Name: creation and maintenance of a living biobank - how we do it
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

Videonun kaydedilme ve düzenlenmesi için grafik asistanımız Jenny Burmeister'ı nazik olarak kabul ediyoruz. Ayrıca, cerrahi ve patolojik bölümdeki meslektaşlarımıza uzun süredir devam eden işbirliği için teşekkür ederiz. Ayrıca Rostock Üniversitesi BT ve Medya Merkezi üretim müdürü Marcus Müller'e ses kayıt ekipmanlarını tedarik ettiği ve ses kalitesini iyi hale getirdiği için teşekkür ederiz.
FINANSMAN: Alman Kanser Yardım Vakfı (DKH e.V.), 108446 hibe numarası ve Mecklenburg-Vorpommern eyaletinden TBI-V-1-241-VBW-084 hibe numarası bu araştırmayı kısmen finanse etti.

<ol>
	<li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies.">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine.">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies.">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer.">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li><li>Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+bacterial-immunotherapy+with+therapeutic+antibodies:+a+novel+therapeutic+concept.">Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept.</a> Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).</li><li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs.">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research.">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li><li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn's+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft.">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671 (2016).</li><li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts:+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features.">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li><li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models.">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).</li><li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+(PDX)+models:+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine.">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981 (2018).</li><li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research:+a+systematic+review.">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice.">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts:+a+potential+pitfall.">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li><li>Prall, F., Maletzki, C., H&#252;hns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment.">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).</li><li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability.">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li><li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics.">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), 1138-1150 (2013).</li><li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors.">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li><li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype.">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).</li><li>Katsiampoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+Patient-Derived+Xenografts+in+Colorectal+Cancer.">Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).</li><li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy.">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li><li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+model+supports+development,+function,+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells.">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li><li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts.">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Abe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+phosphoproteomic+analysis+for+phosphosignaling+and+active-kinome+profiling+in+Matrigel-embedded+spheroids+and+patient-derived+organoids.">Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids.</a> Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li></ol>

Yaşayan bir biyobankanın üretimi, gizlilik, tıp hukuku ve hayvan refahı yasal düzenlemelerine, iyi bir altyapıya ve iyi koordine edilmiş bir ekibe uymanın yanı sıra önazi sağlar. Cerrahi personelin bir kısmını doğrudan araştırma prosedürlerine dahil etmek avantajlıdır, çünkü bireysel hastanın doku bağışına uygunluğunu çok iyi değerlendirebilirler. Ayrıca, hastalar cerrahi bilgilendirilmiş rıza tartışması kapsamında yazılı onayları alındığında biyobankalama ile daha sık rıza gösterme eğilimindedir. Zamandan ve kaynaklardan tasarruf etmek için, biyobankalama için muhtemelen yetersiz miktarda tümör dokusu verecek vakalar seçilmemelidir. Örnek alımı söz konusu olduğunda, maksimum "iletişim anahtardır" basit, ancak genellikle göz ardı edilen bir gerçektir. Her zamanki gibi devam ederek ve rezeksiyon örneğine formaldehit ekleyerek numuneyi en başta mahvetmek için sadece tek bir bilgisiz tiyatro hemşiresi veya cerrahi meslektaşı gerekir. Bu nedenle, ilgili personelin her bir üyesinin biyobankalama için SÇP ile tanışması kesinlikle çok önemlidir. Cerrahlar, planlanan doku toplama ile ilgili prosedürün bir gün önce ve hemen başında fark edilmelidir. Ayrıca, biyobankalama için seçilen durumlar elektronik OR planında vurgulanmalıdır. Cerrahi numuneden doku hasadı bir patolog tarafından yapılmalıdır. İlk olarak, bu, doku hasadının nihai patolojik rapora müdahale etmemesini sağlayacaktır. İkincisi, bu yeterli miktarda canlı kanser dokusu ile doku alma olasılığını arttırır. Özellikle belirgin desmoplastik reaksiyona ve sık görülen nekrotik bölgelere sahip pankreas kanserlerinde, eğitimsiz göz için uygulanabilir parçaların makroskopik olarak tanımlanması zordur. Bu kuralın bir istisnası olarak, cerrahi marjlar makroskopik olarak tanımlanabiliyorsa, büyük hepatik veya pulmonal metastazlardan kaynaklanan doku blokları, zaman zaman cerrah tarafından "arka masa" olarak eksest edilebilir. Toplam mezorektal eksizyon (TME) ile resected rektal kanser biyobankalama için uygun olmayabilir, çünkü parafin gömmeden önce resected örnekten doku hasadı TME kalite değerlendirmesini engelleyebilir. Alternatif olarak, biyobankalama için doku rektum kanserinin transanal biyopsisi ile elde edilebilir.
Orijinal tümörden elde edilen primer hücre kültürlerinin kuruluş oranları genellikle düşüktür. PDX türevli, ikincil hücre kültürleri daha başarılı bir şekilde kurulabilir. Hasat edilen doku nadiren steril olduğundan kontaminasyonu minimuma indirmek için her vaka için farklı ortamların testini ve ilk pasajlar için antibiyotik takviyelerinin kullanılmasını öneririz. Başarılı bir yayılmadan sonra, her bir hücre hattı FACS analizi ile kanser hücre hattı olarak doğrulanmalı ve düzenli olarak mikoplazma kontaminasyonu için test edilmelidir. Çapraz kontaminasyonu dışlamak için düzenli STR analizi önerilir. Birincil ve ikincil hücre hatları için kuruluş protokolünün sürekli optimizasyona tabi tutulduğu unutulmamalıdır. Tek medyanın kompozisyonu ve başarı oranları ile ilgili detaylar açıkça bu çalışmanın kapsamı dışındadır ve ayrıca yayınlanacaktır.
PDX engraftment için tümör dokusu rezeksiyondan sonra doğrudan implante edilebilir veya fetal baldır serumunda% 10 DMSO veya gecikmeli implantasyon için benzer donma ortamı ile kriyoprezervasyon yapılabilir. Tümör dokusu hasadından hemen sonra implantasyon lojistik ve laboratuvar personeline baskı yapar ve kriyoprezervasyondan sonra xenografting sonuçları 10'undandaha düşük değildir. Ayrıca, tümör implantasyonundan önce Matrigel'deki dokunun inkübasyonu, engraftasyon oranlarını önemli ölçüde arttırır12. Kesin patolojik bulgu ve hatalı toplanan doku örneklerinin derhal atılmasını takiben gecikmeli engraftment öneriyoruz. Birincil engraftment başarı oranı alıcı farenin immün yetmezliği ile arttığından, ilk PDX geçişi için NSG fareleri kullanma eğilimindeyiz. İlk başarılı PDX gravürden sonra, NMRInu/nu fareleri sonraki pasajlar ve doku genişlemesi için kullanılabilir ve kullanılmalıdır. Bu suş, NSG veya benzeri immün yetmezlik suşlarına kıyasla daha sağlam, daha ucuz ve üremesi daha kolaydır, ancak yine de makul engraftment oranları gösterir. Ayrıca, çıplaklığı implantasyon ve tümör büyüme takibini kolaylaştırır. Sonraki pasajlardaki engraftment oranlarını artırmak için, özellikle yavaş büyüyen PDX ve düşük birincil engraftment başarı oranına sahip vakalar için, taze hasat edilmiş PDX dokularının mümkün olduğunda konak farelere doğrudan aktarılmasını öneririz. Collins ve Lang yakın zamanda kolorektal PDX kuruluşunun 14 çalışmalarını gözden geçirdiler ve % 68'lik ortanca PDX kuruluş oranı ile% 14 ila% 100 arasında değişen engraftment oranları bildirdiler, ikincisi bulgularımızla tutarlı13. Literatür doğrultusunda kolorektal kanser PDX14'ekıyasla pankreasın kuruluş oranlarının daha düşük olduğunu gözlemledik. Konak fare suşu ve tümör varlığından bağımsız olarak, implantasyon tarafındaki insan, Epstein-Barr Virüsü (EBV) ilişkili B hücreli lenfomalar ve murine lenfomaların büyümesi önemli bir tuzak oluşturur15,16. Tanınmazsa, bu tür tümörler sonraki pasajları "kirletebilir" ve böylece ardışık sonuçları karıştırabilir. Olağandışı hızlı PDX büyümesi ve servikal, aksiller ve kasık lenf düğümlerinin şişmesi murine lenfoma büyümesinin güçlü göstergeleridir, ancak PDX'in düzenli histolojik muayenesi yine de tavsiye edilir. Ayrıca PDX ile ilgili donör hasta arasındaki genetik uyum STR analizi ile düzenli olarak test edilmelidir. İdeal olarak, biyobanka hastaların özelliklerini (genel bilgi, sağkalım, nükssüz sağkalım, tedavi, sekonder neoplazi vb.) içeren bir klinik veritabanına bağlanmalıdır. Gizliliğin korunmasına ilişkin yasal düzenlemeler ve anonimleştirilmiş bir veri tabanının olmaması nedeniyle, klinik veri setimiz işbirliği yapan doktorlar tarafından düzenli olarak yönetilir ve manuel olarak güncellenir.
Konvansiyonel biyobankalar gözlemevi araştırmalarıyla sınırlı olmakla birlikte, canlı bir biyobanka in vitro ve in vivo müdahaleler için fırsat sağlamaktadır. Hasta kaynaklı hücre hatları temel araştırmalar, yüksek verimli ilaç taramaları ve yeni farmasötik ajanların değerlendirilmesi için önemli bir araçtır4. Bununla birlikte, karşılık gelen PDX modelleri, orijinal tümör17,18'in histolojisini yakından özetledikleri ve çeşitli pasajlar üzerinde yüksek genetik stabilite gösterdikleri için artan öneme sahiptir19,20. PDX biyobankamız klinik öncesi ve temel araştırmalar için mükemmel bir platform olduğunu kanıtlamıştır6,21. Ayrıca, büyük PDX koleksiyonları hasta popülasyonunun bireyler arası heterojenliğini yeterince yansıttığından, PDX klinik çalışma (PCT) yaklaşımı (tedavi başına model başına bir hayvan) ilaç gelişimi için önem kazanmıştır, çünkü yeni ilaçlara ve kombinatoryal rejime karşı klinik yanıtın sadık bir şekilde öngörülmesine izin verir8. Ayrıca şu anda küçük PCT denemelerinde yeni deneysel ilaçları değerlendiriyoruz.
Bu umut verici sonuçlara rağmen, 12,2 aylık ortanca kuruluş süresi, PDX modellerinin antikanser tedavi seçeneklerini test etmek için "avatar fareler" olarak klinik uygulanabilirliğini engeller, en azından acil adjuvan veya hatta neoadjuvan tedaviye ihtiyaç duyan hastalar için22. Standart PDX modellerinin ek bir dezavantajı, konak farelerin immün yetmezliği nedeniyle immünoterapi testi için kullanılabilirlik eksikliğidir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için birkaç "insanlaştırılmış" fare suşu geliştirilmiştir. Bu fareler ağır bir şekilde bağışıklık sistemi baskılanır, ancak PDX büyümesi23'tensonra çeşitli insan kemik iliği türevi hücreler veya CD34+ hematopoetik kök hücreler ile yeniden inşa edilebilir Lenfosit aracılı sitotoksisitenin değerlendirilmesine ve immün kontrol noktası inhibitörü tedavisine tedavi yanıtı24,25.
Son yıllarda hasta kaynaklı organoidler (PDO), PDX ile rekabet eden önemli kanser modelleri olarak ortaya çıkmıştır. Sağlam tümör parçalarından türetilen ve hücre dışı matris iskelesinde kültürlenen bu üç boyutlu yapılar, orijinal tümörün histolojik ve genetik özelliklerini yakından yansıtmaktadır. Uzun vadeli genişleme ve kriyoprezervasyon olasılığı PDO'yu yaşayan bir biyobankanın ideal bir takviyesi haline getirir26,27. Nispeten yüksek bir kuruluş oranına ek olarak, çeşitli tümör varlıklarının PDO'ları için güvenilir ilaç yanıt tahmini bildirilmiştir28. Ayrıca, PDO'lar dolaşımdaki tümör hücrelerinden bile üretilmiştir ve ayrıca organoidlerin ilgili sağlıklı dokudan eşzamanlı olarak kurulması mümkündür, bu da tedaviye bağlı toksisitenin hasta-birey bazında değerlendirilmesine izin verir29,30. Bununla birlikte, geleneksel 2D hücre kültürlerine kıyasla, organoid kültürü zaman ve kaynak tüketendir ve yapay hücre dışı matris bileşikleri belirli analitik prosedürlere müdahale edebilir31. Ayrıca, kanser organoidleri sağlıklı epitelden elde edilen daha hızlı büyüyen, kötü huylu olmayan organoidler tarafından aşırı büyümeye karşı hassastır30. Stroma, kan damarları ve bağışıklık hücrelerinin eksikliği nedeniyle, PDO'lar çoğunlukla antianjiyojenik immünoterapik ajanların test edilmesi için uygulanamaz. Yine de, yeni kültleme yöntemleri tümör mikroçevrimi in vitromodellemesine izin verir, PDO'ları PDX modelleri için gerçek bir rakip haline getirir32. Yakın gelecekte, hasta-bireysel tümör modelleri, yeni nesil dizileme gibi güçlü genetik araçlarla birleştiğinde, umarım gerçek hassas tıbba ve özel tedavi yaklaşımlarına giden yolu açacaktır.

Son yıllarda, kanserlerin morfolojik, klinik ve genetik özellikleri hakkında birikmiş bilgi birikimi, kanserin heterojen, bireysel bir hastalık olarak algılanmasına yol açmıştır. Sonuç olarak, klinik ve patolojik özelliklerin yanı sıra neoplazmların mutasyonel karakterizasyonu klinik karar verme için önem kazanmıştır ve çeşitli moleküler değişiklikler için birçok hedefe yönelik tedavi geliştirilmiştir. Örneğin, cetuximab'ın kolorektal kanser tedavisindeki etkinliği KRAS ve PIK3CA mutasyon durumunun analizi ile tahmin edilebilir1. Hassas tıp, her hastada en yüksek tedavi yanıtını sağlamak ve verimsiz tedavilerin toksisitesini önlemek için özel bir yaklaşım amaçlamaktadır2. Biyobankalar, kanser hastalarının klinik verilerle bağlantılı doku, kan ve diğer biyolojik materyallerini içerir ve bu nedenle translojiyel kanser araştırmaları için mükemmel bir araçtır. Çok sayıda klinik örnek nedeniyle, biyobankalar nadir, ancak potansiyel olarak ilaçlanabilir mutasyonların tespit edilmesini sağlar, bu da bireysel hasta için yeni tedavi olanakları sağlar3.
Mümkün olduğunca geniş bir onkolojik araştırma spektrumunu kapsayacak şekilde, sadece numune hasadı konusundaki etkinliğimizi kısıtlamadık, ancak hasta kaynaklı kanser hücre hatları ve ksinograftların (PDX) kurulmasına odaklandık. Geleneksel 2D hücre hatları in vitro araştırmaların köşe taşı olmaya devam eder ve büyük ölçekli ilaç taramaları için birincil seçimdir4,5. Ayrıca, hücre hattı analizi genellikle daha kolay, daha ucuz ve daha kolay kullanılabilir. Ek olarak, hasta kaynaklı periferik kan lenfositleri (PBL) mevcut olduğundan, tümör immünolojisi in vitro6olarak da çalışılabilir. Bununla birlikte, hücre bazlı in vitro veya in vivo deneylerde umut verici preklinik etkiye sahip yeni geliştirilen ilaçların çoğunluğu, klinik çalışmalarda hayal kırıklığı yaratan sonuçlar göstermiştir7. Buna karşılık, PDX in vivo çalışmalarına dayanan preklinik çalışmalar antineoplastik ajanların klinik aktivitesini çok daha sadık bir şekilde yansıtmıştır8. PDX dokusu donör tümörün histolojik ve moleküler özelliklerini yakından yansıttığından, PDX modelleri bir biyobankanın bütünlüğünü korumak ve araştırma grupları ile kurumlar arasında numune değişimine izin vermek için genellikle çok sınırlı miktarda uygulanabilir tümör dokusunu yaymak için iyi bir yoldur. Ayrıca, PDX dokusundan elde edilen kanser hücre hatları primer kanser hücre hatlarından önemli ölçüde daha kolay kurulabilir9. Son yıllarda çalışma grubumuz, söz konusu tüm biyolojik numuneler için iş akışını adım adım standartlaştırarak ve optimize ederek kapsamlı bir entegre kolorektal ve pankreas kanseri biyobankası kurmuştur (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> Şekil 1: Biyobankanın iş akışı ve organizasyonu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacillol&#174; AF; 1L</td>
			<td>Bode, Hartmann</td>
			<td>REF 973380</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 15ml; sterile</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>GBO Cat. No.:188271</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP centrifuge tube, 50ml, sterile</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Order number: 62.547.254</td>
			<td>centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 20ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 300296</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Item number: 01.1601</td>
			<td>blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological Pipette 10ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 86.1254.001</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy ratiolab&#174; accupetta</td>
			<td>Ratiolab</td>
			<td>Item number: RL3200300</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>VWR Cat.No: 613-4438</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS; w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-36500</td>
			<td>washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll human</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-60500</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-41500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P40-47500</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P04-80100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>Cat. No.: P10-023100</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>VWR Cat.No: A3672.0250</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)</td>
			<td>selfmade</td>
			<td>---</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotube- CryoPure 2ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cell freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well cell culture plate; steril; with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>Cat.-No.: 657 160</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>Cat. No.: 82.1472.001</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile surgical blades</td>
			<td>B.Braun (Aesculap)</td>
			<td>REF BB510</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD DiscarditTM II Syringe 10ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309110</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer; yellow; 100&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF 352360</td>
			<td>tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>biocision</td>
			<td>Item number: 210004</td>
			<td>cooling container with -1&#176;C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar&#160;transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm</td>
			<td>KGW</td>
			<td>Cat. No.: HT39.1</td>
			<td>transport system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 200&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.760.002</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip 1000&#181;l</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>REF 70.762.411</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200&#181;l, yellow</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.082</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000&#181;l, blue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat. No.: 3121 000.120</td>
			<td>liquid transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator&#160; BB 6220 CU</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat.-No.: 51012839</td>
			<td>cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating plate PR&#196;ZITHERM</td>
			<td>Harry Gestigkeit GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Zeiss Primo Vert</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>Serial number. 3842000839</td>
			<td>imaging cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench Safe flow 1.8 nunc</td>
			<td>nunc GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>---</td>
			<td>sterile working bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer -80&#176;C</td>
			<td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td>
			<td>---</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance MP-300</td>
			<td>Chyo</td>
			<td>---</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine, U100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 324826</td>
			<td>injection anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%; 25ml</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>approval number: 6293841.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td>
			<td>CP-Pharma GmbH</td>
			<td>approval number: 401650.00.00</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GES3S Reader</td>
			<td>Datamars</td>
			<td>not available</td>
			<td>RFID reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td>
			<td>Peddymark</td>
			<td>---</td>
			<td>RFID chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotrim-ratiopharm&#174;&#160;Ampullen SF 480&#160;mg/5&#160;ml</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>PZN-03928197</td>
			<td>antibiotic drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate #FM-20 42x28cm</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Electric Petra, Burgau</td>
			<td>---</td>
			<td>heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>PZN-01578675</td>
			<td>Eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anatomical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD21 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical tweezer</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BD50 1 R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BC05 6R</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle&#160;holder</td>
			<td>B.Braun Aesculap</td>
			<td>BH1 1 OR</td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>XN8870.P32</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opsite moisture vapour permable spray dressing</td>
			<td>Smith&#38;Nephew</td>
			<td>REF 66004978, PZN- 02063507</td>
			<td>surgical suture material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aperture drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>REF 904622</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauze swap Gazin&#174;; steril; 10x10 cm</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 18506</td>
			<td>sterile OP tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raucotupf cotton tipped applicators</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher</td>
			<td>REF 11969</td>
			<td>applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat.-No.: 354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>Item number: 18839</td>
			<td>desinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS&#174; Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>Order No.:130-100-008</td>
			<td>storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formafix 4%</td>
			<td>Grimm med. Logistik GmbH</td>
			<td>Item number: F10010G</td>
			<td>fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software FreezerworksBasic</td>
			<td>Dataworks Development, Inc</td>
			<td>---</td>
			<td>sample organization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra TLP 2844 printer</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>---</td>
			<td>label printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation and maintenance of a living biobank - how we do it

Kanserlerin bireyler arası özellikleri ve heterojenliği hakkında artan bilgiler ışığında, kişiselleştirilmiş tıbbın ortaya çıkan alanı preklinik araştırmalar için bir platform gerektirir. Son yıllarda primer tümör dokusu, normal doku, sera, izole periferik kan lenfositleri (PBL), hasta kaynaklı ksinograftlar (PDX) ve primer ve sekonder kanser hücre hatlarından oluşan kolorektal ve pankreas kanserlerinden oluşan bir biyobanka kurduk. Orijinal tümör dokusu sınırlı olduğundan ve primer kanser hücre hatlarının kuruluş oranı hala nispeten düşük olduğundan, PDX sadece biyobankanın korunmasına ve genişletilmesine değil, aynı zamanda ikincil kanser hücre hatlarının üretimine de izin verir. Ayrıca, PDX modellerinin klinik öncesi ilaç testleri için ideal in vivo model olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, biyobankalama dikkatli bir hazırlık, katı yönergeler ve iyi ayarlanmış bir altyapı gerektirir. Kolektomi, duodenopankreatektomi veya rezeke edilmiş metastaz örnekleri rezeksiyondan hemen sonra toplanır ve patoloji bölümüne aktarılır. Tarafsız bir histopatolojik raporun önceliğine saygı göstererek, diseksiyonları gerçekleştiren uzman patologun takdirine bağlı olarak, küçük tümör parçaları ve tümör olmayan dokular toplanır. 
Nekrotik parçalar atılır ve kalan tümör dokusu küçük, özdeş küpler halinde kesilir ve daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezserv edilir. Ek olarak, tümörün küçük bir kısmı birincil kanser hücre kültürü için kıyılır ve zorlanır. Ayrıca hastadan ameliyat öncesi ve sonrası alınan kan örnekleri serum ve PBL'ler elde etmek için işlenir. PDX engraftment için, kriyoprezidasyon örnekleri buzları çözülür ve immün yetmezlikli farelerin kanatlarına deri altından yerleştirilir. Elde edilen PDX, "donör" tümörlerin histolojisini yakından özetler ve sonraki ksinografting için kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezerserved edilebilir. Aşağıdaki çalışmada, kolorektal ve pankreas kanserinden oluşan büyük bir biyobankanın oluşturulması, sürdürülmesi ve yönetiminin bireysel adımlarını açıklıyoruz. Ayrıca, biyobankalama ile ilgili önemli ayrıntıları ve uyarılarını vurguluyoruz.

Elimizde, birincil hücre kültürlerinin kuruluş oranı (Şekil 2A & B) büyük bir seride% 12.9 idi9. Genişletilebilir tümör hücrelerini taze cerrahi resected örneklerden izole etme girişimlerinin çoğu, büyüme veya erken kontaminasyon eksikliği nedeniyle başarısız oldu. Hücre hattı kuruluşu, standart kültür koşullarında (DMEM, % 10 FCS, standart kültür gemisi) istikrarlı bir büyüme ve FACS analizi ile epitel farklılaşması doğrulaması ile 3 pasajdan sonra başarılı olarak kabul edildi10. PDX tümörlerinden elde edilen hücre hatları (Şekil 2C & D) primer resected tümörlerin aksine tekrarlayan girişimler olasılığından da kaynaklanan% 23.6'lık daha yüksek bir kuruluş oranı göstermiştir9. Bununla birlikte, bazı karma kültürler (Şekil 2E) fibroblastic büyümeden kurtulamaz ve hatta fibroblastic overrowth nedeniyle kaybolur (Şekil 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> Şekil 2: Hücre kültürü. Kolon kanseri olgusunun metastazından türetilen primer kanser hücre hatları HROC313, pasaj 21 (A) ve pankreas kanseri olgu hrop88, pasaj 5 (B). Kolon PDX HROC285 T0 M2 (D) ve pankreas PDX HROP10 T5 M2'nin PDX türevi kanser hücresi hatları, geçiş 4 (E). Pankreas kanseri HROP75, pasaj 8 (C) ve fibroblastic overrowth (F) gelen fibroblastlar ve kanser hücrelerinin karma kültürü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
PDX oluşturma protokolündeki değişiklikler, kullanılan fare suşları ve birkaç yıl boyunca deneyler ve ayrıca engraftasyon için mevcut tümör dokusu miktarındaki büyük farklılıklar göz önüne alındığında, PDX neslinin genel başarı oranını vermek önemsiz değildir. İki araştırmacı (S.M. ve F.B. ) tarafından gerçekleştirilen çok yeni bir PDX nesil deney serisinde, kolorektal PDX için birincil büyüme oranları (Örnek bir histoloji Şekil 3A'dangösterilebilir) ve pankreas PDX(Şekil 3B)için% 48 gözlenmiştir. İmplantasyon alanında murine veya insan lenfomalarının büyümesi nispeten nadirdir, ancak başarılı PDX büyümesini taklit edebilir (Şekil 3C). Histopatolojik muayene dışında PDX modelleri ile donör hastaları arasındaki uyum kısa tandem tekrar (STR) analizi ile düzenli olarak doğrulanmıştır(Şekil 3D). Günümüzde biyobanka >50 birincil ve 50 > ikincil kolorektal, 3 birincil ve 6 ikincil pankreas kanseri hücre hattının yanı sıra >150 kolorektal ve 19 pankreas PDX modeli içer vermektedir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> Şekil 3: Kolorektal (A) ve pankreas PDX 'in (B) temsili histolojik karşılaştırması. İmplantasyon alanında PDX büyümesini taklit eden insan lenfoma (C). Pdx modelinin (HROC430 T1 M2) kısa tandem tekrar (STR) analizi ile orijinal hasta tümör dokusuna (HROC430Tu) genetik kimlik testi. Dokuz STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM boyası) ve D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX boyası) çok katlı PCR kullanılarak, kılcal elektroforezi takiben floresan etiketli astarlarla karşılaştırılması PDX ve donör tümörün (D) genetik uyumunu doğruladı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It at JoVE.com

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

Aşağıdaki çalışmada, kolorektal ve pankreas kanserinden oluşan büyük bir biyobankanın kurulması için gerekli ardışık adımları açıklıyoruz.

Yaşayan Bir Biyobankanın Oluşturulması ve Bakımı - Nasıl Yaparız

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Yaşayan bir biyobankanın yaratılması ve sürdürülmesi. Giriş. Geleneksel biyobankalar genellikle canlı olmayan doku ve kan örnekleri içerir. Kanser hasta popülasyonlarının çeşitliliğini yeterince yansıtmasına ve genetik ve histolojik analizlere izin vermesine rağmen, terapötik stratejileri değerlendiren preklinik tahliller için uygun değildir.Hasta kaynaklı modelleri de entegre eden bir biyobanka bu sınırlamaların üstesinden gelmektedir. Böylece hassas tıp için fonksiyonel testlere olanak tanır. Örnek alımı.Kolorektal ve pankreas kanserinin biyobankası için, tanısı kanıtlanmış ve yeterli tümör büyüklüğüne sahip olguların seçilmesi, hastanın bilinçli konsensüse alınması zorunludur. Ameliyat başlamadan önce, heparinize bir şırıngar kullanarak 20ml kan ve serum monovet ile ek 7.5ml çekin. Serum işleme ve PBL izolasyonu.1, 128 RCF'de 15 dakika dört derecede santrifüjlendikten sonra serum önceden etiketlenmiş bir kriyotüpte aliquoted edilir ve doğrudan sıvı nitrojene batırılır. Heparinize kan bir polipropilen tüpe aktarılır ve 15ml PBS ile seyreltilir. Karışımı yavaşça 15ml Pancoll ile kaplamak için serolojik bir pipet kullanın.Yoğunluk gradyan santrifüjlemeden sonra, mononükleer hücreleri içeren opak tabaka serolojik bir pipetle alınır ve yeni bir PP tüpüne aktarılır. PBS ile yıkadıktan ve mononükleer hücreleri santrifüjleme ile peletledikten sonra, süpernatantı atın ve peleti dondurucu ortamına yeniden atın ve önceden etiketlenmiş kriyotüplere dağıtın. Tüpleri dakikada bir derece ile yavaş dondurmaya uygun bir soğutma kabına aktarın ve geçici olarak 80 derecede saklayın.Doku işleme. Doku örneği cerrah tarafından resected edilir etmez, uygun bir kaba koyun. Her koşulda dokunun formalinle kaplı olduğundan kaçının.Rezeksiyon marjlarının patolojik değerlendirmesi ile ilgili olmayan tümör materyalinin eksizyonu için patolojiye mümkün olduğunca hızlı taşınma. Tümör parçası mümkün olduğunca aseptik olarak ele alınmalıdır. Ayrıca, sağlıklı bir doku örneği elde edin ve her ikisini de buz üzerinde doku depolama çözeltisi ile önceden doldurulmuş ayrı tüplere yerleştirin.Steril koşullar altında doku işlemeye başlamak için hemen laboratuvara dönün. Doku parçası, oluşmayı önlemek için doku depolama çözeltisi ile dolu steril bir plastik kabın üzerine yerleştirilir. Her şeyden önce, elde edilen doku örneğinin boyutuna bağlı olarak çıtçıt dondurma için bir veya daha fazla iğne ucu büyüklüğünde parçayı dışarı atın.Yerel dokuyu önceden etiketlenmiş kriyotüplere yerleştirin ve hemen sıvı nitrojene batırın. Kalan dokuyu üçe üç, üç milimetreküp küp küpler halinde kesin. Nekrotik dokunun tamamen parçalanıp atılmaması gerektiğini göz önünde bulundurarak.Hayati depolama için aliquot sayısını belirlemek için küpleri dört katına yerleştirin. Yeterli sayıda kriyotüs etiketleyin ve her biri 1,5 ml dondurucu ortamıyla önceden doldurun. Dondurucu ortamındaki DMSO sitotoksik olduğundan, sonraki adımları hızlı ve kesintisiz bir şekilde gerçekleştirdi.Tüp başına dört doku parçası toplamak için neşter bıçakları kullanın. Tüm parçaların tamamen tüpün dibinde ideal olarak dondurucu ortamına batırıldığından emin olun ve dondurucu bir kap kullanarak tüpleri hızla dondurun. Sağlıklı örnekle aynı şekilde devam edin.Uzun süreli depolama için, tüm aliquotes sıvı azot tankında saklayın. Hücre kültürü. Nekrotik kısımlar da dahil olmak üzere tümör dokusu işleme kalıntılarını neşter bıçakları ile mümkün olduğunca küçük öğütün.Steril bir PP tüpünün üstüne bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücre süzgecinden geçmek için süspansiyonu serolojik bir pipetle aspire edin. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için doku kalıntılarını hücre süzgecinden geçirmek için tek kullanımlık şırınnanın pistonunu kullanın. PBS ile durulayın ve malzeme kalana kadar bu adımları tekrarlayın.Hücre süzgecini çıkarın ve süspansiyonu 180 RCF'de yedi dakika santrifüjleyin. Bu arada, tümörün büyüme olasılığını artırmak için farklı ortam kompozisyonlarına sahip kollajen ön kaplamalı altı kuyu plakası hazırlayın. Süpernatantı atın ve peleti PBS'de yeniden atın ve kuyu başına 500 mikrolitre dağıtın.Daha sonra, plakayı standart bir inkübatöre yerleştirin. Hasta kaynaklı ksinograft üretimi. İmmün sistemi baskılanmış farelerde hasta kaynaklı ksinograftların üretimi için hayvanlar belirli bir patojen içermeyen ortamda tutulmalıdır.Önlük, önlük, yüz maskesi, saç örtüsü ve eldivenlerden oluşan kişisel koruyucu ekipman giyin. Çalışma alanınızı düzenledikten sonra, sıvı nitrojen kabından istenen tümör örneğini alın. Taze bir PP tüpünü 35ml PBS ile doldurun, ardından çözülme işlemini dikkatlice yıkayın ve kriyo tüpünü yukarı ve aşağı eğin.İçerik sulu hale gelir gelmez PBS'ye dökülür ve tümör parçalarını durulayın. PBS'nin çoğunu atın ve küpleri kapağın içine boşaltın. Bir buz torbasına steril bir plastik tabak yerleştirin ve 100 mikroliter Matrigel damlacık ekleyin.Tümör parçalarını Matrigel'e yerleştirmek ve tümörü 10 dakika kuluçkaya yatırmak için forseps kullanın. Bu arada, iki fareyi uyuşturun. Hayvanın ayağını çimdikleyerek anestezinin derinliğini kontrol edin.Herhangi bir hareket anestezinin yetersiz olduğunu gösterir ve biraz bekleme veya ek dosing gerektirir. Göz merhemi uygulayın, fareyi boynundan kıstırın ve deri altından bir mikroçip enjekte edin. Aşağıdaki adımları paralel olarak uygulayın.Farelerin kanatlarını dezenfekte edin ve şeritli Metzenbaum makası ile küçük bir cilt kesisi yapın ve künt bir hazırlıkla deri altı bir cep oluşturur. Tümör parçalarını yerleştirmek için anatomik tokmaklar kullanın. Parçanın cilt cebinin arka ucuna yerleştirildiğından emin olun.Kalan Matrigel'i arzula ve dört cebe de eşit olarak dağıt. Jelin iyileşmesini bekliyor ve iğne ile tümör parçalarına zarar vermeden tek düğmeli dikişlerle cildi kapatın. İpliği düğümün üzerinde mümkün olduğunca kısa kesin ve dikişlerin noying önlemek için sprey pansuman uygulayın.Mikroçipi tarayın ve hayvanın daha sonra tanımlanması için tümör bilgilerini veritabanına ekleyin. Taze yatak takımı ve yuva malzemesi ile bir kafes hazırlayın, fareleri kızılötesi bir lambanın önüne yerleştirin ve anestezi geçene kadar hayvanı izleyin. PDX'in çıkarılması.PDX tümörü gerekli boyuta ulaştıktan sonra, fare CO2 boğulması ve daha sonra servikal çıkık ile ötenaziye tabi tökezler. Cildi tümörden dikkatlice parçalara çıkarın ve PDX'i tamamen çıkarın. Temsili sonuçlar.Steril bir plastik kabın üzerine bir tümör yerleştirin ve daha fazla işlem için steril neşter bıçakları kullanın. Dilimlerle delik açın, bir histoloji kasetine yerleştirin ve daha sonra histolojik değerlendirme için parafin gömülü numune oluşturmak için formalin içine batırın. Tümörün geri kalanını doku depolama çözeltisine aktarın ve biyobanka için hayati derecede korunmuş yeni donmuş numuneler oluşturun.Ayrıca, ikincil tümör hücre hatlarını belirlemek için pdx tümörünün kalıntılarını bölüm hücre kültürüne benzer şekilde kullanın. Daha fazla PDX oluşturmak için Matrigel ile iki veya daha fazla tümör parçasını daha önce gösterildiği gibi yeni bir alıcı fareye aktarın. Sonuç. Sunulan protokol sayesinde, şimdiye kadar dokuz pankreas ve 100'den fazla kolorektal hasta kaynaklı kanser hücre hattının yanı sıra 19 pankreas ve 150'den fazla kolorektal PDX modeli kurmayı başardık.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Bir Klinik öncesi Hasta Türetilmiş Tümör Roman Anti-Kanser Tedaviler Soruşturma Xenograftlarında Modeli Geliştirilmesi ve Bakımı

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

22C 3 kullanarak Anti-PD-L1 antikor konsantre biyopsi ve küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda sitoloji örnekleri

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastrointestinal Stromal Tümörün Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Moleküler ve İmmünolojik Teknikler

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...