Name: visualization of sars-cov-2 using immuno rna-fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung für die Forschung zu SARS-CoV-2 und durch Stipendien des National Science Center (Stipendien UMO2017/27/B/NZ6/02488 an K.P. und UMO-2018/30/E/NZ1/00874 an A.K.-P.) unterstützt.

1. Puffervorbereitung
<ol><li>Für 500 ml 2x PHEM-Puffer 18,14 g Piperazin-N,N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES), 3,8 g Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) und 0,99 g Magnesiumsulfat (MgSO4) kombinieren Machen Sie das Volumen bis zu 400 ml mit destilliertem Wasser (dH2O), rühren sie und stellen Sie den pH-Wert mit 10 M Kaliumhydroxid (KOH) oder Natriumhydroxid (NaOH) auf 7,0 ein. Machen Sie das Endvolumen bis zu 500 ml, und ...

<ol>
	<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+multiplexed,+quantitative,+sensitive,+versatile,+robust.">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+in+human+respiratory+epithelium.">Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium.</a> Journal of Virology. 94, (2020).</li><li>Banach, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+epithelial+cell+culture+to+identify+new+respiratory+viruses:+coronavirus+NL63+as+a+model.">Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).</li><li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+human+coronavirus+NL63+into+the+cell.">Entry of human coronavirus NL63 into the cell.</a> Journal of Virology. 92, (2018).</li><li>El Baba, R., Herbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+epigenomic+networks+entailed+in+coronavirus+infections+and+COVID-19.">Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19.</a> Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).</li><li>Pinto, B. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2+expression+is+increased+in+the+lungs+of+patients+with+comorbidities+associated+with+severe+COVID-19.">ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19.</a> Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).</li><li>Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+link+between+ACE2+deficiency+and+SARS-CoV-2+infection.">The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection.</a> European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).</li><li>Gordon, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SARS-CoV-2+protein+interaction+map+reveals+targets+for+drug+repurposing.">A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing.</a> Nature. 583, 459-468 (2020).</li><li>Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viral+RNA+capping+machinery+as+a+target+for+antiviral+drugs.">The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs.</a> Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mehta, S., Jeffrey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+receptors+and+signaling:+epigenetic+factors+in+the+regulation+of+innate+immunity.">Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity.</a> Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).</li><li>Poppe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NF-kappaB-dependent+and+-independent+transcriptome+and+chromatin+landscapes+of+human+coronavirus+229E-infected+cells.">The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells.</a> PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).</li><li>Schafer, A., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+landscape+during+coronavirus+infection.">Epigenetic landscape during coronavirus infection.</a> Pathogens. 6 (1), 8 (2017).</li><li>Carletti, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+priming+of+cell+intrinsic+innate+antiviral+signaling+by+the+unfolded+protein+response.">Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response.</a> Nature Communications. 10, 3889 (2019).</li><li>Heil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+recognition+of+single-stranded+RNA+via+toll-like+receptor+7+and+8.">Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8.</a> Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).</li><li>Sze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+restriction+factor+SAMHD1+limits+human+T+cell+leukemia+virus+type+1+infection+of+monocytes+via+STING-mediated+apoptosis.">Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis.</a> Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).</li><li>Kikkert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+by+human+respiratory+RNA+viruses.">Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses.</a> Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+editing+of+HIV-1+mRNAs+enhances+viral+gene+expression.">Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).</li><li>Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+coronavirus+entry+into+cells.">Visualizing coronavirus entry into cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).</li></ol>

Immuno-RNA-FISH ist eine zuverlässige Methode zur Doppelfärbung von RNA und zellulären Proteinen. Hier wurde ein modifiziertes Immun-RNA-FISH-Protokoll beschrieben, das den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA und zellulären Proteinen in Zelllinien und HAE-Kulturen ermöglicht. Dieses Protokoll kann für den Einsatz in verschiedenen Zellmodellen angepasst werden, einschließlich Zellmonolayern oder spezifischen Geweben. Die Methode basiert auf dem Konzept eines HCR, das durch entsprechende Sondenlokalisierung initiiert wird. ...

SARS-CoV-2 ist ein neuartiges humanes Betacoronavirus, das Ende 2019 auftauchte und wenige Monate später eine beispiellose Pandemie verursachte. Da das Virus neu in der Wissenschaft ist, bleibt ein Großteil seiner Biologie und seiner Auswirkungen auf Wirtszellen unbekannt. Daher ist die Kartierung der Virus-Zell- und -Gewebetropismus während der Infektion wichtig, wenn ihre grundlegenden biologischen Eigenschaften und ihre Auswirkungen auf den Wirt zu verstehen sind. Mehrere Techniken werden verwendet, um das Zusammenspiel von Virus-Host zu untersuchen, einschließlich biochemischer, biologischer und physikalischer Assays. In-situ-Hybridisierung ist eine gängige Methode, die markierte komplementäre DNA,RNA oder modifizierte Nukleinsäuresonden verwendet, die sich auf bestimmte DNA- oder RNA-Sequenzen in einer Zelle oder einem Gewebe lokalisieren.
Es wurde eine neue RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungsmethode (RNA-FISH) entwickelt, die Modifikationen zur Erhöhung der Empfindlichkeit durch Verstärkung des Signal-Rausch-Verhältnisses über ein HCR1enthält. HCR ermöglicht die Untersuchung der RNA-Lokalisierung auf einzelliger Ebene. Aufgrund ihrer hohen Spezifität, Empfindlichkeit und Auflösung ist diese Methode nicht nur für wissenschaftliche Grundlagenstudien nützlich, sondern auch für Applikationsprojekte, z. B. Diagnostik. Kürzlich wurde die Machbarkeit dieser Methode für den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA demonstriert, die lokalisiert ist, um Ciliated-Zellen in vollständig differenzierten 3D-Human-Atemwegsepithel-Kulturen (HAE)-Kulturen2. HAE-Kulturen stellen eines der fortschrittlichsten Werkzeuge zur Untersuchung von Virusinfektionen im Kontext der Mikroumgebung "natürliche Infektion"3,4dar.
Mehrere Berichte über humane Coronaviren (HCoV), einschließlich SARS-CoV-2, unterstreichen die Bedeutung epigenetischer Modifikationen in Bezug auf HCoV-Infektion und Pathophysiologie [überprüft in 5], z. B. das Methylierungsmuster des Gens, das das Angiotensin-convertierende Enzym 2 (ACE-2)-Rezeptor6,7kodiert. Interessanterweise identifizierte das massenspektrometrische Screening mehrere epigenetische Faktoren, die mit dem SARS-CoV-2-Proteom8interagieren. Genauer gesagt bindet das nichtstrukturelle Protein 5 (NSP5) an den epigenetischen Regulator, Histondeacetylase 2, und das katalytisch inaktive NSP5 (C145A) interagiert mit tRNA-Methyltransferase 1 (24). Zusätzlich wird die NSP16-Methyltransferase-Aktivität durch den Methyltransferase-Inhibitor Sinefungin9blockiert. Die genaue Rolle dieser epigenetischen Faktoren bei COVID-19 bleibt jedoch unklar. Die Replikation von HCoV erfolgt im Zytoplasma der infizierten Zelle und löst Entzündungsreaktionen aus, die durch epigenetische Modifikationen reguliert werden10.
Zum Beispiel verfeinert HCoV-229E die Atomfaktor-Kappa B-Signalisierung und programmiert die hostzelluläre Chromatinlandschaft tiefgreifend um, indem die Acetylierung von H3K36 und H4K5 in bestimmten Regionen erhöht wird11. Die mit dem Middle East respiratorische Syndrom zusammenhängende Coronavirus-Infektion erhöht den Gehalt an H3K27me3 und erschöpft H3K4me3 in den Promotorregionen von Teilmengen spezifischer interferonempfindlicher Gene12. Zusätzlich löst virale RNA Immunreaktionen aus, wie bei den Flaviviren13, Retroviren14,15und Coronaviren16nachgewiesen. Die epigenetischen Marker auf viraler RNA können eine Rolle bei der Erkennung durch zelluläre Sensoren spielen, wie für die m7A-Methylierung des humanen Immundefizienzvirus-1-RNA17gezeigt. Es bleiben jedoch Fragen: Welche Auswirkungen hat SARS-CoV-2 RNA auf die Immunantwort, und sind epigenetische Markierungen beteiligt?
Hier wurde eine optimierte RNA-FISH-Methode in Verbindung mit der Immunfluoreszenzanalyse von Zelllinien und 3D-Geweben (voll differenzierte se) beschrieben. Obwohl zytologische Methoden wie FISH und Immunfluoreszenz weit verbreitet sind, wurde diese auf HCR basierende In-situ-Hybridisierungsmethode der neuen Generation nie für den Virennachweis verwendet (außer in einer kürzlich veröffentlichten Publikation)2. Im Allgemeinen erfordern Immunfärbung und FISH die folgenden Schritte: Permeabilisierung, um das Eindringen von Sonden oder Antikörpern zu ermöglichen; Fixierung, bei der zelluläres Material fixiert und konserviert wird; Nachweis, bei dem Antikörper oder Nukleinsäuresonden aufgetragen werden; und schließlich Montage der Proben zur Visualisierung.
Obwohl bestehende Protokolle diese allgemeinen Funktionen gemeinsam nutzen, unterscheiden sie sich in Bezug auf die beteiligten Parameter deutlich. Hier wurde ein optimiertes, einfaches Immun-RNA-FISH-Protokoll zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in HAE-Kulturen und Vero-Zellen beschrieben. Die Technik umfasst die folgenden Schritte: (1) Fixierung von Zellen mit Paraformaldehyd; (2) Permeabilisation mit Waschmittel oder Methanol (MeOH); (3) Rehydratation durch eine abgestufte Reihe von MeOH-Lösungen (nur HAE-Kulturen); (4) Erkennung; (5) Amplifikation mit HCR-Technologie zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA; (6) Immunfärbung; und (7) Bildgebung unter einem konfokalen Mikroskop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td >ZEISS </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grant Bio, Mini Rocker- Shaker</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td>12965501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator Galaxy170R</td>
			<td >New Brunswick</td>
			<td>CO170R-230-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer Comfort</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td>5355 000 011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips</td>
			<td >LabSolute</td>
			<td >7695022</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL tubes</td>
			<td >FL-MEDICAL</td>
			<td >5.350.023.053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12-well plate</td>
			<td >TTP</td>
			<td >92412</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical centrifuge tube</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >5.332.547.254</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >serological pipets</td>
			<td >VWR Collection</td>
			<td >612-5523P, 612-5827P</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >slide glass</td>
			<td >PTH CHEMLAND</td>
			<td >04-296.202.03</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transwell ThinCerts</td>
			<td >Grainer bio-one</td>
			<td >665641</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#946;5-tubulin </td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td > sc-134234</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disodium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S51136-500G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >EGT101.25</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Amplification Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BAM01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S013922</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S012522</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Hybridization Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPH03821</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >PRE134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Wash Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPW01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >HEP001.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >63138-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >32213-1L-M</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopotassium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5655-100G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6148-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PIPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >PIP666.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5405-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Prolong Diamond Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >P36970</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >SOD001.5</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trisodium Citrate 2-hydrate</td>
			<td >POCH</td>
			<td > 6132-04-3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween-20</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >TWN580.500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence Spectraviewer</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td>Modeling spectral parameters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ Fiji</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Acquiring and processing z-stack images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of sars-cov-2 using immuno rna-fluorescence in situ hybridization

Dieses Manuskript enthält ein Protokoll für die In-situ-Hybridisierungs-Kettenreaktion (HCR) in Verbindung mit Immunfluoreszenz zur Visualisierung des schweren akuten Atemwegssyndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in Zelllinie und dreidimensionalen (3D) Kulturen des menschlichen Atemwegsepithels. Die Methode ermöglicht eine hochspezifische und sensible Visualisierung viraler RNA, indem sie sich auf HCR stützt, die durch Diesonlokalisierung initiiert werden. Split-Initiator-Sonden helfen, das Signal durch fluoreszierend markierte Verstärker zu verstärken, was zu einer vernachlässigbaren Hintergrundfluoreszenz in der konfokalen Mikroskopie führt. Etikettierverstärker mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen erleichtern die gleichzeitige Erkennung verschiedener Targets. Dies wiederum ermöglicht die Kartierung der Infektion in Geweben, um die virale Pathogenese und Replikation auf einzelzellarer Ebene besser zu verstehen. Die Kopplung dieser Methode mit der Immunfluoreszenz kann ein besseres Verständnis der Wirts-Virus-Wechselwirkungen erleichtern, einschließlich einer Abwechslung des Wirtsepigenoms und der Immunantwortwege. Dank der sensiblen und spezifischen HCR-Technologie kann dieses Protokoll auch als Diagnosetool verwendet werden. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Technik leicht modifiziert werden kann, um den Nachweis von RNA zu ermöglichen, einschließlich nicht-kodierender RNAs und RNA-Viren, die in der Zukunft entstehen könnten.

Das in diesem Manuskript beschriebene Immun-RNA-FISH-Protokoll wurde mit zwei zellulären Systemen durchgeführt: einer Vero-Zelllinie und einer 3D-HAE-Kultur. Die wichtigsten Schritte für beide Zellmodelle sind in Tabelle 2dargestellt. Das RNA-FISH-Protokoll zur Visualisierung von SARS-CoV-2 in HAE-Kulturen umfasst Schritte, die typisch für Gewebeproben sind, d.h. Permeabilisation mit 100% MeOH und Rehydrierung durch eine abgestufte Reihe von MeOH-PBS- und 0,1% Tween-L...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effiziente SARS-CoV-2 quantitative Reverse Transkriptase PCR Speicheldiagnostikstrategie unter Verwendung von Open-Source-Pipettierrobotern

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...