico, realizou os próximos passos de forma rápida e sem interrupção.Use uma lâmina de bisturi para colher quatro pedaços de tecido por tubo. Certifique-se de que todas as peças estão completamente submersas em meio congelador idealmente na parte inferior do tubo e congele rapidamente os tubos usando um recipiente de congelamento. Prossiga da mesma forma com o espécime saudável.Para armazenamento a longo prazo, armazene todas as alíquotas em um tanque de nitrogênio líquido. Cultura celular. Triture os restos do processamento do tecido tumoral, incluindo as porções necrosadas com as lâminas de bisturi o menor possível.Coloque um coador de células na parte superior de um tubo PP estéril e aspire a suspensão com uma pipeta sorológica para passar pelo coador celular. Use o êmbolo de uma única seringa de uso único para pressionar os restos do tecido através do coador celular para gerar uma única suspensão celular. Enxágüe com PBS e repita estes passos até que não haja mais material.Remova o coador de células e centrifufique a suspensão a 180 RCF por sete minutos. Enquanto isso, prepare uma placa de seis poços pré-revestida de colágeno com diferentes composições de mídia para aumentar a probabilidade de crescimento tumoral. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota na PBS e dispense 500 microliters por poço.Depois, coloque a placa em uma incubadora padrão. Geração de xenoenxerto derivado do paciente. Para a geração de xenoenxertos derivados do paciente em camundongos imunocomprometidos, os animais devem ser mantidos em um ambiente específico livre de patógenos.Use equipamentos de proteção individual compostos por esfregões, avental, máscara facial, tampa de cabelo e luvas. Depois de organizar seu espaço de trabalho, pegue a amostra de tumor desejo do recipiente de nitrogênio líquido. Encha um tubo PP fresco com PBS de 35ml e depois lave o processo de descongelamento cuidadosamente e incline o tubo criogênico para cima e para baixo.Assim que o conteúdo ficar macio, despeje no PBS e enxágue as peças tumorais. Descarte a maioria do PBS e esvazie os cubos na tampa. Coloque um prato de plástico estéril em uma bolsa de gelo e adicione uma gota de 100 microliter Matrigel.Use fórceps para colocar os pedaços do tumor no Matrigel e incubar o tumor por 10 minutos. Enquanto isso, anestesia dois ratos. Verifique a profundidade da anestesia beliscando o pé do animal.Qualquer movimento indica anestesia insuficiente e requer alguma espera ou dosagem adicional. Aplique pomada ocular, belisque o mouse pelo pescoço e injete um microchip subcutâneamente. Conduza os seguintes passos em paralelo.Desinfete os flancos dos ratos e faça uma pequena incisão de pele com uma tesoura Metzenbaum listrada e forme um bolso subcutâneo por preparação sem cortes. Use fórceps anatômicos para inserir as peças tumorais. Certifique-se de que a peça está colocada na parte traseira do bolso da pele.Aspire o Matrigel restante e distribua igualmente para todos os quatro bolsos. Aguarde a cura do gel e feche a pele com suturas de botão único sem danificar as peças tumorais com a agulha. Corte a rosca o mais curto possível acima do nó e aplique o molho spray para evitar o noying das suturas.Escaneie o microchip e adicione as informações do tumor ao banco de dados para posterior identificação do animal. Prepare uma gaiola com roupas de cama frescas e material de aninhamento, colocou os ratos na frente de uma lâmpada infravermelha e monitore o animal até que a anestesia diminua. Explantação de PDX.Depois que o tumor PDX atingiu o tamanho necessário, o camundongo é eutanizado por asfixia de CO2 e posterior luxação cervical. Dissecar cuidadosamente a pele do tumor e remover completamente o PDX. Resultados representativos.Coloque um tumor em um prato plástico estéril e use lâminas de bisturi estéreis para processamento posterior. Corte orifício com as fatias, coloque-as em um de histologia e submerse em formalina para gerar espécime embutido para parafina para avaliação histológica mais tarde. Transfira o resto do tumor para a solução de armazenamento de tecidos e crie uma nova amostra congelada de preservação vital e instantânea para o biobanco.Além disso, use os restos do tumor PDX análogo à cultura celular do capítulo para estabelecer linhas de células tumorais secundárias. Para gerar mais PDX, transfira duas ou mais peças tumorais com Matrigel para um novo mouse receptor, como mostrado anteriormente. conclusão. Por meio do protocolo apresentado, conseguimos até agora estabelecer nove linhas de células cancerígenas coloráticas e mais de 100 colorretais derivadas do paciente, além de 19 modelos de PDX colorretal e mais de 150 colorretais.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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