Name: creation and maintenance of a living biobank - how we do it
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

Vi erkänner Jenny Burmeister, vår grafiska assistent, för inspelning och redigering av videon. Vidare tackar vi våra kollegor på kirurg- och patologiska avdelningen för det långvariga samarbetet. Vi vill också tacka Marcus Müller, produktionschef för IT- och mediecentret, University of Rostock, för att ha levererat ljudinspelningsutrustningen och förfinat ljudkvaliteten.
FINANSIERING: Den tyska cancerhjälpsstiftelsen (DKH e.V.), bidragsnummer 108446 och bidragsnummer TBI-V-1-241-VBW-084 från staten Mecklenburg-Vorpommern finansierade delvis denna forskning.

Följande studie har godkänts av universitetssjukhuset Rostocks institutionsgranskningsnämnd (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 och A 2019-0222). Dessutom har alla veterinära relevanta förfaranden godkänts av Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern under registreringsnummer LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 och 7221.3-1-007/19.
1. Experimentella förutsättningar
<ol><li>Uppfylla flera viktiga ramvillkor för att etablera och underhålla en biobank.<ol>
<li>Använd en klinik med kirurgavdelning och tillräckligt många onkologiska samband tillsammans med ett välutrustat labb och tillräckligt med akademisk personal. En bra infrastruktur och en fast förbindelse med en samarbetsvillig patologiavdelning är ytterligare förutsättningar.</li>
		<li>För in vivo-forskning, använd en djuranläggning med bostadsförhållanden som är lämpliga för immunbristmöss.</li>
		<li>Få tillstånd för all forskning om patienthärskat material från en hälso- och sjukvårdsetikkommitté. Få godkännande för all in vivo-forskning från den behöriga myndigheten i enlighet med lokala lagstadgade bestämmelser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Provtagning
<ol><li>Dagen före operationen<ol>
<li>Utvärdera alla patienter med återförslutningsbar kolorektal- eller bukspottskörtelcancer och/eller motsvarande metastaser för biobanksberättigande. Undvik att inkludera fall med neoadjuvant förbehandling, mycket små tumörer, tumörer av osäker värdighet eller skador som delvis har resected endoskopiskt tidigare.</li>
		<li>Få skriftligt godkännande av patientens deltagande under den informerade samtyckesdiskussionen om det kirurgiska ingreppet. Informera i tid alla involverade kirurger, laboratorieteamet såväl som patologen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anskaffning av prov<ol>
<li>Informera alla skötare i operationsrummet (OR) om vävnadsinsamlingen för biobanken omedelbart innan det kirurgiska ingreppet påbörjas. OBS: Det är viktigt att vävnaden inte får fixeras i formalin. Om vävnaden är nedsänkt i formalin blir den olämplig för integrerad biobanking.</li>
		<li>Dra 40 ml hepariniserat blod (2 x 20 ml spruta) samt ett standardserumrör på 7,5 ml omedelbart efter bedövning och överför snabbt till labbet för PBL-isolering och serumbehandling (se steg 3-4).</li>
		<li>Hämta det återförslutna provexemplaret direkt från operationsbordet, placera det i en lämplig behållare och ta det till den patologiska avdelningen. Skriv ner tidspunkten för avlossning från cirkulationen, sambandet och ankomsten till patologi. OBS: Provexemplarets lämplighet för biobanker bör bedömas av den samarbetsvilliga patologen som dissekerar en bit tumör och icke-malign vävnad. Ta inte bort några delar av provet själv som kan äventyra den efterföljande patologiska rapporten.</li>
		<li>Placera båda vävnadsbitarna i ett separat 15 till 50 ml polypropylenrör med 10 till 30 ml vävnadslagringslösning (eller DPBS) på is. Skriv ner mottagningstiden och överför proverna omedelbart till labbet. OBS: Följande protokollsteg 3-6 måste utföras i ett laminärt flödesskåp under strikta sterila förhållanden. Använd alla vätskor vid rumstemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Serumbearbetning
<ol><li>Centrifugera serumröret på 7,5 ml vid 1128 x g och 4 °C i 15 minuter i en förkyld centrifugering.</li>
	<li>Alikvot 1 ml serum per rör i förmärkta kryotuber och frys i flytande kväve.</li>
</ol>4. Isolering av PBL genom densitetsgradientcentrifugation
OBS: Arbeta parallellt med var och en av de två 20 ml-sprutorna.
<ol><li>Fyll 20 ml hepariniserat blod i ett 50 ml polypropylenrör och tillsätt 15 ml DPBS.</li>
	<li>Ta 15 ml Pancoll med en serologisk pipett, sätt försiktigt in pipetten hela vägen till botten av polypropylenröret och släpp Pancoll mycket långsamt för att bilda ett lager under blodet / DBPS-kolonnen.</li>
	<li>Centrifug vid 375 x g i 15 min utan broms.</li>
	<li>Aspirera och överför det ogenomskinliga interfasskiktet mellan mitten och den övre kolonnen av båda proverna till ett friskt 50 ml polypropylenrör och fyll på med DPBS till 50 ml.</li>
	<li>Centrifugera vid 270 x g i 15 min med broms.</li>
	<li>Aspirera och kassera supernatanten, återanvänd cellpelleten i 4,5 ml frysmedium.</li>
	<li>Alikvot 1,5 ml fjädring per kryotube, stäng rören tätt och placera dem i en frysbehållare som är lämplig för långsam frysning och förvara vid -80 °C.</li>
</ol>5. Vävnadsbehandling
OBS: Börja med generering av snap frysta prover av tumör och frisk vävnad för att upprätthålla integriteten hos nukleinsyror.
<ol><li>Tumörvävnadsprov<ol>
<li>Överför tumörprovet med flera ml vävnadslagringslösning från polypropylenröret till en petriskål. Skölj med DPBS om det behövs. Undvik att vidröra provet och använd två sterila skalpeller för att hantera vävnaden. Undvik uttorkning när som helst.</li>
		<li>Väg tumörprovet på en lämplig skala i en separat maträtt och notera vävnadsvikten.</li>
		<li>Utvärdera tumörvävnadens storlek, form och vävnadskvalitet innan du skär. Sikta på att få minst ett stycke om storleken på ett stifthuvud för snäppfrysning och fyra kuber på ca 30 mm3 (kantlängd 3 x 3x 3 mm) vardera för vital kryopreservation. Generera så många 30 mm3-kuber i fyrdubbla som möjligt och generera ett stycke för snäppfrysning per 5 fyrdubbla. Ta också hänsyn till att nekrotiska portioner måste skäras av så att kuberna endast består av vital vävnad.</li>
		<li>Generera skivor med 3 mm tjocklek. Skär av nekrotiska portioner, som kan särskiljas som gelliknande eller flytande massa, och skär skivorna i kuber av de två önskade storlekarna. OBS: Kassera inte någon vävnad vid denna tidpunkt.
</li>
		<li>Fäst frysning<ol>
<li>Etikett cryotubes i enlighet därmed (se steg 7.7).</li>
			<li>Placera en liten vävnadsbit per förmärkt cryotube. Dränk omedelbart proverna i flytande kväve i flera minuter och förvaras vid -80 °C därefter.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cryopreservation av vital vävnad<ol>
<li>Märk cryotubes därefter (se steg 7.7) och fyll var och en med 1,5 ml frysmedium. Placera frysbehållaren bredvid bänken. FÖLJ nästa steg så fort som möjligt. Eftersom DMSO i frysmediet har cytotoxiska egenskaper bör tiden för vävnaden som är nedsänkt i frysmedium utan korrekt kylning inte överstiga 2 minuter.</li>
			<li>Ordna de 30 mm3 kuberna i fyrdubbelt. Knuffa nekrotisk vävnad och andra rester till skålens kant, men kassera dem inte.</li>
			<li>Skopa kuberna med skalpellbladet och överför 4 kuber per kryotube. Se till att tumörbitarna är helt nedsänkta i frysmedium. Stäng rören tätt och placera dem i en frysbehållare som är lämplig för långsam frysning och förvara i en -80 °C frys.</li>
			<li>Överför cryotubes till ett lämpligt lagringssystem för långtidslagring vid -140 °C eller lägre. Dokumentation i laboratorieinventeringshanteringssystemet är obligatorisk.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Friskt vävnadsprov: Upprepa steg 5.1.1. till 5.1.6.4 för det friska vävnadsprovet.</li>
</ol>6. Primär cellkultur
<ol><li>Upplösa resterna av tumörvävnaden, inklusive nekrotiska skrotet, i Petri-skålen med skalpellerna i bitar så små som möjligt.</li>
	<li>Placera en steril cellsil (100 μm porstorlek) ovanpå ett 50 ml polypropylenrör.</li>
	<li>Använd en serologisk pipett för att lägga till 5-10 ml DPBS till Petri-skålen, flyta vävnadsresterna och pipetten upp och ner för att generera en suspension.</li>
	<li>Överför fjädringen med pipetten till cellsilen.</li>
	<li>Upprepa steg 6.3-6.4 tills alla vävnadsrester är lösta från Petri-skålen.</li>
	<li>Använd kolven på en 20 ml enkelspruta för att pressa cell- och vävnadsupphängningen genom cellsilen.</li>
	<li>Skölj med 5-10 ml färska DPBS, kassera cellsilen och stäng röret ordentligt.</li>
	<li>Centrifugera suspensionen vid 180 x g i 5-10 minuter.</li>
	<li>Förbered en kollagen-I förbelagd 6 brunnsplatta med 1,5 ml medium per brunn.</li>
	<li>Aspirera och kassera supernaten. Återanvänd pelleten i 3 ml DPBS eller medium och tillsätt 500 μL av suspensionen till varje brunn. Placera plattan i inkubatorn (100% luftfuktighet, 5% CO2,37 °C)</li>
	<li>Övervaka plattan dagligen för celltillväxt och kontaminering. OBS: Ytterligare cellodling fram till etableringspunkten för en permanent cellinje beskrivs inte här.</li>
</ol>7. PDX-generering
<ol><li>Utför in vivo-experiment endast av lämpligt kvalificerade personer som uppfyller kraven från den behöriga myndigheten i din jurisdiktion.</li>
	<li>Hus immunodeficient möss under specifika patogen-fria (SPF) villkor som uppfyller kraven för den använda musstammen. De hygieniska åtgärderna omfattar individuellt ventilerade burar, autoklaverad mat, vatten och bomaterial samt ett säkerhetsluftlås och slitage på personlig skyddsutrustning.</li>
	<li>Autoklavera alla instrument i förväg och använd endast en uppsättning instrument för varje tumörfall för att undvika korskontaminering. Hantera tumörvävnaden så aseptisk som möjligt. Alla plastartiklar som nämns nedan ska vara sterila, engångsbruk och kasseras efter varje operation. OBS: Bestäms av metoden att frysa fyra tumörvävnad bitar per cryotube, PDX generation kräver alltid två möss per prov, helst resulterar i fyra PDX tumörer.</li>
	<li>Välj önskad primär tumör för engraftment via laboratorieinventeringshanteringssystemet och överför provet (vitalt bevarad tumörvävnad) från huvudlagringstanken till en bärbar flytande kvävebehållare (Mellanlagring vid -80 °C på torris är också bekvämt).</li>
	<li>Sätt på personlig skyddsutrustning innan du går in i SPF-sektionen (scrubs, träskor, förkläde, hårskydd, kirurgisk mask och överskor), desinficera dina händer och all utrustning.</li>
	<li>Matrigel blötläggning<ol>
<li>Ta bort kryotuben från behållaren för flytande kväve och vänta på upptining av provet.</li>
		<li>ML polypropylenrör på 50 ml och fyll med 35 ml DPBS.</li>
		<li>Luta kryotuben upp och ner och överför innehållet omedelbart till polypropylenröret så snart vävnadsmediet kan flyttas. Skölj försiktigt tumörvävnadsbitarna, kassera huvudvolymen från röret i ett separat kärl, stäng locket och lägg röret uppsida ner, så att de fyra vävnadsbitarna samlas i locket.</li>
		<li>Lägg en Petri-skål på kylackumulatorn och placera 100 μL Matrigel som en droppe i mitten. Använd anatomiska tång för att överföra tumörbitarna till Matrigel. Se till att varje bit är helt täckt med Matrigel. Inkubera i 10 minuter vid 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Musbedövning (2 möss per prov, arbeta parallellt)<ol>
<li>Bered en 3:1- buljong av en ketaminlösning (100 mg/ml) och xylazin (20 mg/ml). Rekommenderad dos är 90/6 mg/kg kroppsvikt.</li>
		<li>Väg musen och dra upp den nödvändiga bedövningslösningen i en insulinspruta för engångsbruk.</li>
		<li>Placera musen på burets rutnät, dra svansen försiktigt med en hand för att inducera en framåtrörelse och samtidigt krabba nacken med ett nypgrepp på den andra handen. Lyft upp gallrets mus och vrid på hållhanden, så att djurets rygg vilar på handflatan. Immobilisera ett av bakbenen med lillfingret och injicera narkotikan intraperitoneally. Sätt tillbaka musen i buren och invänta induktion av narkotika.</li>
		<li>Placera den bedövade musen på värmeplattan och täck ögonen med salva för att undvika hornhinnaskador. Rövar djupet av anestesi genom att försiktigt nypa musens bakfot med kirurgiska tång. OBS: Frånvaron av rörelse indikerar djup narkotika. Varje form av rörelse kräver antingen mer tid för att nå önskat narkotiskt djup eller en extra dos bedövningsmedel.</li>
	</ol></li>
	<li>Kirurgiskt ingrepp<ol>
<li>Forma en hudveck genom att nypa musens hals och injicera mikrochipet subkutant med applikatorn (Se steg 9 för programmeringsdetaljer)</li>
		<li>Raka musens flanker om det behövs (NMRInu/nu möss kräver inte rakning), applicera povidone-jod med en bomullspinne och använd kirurgiskt draperi för att skapa ett sterilt fält.</li>
		<li>Lyft flankens hud med kirurgiska tångar, gör ett litet snitt på cirka 4 mm och bilda en liten subkutan ficka genom trubbig förberedelse med sax.</li>
		<li>Lägg en tumörbit i varje ficka och placera den i bakänden.</li>
		<li>Fäst änden av en 100 μL pipettspets och aspirera den återstående Matrigeln från Petri-skålen och applicera den lika i varje hudficka.</li>
		<li>Stäng såren med enkla avbrutna suturer och applicera sprutförband.</li>
	</ol></li>
	<li>Skanna mikrochipet och kontrollera giltigheten av mus- och tumör-ID.</li>
	<li>Förbered en ny bur med färska sängkläder och bomaterial, samt en gnagpinne. Vik en "kudde" ur pappershanddukar och lägg ner musen med förhöjt huvud under en infraröd värmelampa.</li>
	<li>Blanda 0,25 ml trimethoprim/sulfamethoxazole (400 mg/80 mg) med 100 ml dricksvatten och administrera via dricksflaskan. Tänk på att en mus förbrukar cirka 150 ml per kg kroppsvikt dagligen. OBS: Eftersom den subkutana PDX-modellen inte är associerad med postoperativ smärta, varken under sårläkningsprocessen eller under tumör utväxt, postoperativa smärtlindring krävs inte. Observera att djurskyddsriktlinjerna för din institution/myndighet kan skilja sig åt.</li>
	<li>Övervakning av försöksdjur<ol>
<li>Övervaka mössen dagligen för tecken på ångest. Detta kan delegeras till kvalificerade djurskötare.</li>
		<li>Fortsätt den postoperativa antibiotikabehandlingen med ovannämnda dos i 4 veckor. Byt ut antibiotikablandningen två gånger i veckan.</li>
		<li>Mät tumörstorleken minst en gång i veckan, helst dagligen, med en bromsok (tumörvolym = 0,52 x längd x bredd x höjd [mm3]) och registrera i databasen.</li>
	</ol></li>
</ol>8. PDX skörd och bearbetning
<ol><li>Skörda och bearbeta PDX-tumören när: Tumörstorleken når målvolymen 1.500 mm3. Det tumörbärande djuret visar tecken på ångest och/eller sjukdom och behandlingen är meningslös. Tumören blir ulcerated eller tränger in i musens hud.</li>
	<li>Läs mikrochipet för att identifiera rätt PDX.</li>
	<li>Avliva musen med en juridisk metod (beroende på nationella riktlinjer) som till exempel CO2-kvävningeller ketamin/xylazininjektion följt av livmoderhalsförskjutning.</li>
	<li>Lyft huden med kirurgiska tång vid flankerna och incise med Metzenbaum sax några millimeter långt från tumören.</li>
	<li>Lossa huden ovanför tumören genom trubbig förberedelse, ta sedan försiktigt tag i tumören med anatomiska tång och lossa tumören från kroppens ytliga fascia.</li>
	<li>Skölj tumören med DPBS, lägg den i en petriskål och ta bort intilliggande bindväv.</li>
	<li>Utför nu något av följande:<ol>
<li>Kapa 30 mm3 kuber och skapa nytt PDX (Fortsätt med protokollet vid punkt 7.7.4).</li>
		<li>Skär tumören i skivor, som sedan överförs till histologikassetter och bevaras i 4% formaldehyd för senare paraffin inbäddning.</li>
		<li>Bevara tumören i ett rör med vävnadslagringslösning för att lägga till den i biobanken (Fortsätt med protokollet i steg 3.) och/eller skapa PDX-härledda cellinjer (Fortsätt med protokollet i steg 4.)</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Biobank och datahantering
<ol><li>Tilldela ett internt ID till varje tumörfall enligt tabell 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Laboratorieplats/namn</td>
			<td>cancerenhet</td>
			<td>på varandra följande ärendenummer</td>
			<td>Specifikation</td>
			<td>på varandra följande nummer</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td>C=kolorektal</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>_Met=Metastasering</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>P=bukspottskörtel</td>
			<td>_Tu=Tumör</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Exempel: HROC389_Met2 = Rostock, kolorektal cancer, fall 389, andra metastasering</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Definition av prov-ID:
<ol start="2"><li>Förvara patientens samtycke i elektronisk form och pappersform tillsammans med tumör-ID.</li>
	<li>Samla in så mycket kliniska data som möjligt och lagra dem anonymiserade och separat.</li>
	<li>Använd ett datahanteringsprogram (t.ex. Freezerworks) eller annat och skapa ett gränssnitt med en etikettutskriftsprogramvara för att generera temperaturbeständiga, självhäftande streckkodsetiketter.</li>
	<li>Lägg till ett nytt prov genom att öppna datahanteringsprogrammet, definiera provtypen och registrera följande information: tumör-ID, vävnadstyp, frysmetod, datum, ansvarig medarbetare, passagenummer, mus-ID och musstam.</li>
	<li>Tilldela proverna till specifika positioner i lagringstanken.</li>
	<li>Spårning och övervakning av PDX (gäller steg 7-8)<ol>
<li>Använd en MS Access-databas (eller ett liknande system) på en bärbar, Bluetooth-aktiverad enhet (bärbar dator eller surfplatta) för att registrera tumör-ID, datum för implantation, datum för dödshjälp, musålder och belastning samt tumörtillväxt över tid.</li>
		<li>Anslut mikrochipläsaren till enheten och läs mikrochipet före implantationen.</li>
		<li>Tilldela varje mus ett specifikt ID. Vi använder följande system: (se tabell 2 nedan)</li>
		<li>Efter implantation, registrera ID tillsammans med musegenskaperna i databasen.</li>
		<li>Läs om mikrochipet och kontrollera om specifikationerna för mikrochipet, databasen och cryotube-etiketten är konsekventa.</li>
		<li>Skapa en etikett för varje musbur i enlighet därmed. OBS: För att skapa en fysisk säkerhetskopiering, stick cryotube-etiketterna med motsvarande mikrochipetiketter i ett häfte och anteckningsdatum och musstam.</li>
		<li>För att övervaka tumörtillväxten hos det enskilda PDX, skanna musens mikrochip med läsaren ansluten till databasenheten för identifiering och registrera tumörstorleken mätt med bromsok varje vecka.</li>
		<li>Planera den idealiska tidspunkten för PDX-skörd genom att analysera tumörens tillväxtkurva.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tumör-ID</td>
			<td>Tidigare lagring i N2 (=f)</td>
			<td>Passagenummer (=T)</td>
			<td>på varandra följande musnummer (=M)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Exempel: HROP12 fT0 M1 = Rostock, bukspottskörtelcancer, fall 12, genererad från frusen primärvävnad, första passagen, mus 1.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Definition av PDX-ID:

<ol>
	<li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies.">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies.">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer.">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li><li>Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+bacterial-immunotherapy+with+therapeutic+antibodies:+a+novel+therapeutic+concept.">Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept.</a> Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).</li><li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs.">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research.">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li><li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn's+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft.">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671 (2016).</li><li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts:+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features.">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li><li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models.">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).</li><li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+(PDX)+models:+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine.">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981 (2018).</li><li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research:+a+systematic+review.">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice.">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts:+a+potential+pitfall.">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li><li>Prall, F., Maletzki, C., H&#252;hns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment.">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).</li><li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability.">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li><li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics.">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), 1138-1150 (2013).</li><li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors.">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li><li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype.">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).</li><li>Katsiampoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+Patient-Derived+Xenografts+in+Colorectal+Cancer.">Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).</li><li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy.">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li><li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+model+supports+development,+function,+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells.">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li><li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts.">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Abe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+phosphoproteomic+analysis+for+phosphosignaling+and+active-kinome+profiling+in+Matrigel-embedded+spheroids+and+patient-derived+organoids.">Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids.</a> Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li></ol>

Genereringen av en levande biobank förutsätter, förutom att följa de rättsliga bestämmelserna om integritet, medicinsk rätt och djurskydd, en bra infrastruktur och ett väl samordnat team. Det har visat sig fördelaktigt att direkt involvera en del av den kirurgiska personalen i forskningsförfarandena, eftersom de mycket väl kan bedöma lämpligheten hos den enskilda patienten för vävnadsdonation. Dessutom tenderar patienter att samtycka till biobankning oftare, när deras skriftliga godkännande erhålls inom ramen för den kirurgiska informerade samtyckesdiskussionen. För att spara tid och resurser bör fall som förmodligen kommer att ge otillräckliga mängder tumörvävnad inte väljas för biobanking. När det gäller provförvärv är maximen "kommunikation är nyckeln" en enkel, men ofta förbisedd sanning. Det krävs bara en enda oinformerad teatersköterska eller kirurgisk kollega för att förstöra exemplaret redan från början genom att fortsätta som vanligt och lägga till formaldehyd till sambandsprovet. Därför är det helt avgörande att varje enskild medlem av den berörda personalen bekantar sig med SOP för biobanking. Kirurger bör märkas dagen före och precis i början av proceduren om planerad vävnadsuppsamling. Dessutom bör fall som valts ut för biobanking lyftas fram i den elektroniska ELLER-planen. Vävnadsskörd från det kirurgiska provet bör utföras av en patolog. För det första kommer detta att säkerställa att vävnadsskörden inte stör den slutliga patologiska rapporten. För det andra ökar detta sannolikheten för att få vävnad med tillräckliga mängder livskraftig cancervävnad. Särskilt i bukspottskörtelcancer med en uttalad desmoplastisk reaktion och frekventa nekrotiska områden är livskraftiga delar svåra att identifiera makroskopiskt för det otränade ögat. Som ett undantag från denna regel, vävnad block från stora lever eller pulmonal metastaser, kan ibland strukits "back-table" av kirurgen, om kirurgiska marginaler kan definieras makroskopiskt. Ändtarmscancer som återförsluts av total mesorektal excision (TME), kanske inte är lämplig för biobanking, eftersom vävnadsskörd från det återförslutna provet före paraffininbäddning kan störa TME:s kvalitetsbedömning. Alternativt kan vävnad för biobanking förvärvas genom transanal biopsi av rektal cancer.
Etableringsgraden för primära cellkulturer som härrör från den ursprungliga tumören är i allmänhet låg. PDX-härledda, sekundära cellkulturer kan mer sannolikt etableras. Vi rekommenderar testning av olika medier för varje enskilt fall och användning av antibiotikatillskott för de första passagerna för att minska föroreningen till ett minimum eftersom den skördade vävnaden sällan är steril. Efter framgångsrik förökning bör varje enskild cellinje bekräftas som en cancercelllinje genom FACS-analys och regelbundet testas för mykoplasmaförorening. För att utesluta korskontaminering rekommenderas regelbunden STR-analys. Det bör noteras att etableringsprotokollet för primära och sekundära cellinjer ständigt utsätts för optimering. Detaljer om enskilda mediers sammansättning och framgångsgrad ligger klart utanför detta arbetes tillämpningsområde och kommer att offentliggöras separat.
För PDX engraftment, tumör vävnad kan antingen implanteras direkt efter samband eller cryopreserved i fetala kalv serum med 10% DMSO eller liknande frysande medier för fördröjd implantation. Implantation omedelbart vid tumör vävnad skörd sätter en påfrestning på logistik och laboratoriepersonal, och xenografting resultat efter cryopreservation är inte sämre alls 10. Dessutom ökar inkubationen av vävnaden i Matrigel före tumörimplantation avsevärt engraftmenthastigheter12. Vi rekommenderar fördröjd engraftment efter bestämda patologiska konstaterande och omedelbar bortskaffande av felaktigt insamlade vävnad exemplar. Eftersom framgångsgraden för primär engraftment ökar med immunbrist hos mottagarmusen tenderar vi att använda NSG-möss för den allra första PDX-passagen. Efter den första framgångsrika PDX-ingraftmenten kan och bör NMRInu/nu-möss användas för efterföljande passager och vävnadsexpansion. Denna stam är mer robust, billigare och lättare att odla jämfört med NSG eller liknande immunbriststammar, men visar fortfarande rimliga engraftmenthastigheter. Dessutom underlättar dess nakenhet implantation och tumörtillväxtövervakning. För att öka engraftmenthastigheten i efterföljande passager rekommenderar vi direkt överföring av nyskördade PDX-vävnader för att vara värd för möss när det är möjligt, särskilt för långsamt växande PDX och fall med låg primär engraftment framgångsgrad. Collins och Lang granskade nyligen 14 studier av kolorektal PDX etablering och rapporterade engraftment priser varierar från 14 till 100% med en median PDX etableringsgrad på 68%, den senare överensstämmer med våra resultat13. I linje med litteraturen observerade vi lägre etableringshastigheter för bukspottkörtel jämfört med kolorektalcancer PDX14. Oavsett värdmus stam och tumör enhet, utväxten av mänskliga, Epstein-Barr Virus (EBV)-associerade B-cells lymfom och murin lymfom vid implantationssidan utgör en viktig fallgrop15,16. Om okänd, sådana tumörer kan "förorena" efterföljande passager och därmed förvirra på varandra följande resultat. Ovanligt snabb PDX tillväxt och svullnad av massundersökning, axillar och ljumskar lymfkörtlar är starka indikatorer på murin lymfom tillväxt, men regelbunden histologisk undersökning av PDX är ändå tillrådligt. Dessutom bör genetisk överensstämmelse mellan PDX och motsvarande donatorpatient testas regelbundet genom STR-analys. Helst bör biobanken kopplas till en klinisk databas som omfattar patienters egenskaper (allmän information, överlevnad, återfallsfri överlevnad, terapi, sekundär neoplasi etc.). På grund av rättsliga bestämmelser om integritetsskydd och brist på en sådan anonymiserad databas administreras och uppdateras vår kliniska datauppsättning regelbundet manuellt av de samarbetsvilliga läkarna.
Medan konventionella biobanker är begränsade till observatorieforskning, ger en levande biobank möjlighet till in vitro- och in vivo-interventioner. Patientbaserade cellinjer är ett viktigt verktyg för grundforskning, läkemedelsscreening med hög genomströmning och bedömning av nyaläkemedelsmedel 4. Motsvarande PDX-modeller är dock av ökande betydelse, eftersom de nära rekapitulerar histologin hos den ursprungligatumören 17,18 och visar en hög genetisk stabilitet över flera passager19,20. Vår PDX biobank har visat sig vara en utmärkt plattform för preklinisk och grundforskning6,21. Eftersom stora PDX-samlingar på ett adekvat sätt återspeglar patientpopulationens interpersonella heterogenitet har pdx-metoden (pct) (ett djur per modell och behandling) fått betydelse för läkemedelsutvecklingen eftersom det möjliggör trofast förutsägelse av kliniskt svar på nya läkemedel och kombinatorisk regim8. Vi utvärderar också för närvarande nya experimentella läkemedel i små PCT-studier.
Trots dessa lovande resultat hindrar medianinrättningens varaktighet på 12, 2 månader, pdx-modellernas kliniska tillämplighet som "avatarmöss" för testning av behandlingsalternativ mot cancer, åtminstone för de patienter som behöver omedelbar adjuvans eller till och med neoadjuvant behandling22. En ytterligare nackdel med standard PDX-modeller är bristen på användbarhet för immunterapitestning på grund av värdmössens immunbrist. För att övervinna dessa begränsningar har flera "humaniserade" musstammar utvecklats. Dessa möss är kraftigt immunkomprometterade, men kan rekonstitueras med olika typer av mänskliga benmärgs-härledda celler eller CD34+ hematopoetiska stamceller efter PDX utväxt23, vilket möjliggör utvärdering av lymfocytmedierad cytotoxicitet och behandlingssvar mot immun checkpoint-hämmarebehandling24,25.
Under de senaste åren har patientbaserade organoider (PDO) dykt upp som viktiga cancermodeller som konkurrerar med PDX. Härrör från intakt tumör bitar och odlas i en extracellulär matris byggnadsställning, återspeglar dessa tredimensionella strukturer nära de histologic och genetiska egenskaperna hos den ursprungliga tumör. Möjligheten till långsiktig expansion och kryopreservation gör PDO till ett idealiskt komplement till en levande biobank26,27. Förutom en relativt hög etableringsgrad har tillförlitlig läkemedelsresponsförutsägelse rapporterats för PDO för flera tumörenheter28. Dessutom har PDO till och med genererats från cirkulerande tumörceller och även samtidig etablering av organoider från motsvarande friska vävnad är möjlig, vilket möjliggör bedömning av behandlingsrelaterad toxicitet på patient-individuell basis29,30. Men jämfört med konventionella 2D-cellkulturer är organoidkultur tidskrävande och resurskrävande och konstgjorda extracellulära matrisföreningar kan störa vissa analytiskaförfaranden 31. Dessutom är cancerorganoider mottagliga för överväxt genom snabbare växande, icke-maligna organoider som härrör från hälsosamt epitel30. På grund av brist på stroma, blodkärl och immunceller är PDO mestadels oanvändbara för testning av antiangiogena immunterapeutiska medel. Ändå tillåter nya odlingsmetoder modellering av tumörmikromiljö in vitro, vilket gör PDO: er till en sann utmanare för PDX-modellerna32. Inom en snar framtid kommer patient-individuella tumörmodeller, i kombination med kraftfulla genetiska verktyg som nästa generations sekvensering, förhoppningsvis att bana väg för sann precisionsmedicin och skräddarsydda behandlingsmetoder.

Under de senaste åren har den samlade kunskapen om cancerns morfologiska, kliniska och genetiska egenskaper lett till uppfattningen om cancer som en heterogen, individuell sjukdom. Följaktligen har mutational karakterisering av tumörer, förutom kliniska och patologiska funktioner, fått betydelse för kliniskt beslutsfattande och många riktade terapier utvecklades för olika molekylära förändringar. Till exempel kan effekten av cetuximab vid kolorektal cancerbehandling förutsägas genom analys av KRAS och PIK3CA mutationsstatus1. Precisionsmedicin syftar till ett skräddarsytt tillvägagångssätt för att ge högsta behandlingssvar hos varje patient och undvika toxicitet hos inefficacious terapier2. Biobanker innehåller vävnad, blod och andra biologiska material hos cancerpatienter, som är kopplade till kliniska data, och är därmed ett utmärkt verktyg för translationell cancerforskning. På grund av det stora antalet kliniska prover möjliggör biobanker påvisande av sällsynta, men potentiellt läkemedelspliktiga mutationer, vilket ger nya behandlingsmöjligheter för den enskilda patienten3.
För att täcka ett så brett forskningsspektrum som möjligt begränsade vi inte vår aktivitet enbart vid provskörd, utan fokuserade på etablering av patientbaserade cancercelllinjer och xenografter (PDX). Traditionella 2D-cellinjer förblir hörnstenen i in vitro-forskning och är det främsta valet för storskaligadrogscreeningar 4,5. Dessutom är celllinjeanalys ofta enklare, billigare och mer lättillgänglig. Dessutom, eftersom patienten-härledda perifert blod lymfocyter (PBL) finns tillgängliga, kan även tumör immunologi studeras in vitro6. Majoriteten av nyutvecklade läkemedel med lovande preklinisk effektivitet i cellbaserade in vitro- eller in vivo-experiment har dock visat nedslående resultat i kliniska prövningar7. Däremot har prekliniska studier baserade på PDX in vivo-studier återspeglat den kliniska aktiviteten hos antineoplastiska medel mycket mer troget8. Eftersom PDX-vävnad nära återspeglar donatortumörens histologiska och molekylära egenskaper är PDX-modeller ett bra sätt att sprida de ofta mycket begränsade mängderna livskraftig tumörvävnad för att upprätthålla integriteten hos en biobank och för att möjliggöra utbyte av prover mellan forskargrupper och institutioner. Dessutom kan cancercelllinjer som härrör från PDX-vävnad etableras betydligt lättare än primära cancercellslinjer9. Under de senaste åren har vår arbetsgrupp inrättat en omfattande integrerad biobank för kolorektal- och bukspottskörtelcancer genom att stegvis standardisera och optimera arbetsflödet för alla biologiska prover i fråga (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> Bild 1:Biobankens arbetsflöde och organisation <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här siffran.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacillol&#174; AF; 1L</td>
			<td>Bode, Hartmann</td>
			<td>REF 973380</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 15ml; sterile</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>GBO Cat. No.:188271</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 50ml, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Order number: 62.547.254</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 20ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 300296</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Item number: 01.1601</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological Pipette 10ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 86.1254.001</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy ratiolab&#174; accupetta</td>
			<td>Ratiolab</td>
			<td>Item number: RL3200300</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>VWR Cat.No: 613-4438</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS; w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-36500</td>
			<td>washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll human</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-60500</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-41500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P40-47500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-80100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P10-023100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>VWR Cat.No: A3672.0250</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)</td>
			<td>selfmade</td>
			<td>---</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotube- CryoPure 2ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well cell culture plate; steril; with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>Cat.-No.: 657 160</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Cat. No.: 82.1472.001</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blades</td>
			<td>B.Braun (Aesculap)</td>
			<td>REF BB510</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309110</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer; yellow; 100&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF 352360</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>biocision</td>
			<td>Item number: 210004</td>
			<td>cooling container with -1&#176;C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar&#160;transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm</td>
			<td>KGW</td>
			<td>Cat. No.: HT39.1</td>
			<td>transport system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.760.002</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.762.411</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200&#181;l, yellow</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.082</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000&#181;l, blue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.120</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator&#160; BB 6220 CU</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat.-No.: 51012839</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating plate PR&#196;ZITHERM</td>
			<td>Harry Gestigkeit GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Zeiss Primo Vert</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>Serial number. 3842000839</td>
			<td>imaging cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench Safe flow 1.8 nunc</td>
			<td>nunc GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>---</td>
			<td>sterile working bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer -80&#176;C</td>
			<td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance MP-300</td>
			<td>Chyo</td>
			<td>---</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine, U100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 324826</td>
			<td>injection anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%; 25ml</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>approval number: 6293841.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td>
			<td>CP-Pharma GmbH</td>
			<td>approval number: 401650.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GES3S Reader</td>
			<td>Datamars</td>
			<td>not available</td>
			<td>RFID reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td>
			<td>Peddymark</td>
			<td>---</td>
			<td>RFID chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotrim-ratiopharm&#174;&#160;Ampullen SF 480&#160;mg/5&#160;ml</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>PZN-03928197</td>
			<td>antibiotic drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate #FM-20 42x28cm</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Electric Petra, Burgau</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>PZN-01578675</td>
			<td>Eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anatomical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD21 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD50 1 R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BC05 6R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle&#160;holder</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BH1 1 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>XN8870.P32</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opsite moisture vapour permable spray dressing</td>
			<td>Smith&#38;Nephew</td>
			<td>REF 66004978, PZN- 02063507</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aperture drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>REF 904622</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze swap Gazin&#174;; steril; 10x10 cm</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 18506</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raucotupf cotton tipped applicators</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 11969</td>
			<td>applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat.-No.: 354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>Item number: 18839</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#174; Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>Order No.:130-100-008</td>
			<td>storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formafix 4%</td>
			<td>Grimm med. Logistik GmbH</td>
			<td>Item number: F10010G</td>
			<td>fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software FreezerworksBasic</td>
			<td>Dataworks Development, Inc</td>
			<td>---</td>
			<td>sample organization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra TLP 2844 printer</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>---</td>
			<td>label printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation and maintenance of a living biobank - how we do it

Mot bakgrund av den växande kunskapen om cancers inter-individuella egenskaper och heterogenitet kräver det framväxande området personlig medicin en plattform för preklinisk forskning. Under de senaste åren har vi etablerat en biobank av kolorektal och bukspottskörtelcancer bestående av primär tumörvävnad, normal vävnad, serum, isolerade perifera blodlymfocyter (PBL), patient-härledda xenografter (PDX), samt primära och sekundära cancer cellinjer. Eftersom den ursprungliga tumörvävnaden är begränsad och etableringshastigheten för primära cancercelllinjer fortfarande är relativt låg, tillåter PDX inte bara bevarande och förlängning av biobanken utan också genereringen av sekundära cancercelllinjer. Dessutom har PDX-modeller visat sig vara den perfekta in vivo-modellen för preklinisk drogtestning. Biobanking kräver dock noggrann förberedelse, strikta riktlinjer och en väl anpassad infrastruktur. Kolektomi, duodenopancreatectomy eller resected metastaser exemplar samlas omedelbart efter samband och överförs till patologi avdelningen. Med respekt för prioriteringen av en opartisk histopatologisk rapport, efter eget gottfinnande av den deltagande patologen som utför dissekeringar, små tumör bitar och icke-tumör vävnad skördas. 
Nekrotiska delar kasseras och den återstående tumörvävnaden skärs i små, identiska kuber och kryopreserveras för senare användning. Dessutom är en liten del av tumören hackad och ansträngd för primär cancercellskultur. Dessutom behandlas blodprover som tagits från patienten pre- och postoperatively för att erhålla serum och PBLs. För PDX-engraftment tinas och implanteras de kryopreserverade exemplaren subkutant i flankerna av immunbristmöss. Den resulterande PDX recapitulate histologin av "givaren" tumörer och kan antingen användas för efterföljande xenografting eller cryopreserved för senare användning. I följande arbete beskriver vi de enskilda stegen för skapande, underhåll och administrering av en stor biobank av kolorektal och bukspottskörtelcancer. Dessutom lyfter vi fram de avgörande detaljer och varningar som är förknippade med biobanking.

I våra händer var etableringsgraden för primära cellkulturer (Figur 2A & B) 12,9% i en stor serie9. Majoriteten av försök att isolera expanderbara tumör celler från färska kirurgiska resected exemplar misslyckades på grund av brist på utväxt eller tidig förorening. Celllinje etablering ansågs framgångsrika efter 3 passager med en stadig tillväxt under standard kultur förhållanden (DMEM, 10% FCS, standard kultur fartyg) och validering av epitelial differentiering via FACS-analys10. Cellinjer från PDX tumörer (Figur 2C & D) visade en högre etableringsgrad på 23,6% vilket också beror på möjligheten till repetitiva försök i motsats till primära resected tumörer9. Vissa blandade kulturer (figur 2E) kan dock inte befrias från fibroblastisk tillväxt eller går till och med förlorade på grund av fibroblast överväxt (Figur 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> Figur 2: Cellkultur. Primära cancer cellinjer, härrör från en metastasering av tjocktarmscancer fall HROC313, passage 21 (A) och bukspottskörteln cancer fall HROP88, passage 5 (B). PDX-härledda cancer cellinjer av kolon PDX HROC285 T0 M2 (D) och bukspottskörteln PDX HROP10 T5 M2, passage 4 (E). Blandad odling av fibroblaster och cancerceller från bukspottskörtelcancer HROP75, passage 8 (C) och fibroblastisk överväxt (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Med tanke på förändringar i PDX-genereringsprotokollet, musstammar som används och även experimenterare under flera år, liksom stora skillnader i mängden tumörvävnad som är tillgänglig för engraftment, är det inte trivialt att ge den totala framgångsgraden för PDX-generationen. I en mycket ny serie PDX-generationsexperiment utförda av två forskare (S.M. och F.B.), observerades primära utväxthastigheter på 63% för kolorektal PDX (en exemplarisk histologi kan avbildas från figur 3A) och 48% för bukspottskörteln PDX (Figur 3B). Utväxten av murin eller mänskliga lymfom på implantationsstället är relativt sällsynt, men kan efterlikna framgångsrik PDX-utväxt (Figur 3C). Förutom histopatologisk undersökning bekräftades överensstämmelsen mellan PDX-modeller och deras donatorpatienter regelbundet genom kort tandemrepetition (STR) analys(figur 3D). För närvarande består biobanken av >50 primära och >50 sekundära kolorektal, 3 primära och 6 sekundära bukspottskörtelcancer cellinjer samt >150 kolorektal och 19 bukspottskörteln PDX modeller.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> Figur 3: Representativ histologisk jämförelse av kolorektal (A) och bukspottskörteln PDX (B). Humant lymfom på implantationsstället som efterliknar PDX utväxt (C). Genetisk identitet testning av en PDX modell (HROC430 T1 M2) till den ursprungliga patienten tumör vävnad (HROC430Tu) genom kort tandem upprepa (STR) analys. Jämförelse av de nio STR lokus, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM-färgämne) och D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX-färgämne) med multiplex PCR med fluorescerande märkta primers efter kapillärelektrofores bekräftade genetisk överensstämmelse mellan PDX och donatortumör (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

I följande arbete beskriver vi de på varandra följande stegen som krävs för att etablera en stor biobank av kolorektal och bukspottskörtelcancer.

Skapande och underhåll av en levande biobank - Hur vi gör det

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Skapande och underhåll av en levande biobank hur vi gör det. Införandet. Traditionella biobanker innehåller ofta icke-livskraftig vävnad och blodprover. Trots att de på ett adekvat sätt återspeglar mångfalden av cancerpatientpopulationer och tillåter genetiska och histologiska analyser, är de olämpliga för prekliniska analyser som utvärderar terapeutiska strategier.En biobank som integrerar även patientbaserade modeller övervinner dessa begränsningar. Möjliggör således funktionell testning för precisionsmedicin. Provförvärv.För biobankning av kolorektal och bukspottskörtelcancer, välj fall med beprövad diagnos samt tillräcklig tumör storlek, informerad koncent av patienten är obligatoriskt. Innan operationen påbörjas, dra 20 ml blod med en hepariniserad spruta och ytterligare 7,5 ml med en serummonovette. Serum bearbetning och PBL isolering.Efter centrifugation vid 1, 128 RCF i 15 minuter vid fyra grader är serumet alikvoterat i en förmärkt kryotube och direkt nedsänkt i flytande kväve. Det hepariniserade blodet överförs till ett polypropylenrör och späds ut med 15 ml PBS. Använd en serologisk pipett för att långsamt underlägga blandningen med 15 ml Pancoll.Efter densitetsgradientcentrifugation tas det ogenomskinliga skiktet som innehåller de mononukleära cellerna upp med en serologisk pipett och överförs till ett nytt PP-rör. Efter tvättning med PBS och pelletering av de mononukleära cellerna genom centrifugering, kassera supernatanten och återanvänd pelleten i frysmedium och dispensera i förmärkta kryotuber. Överför rören till en kylbehållare som är lämplig för långsam frysning med en grad per minut och förvara tillfälligt vid 80 grader.Vävnadsbehandling. Så snart vävnadsprovet återförsluts av kirurgen, lägg det i en lämplig behållare. Undvik under alla omständigheter att vävnaden är täckt av formalin.Transportera så snabbt som möjligt till patologin för excision av tumörmaterial som inte är relevant för patologisk utvärdering av samband marginalerna. Tumör biten bör hanteras så aseptisk som möjligt. Dessutom erhåll ett prov av frisk vävnad och placera båda i separata rör förfyllda med vävnadslagringslösning på is.Återvänd omedelbart till labbet för att påbörja vävnadsbehandlingen under sterila förhållanden. Vävnadsbiten placeras på en steril plastform fylld med vävnadslagringslösning för att undvika uttorkning. För det första, punktskatt en eller flera stiftspetsstora bitar för snäppfrysning beroende på storleken på det erhållna vävnadsprovet.Placera den inhemska vävnaden i förmärkta kryotuber och sänk omedelbart i flytande kväve. Skär den återstående vävnaden i kuber på tre gånger tre gånger tre kubik millimeter. Ta hänsyn till att nekrotisk vävnad måste dissekeras helt men inte kasseras.Ordna kuberna i fyrdubbla för att bestämma antalet alikvoter för vital lagring. Märk ett tillräckligt antal cryotubes och fyll dem i förskott med 1,5 ml frysmedium vardera. Eftersom DMSO i frysmediet är cytotoxiskt, utförs nästa steg snabbt och utan avbrott.Använd ett skalpellblad för att skopa upp fyra vävnadsbitar per rör. Se till att alla bitar är helt nedsänkta i frysmedium helst längst ner på röret och frys snabbt rör med en frysbehållare. Fortsätt på samma sätt med det friska provet.För långtidslagring, lagra alla alikvoter i en flytande kvävetank. Cellkultur. Slipa resterna av tumörvävnadsbehandlingen, inklusive de nekrotiska delarna med skalpellbladen så små som möjligt.Placera en cellsil högst upp på ett sterilt PP-rör och aspirera suspensionen med en serologisk pipett för att passera genom cellsilen. Använd kolven på en engångsspruta för att trycka vävnaden kvar genom cellsilen för att generera en enda cellupphängning. Skölj med PBS och upprepa dessa steg tills det inte finns något material kvar.Ta bort cellsilen och centrifugera suspensionen vid 180 RCF i sju minuter. Under tiden, förbered en kollagen förbelagd sex-brunn platta med olika media kompositioner för att öka sannolikheten för tumör utväxt. Kassera supernaten och återanvänd pelleten i PBS och dela ut 500 mikroliter per brunn.Placera sedan plattan i en standardinkubator. Generering av patient-härledda xenograft. För generering av patientbaserade xenografter hos immunkomprometterade möss bör djuren hållas i en specifik patogenfri miljö.Använd personlig skyddsutrustning bestående av scrubs, förkläde, ansiktsmask, hårskydd och handskar. Efter att ha ordnat din arbetsyta, ta lusttumörprovet från vätskekvävebehållaren. Fyll ett friskt PP-rör med 35 ml PBS och tvätta sedan upptiningsprocessen försiktigt och luta kryoröret upp och ner.Så snart innehållet blir slaskigt hälls det i PBS och sköljer tumörbitarna. Kassera huvuddelen av PBS och töm kuberna i locket. Lägg en steril plastform på en ispåse och tillsätt en droppe med 100 mikroliter Matrigel.Använd tång för att placera tumörbitarna i Matrigel och inkubera tumören i 10 minuter. Under tiden, bedöva två möss. Kontrollera anestesidjupet genom att nypa djurets fot.Varje rörelse indikerar otillräcklig anestesi och kräver antingen lite väntan eller ytterligare dosering. Applicera ögonsalva, nyp musen i nacken och injicera ett mikrochip subkutant. Utför följande steg parallellt.Desinficera mössens flanker och gör ett litet hudsnitt med randig Metzenbaum-sax och bilda en subkutan ficka genom trubbig beredning. Använd anatomiska tång för att sätta in tumörbitarna. Se till att biten är placerad i den bakre änden av hudfickan.Aspirera den återstående Matrigel och fördela lika till alla fyra fickorna. Vänta på härdning av gelén och stäng huden med suturer med en knapp utan att skada tumörbitarna med nålen. Skär tråden så kort som möjligt ovanför knuten och applicera sprutförband för att förhindra noying av suturerna.Skanna mikrochipet och lägg till tumörinformationen i databasen för senare identifiering av djuret. Förbered en bur med färskt sängkläder och bomaterial, placera mössen framför en infraröd lampa och övervaka djuret tills anestesin har minskat. Explantation av PDX.Efter pdx tumör har nått önskad storlek, musen avlivas av CO2 kvävning och efterföljande massundersökning förskjutning. Dissekera försiktigt huden från tumören och ta bort PDX helt. Representativa resultat.Placera en tumör på en steril plastform och använd sterila skalpellblad för vidare bearbetning. Skär hål med skivorna, placera dem i en histologikassett och dränk i formalin för att generera paraffininbäddat prov för histologisk bedömning vid ett senare tillfälle. Överför resten av tumören till vävnadslagringslösning och skapa nytt vitalt bevarat och knäppt fryst prov för biobanken.Dessutom, använd resterna av PDX tumör analoga med kapitel cell kultur för att upprätta sekundära tumör cellinjer. För att generera ytterligare PDX, överför två eller flera tumörbitar med Matrigel till en ny mottagarmus som tidigare visats. Slutsats. Med hjälp av det presenterade protokollet lyckades vi hittills etablera nio bukspottskörteln och mer än 100 kolorektal patient-härledda cancer cellinjer, liksom 19 bukspottskörteln och över 150 kolorektal PDX modeller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hur att studera Basement Membrane styvhet som en Biophysical Trigger vid prostatacancer och andra åldersrelaterade sjukdomar eller metabola sjukdomar

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Utveckling och underhåll av en preklinisk patient Derived Tumör xenograft modell för undersökning av nya anti-cancerterapier

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musmodell av trötthet inducerad av perifera bestrålning

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation av High-Throughput tredimensionella tumör Spheroids för drogkontroll

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Använda 22C 3 Anti-PD-L1 antikropp koncentreras biopsi och cytologi prover från icke-small Cell Lung cancerpatienter

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Utredning av genetiska beroenden med CRISPR-Cas9-baserade konkurrens analyser

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Etablering och analys av tredimensionella (3D) organoider som härrör från patienten prostatacancer Ben metastasering exemplar och deras Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

En reporteranalys för att analysera intronisk mikroRNA-mognad i däggdjursceller

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Molekylära och immunologiska tekniker i en genetiskt konstruerad musmodell av gastrointestinal stromal tumör

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...