Name: visualization of sars-cov-2 using immuno rna-fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-12-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Bu çalışma SARS-CoV-2 ile ilgili araştırmalar için Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı tarafından ve Ulusal Bilim Merkezi'nden hibelerle desteklendi (UMO2017/27/B/NZ6/02488'i K.P.'ye ve UMO-2018/30/E/NZ1/00874'ü A.K.-P.'ye verir).

1. Tampon hazırlığı
<ol><li>500 mL 2x PHEM tampon için, 18,14 g piperazin-N,N′-bis(2-etanesülfonic asit) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazine etanesülfonic asit (HEPES), 3.8 g etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve 0.99 g magnezyum sülfat (MgSO4). Damıtılmış su (dH2O) ile hacmi ~400 mL'ye kadar yapın, karıştırın ve 10 M potasyum hidroksit (KOH) veya sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak pH'ı 7,0'ye ayarlayın. Son sesi 500 mL'ye kadar yapın ve ardından 50 mL...

<ol>
	<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+multiplexed,+quantitative,+sensitive,+versatile,+robust.">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+in+human+respiratory+epithelium.">Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium.</a> Journal of Virology. 94, (2020).</li><li>Banach, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+epithelial+cell+culture+to+identify+new+respiratory+viruses:+coronavirus+NL63+as+a+model.">Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).</li><li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+human+coronavirus+NL63+into+the+cell.">Entry of human coronavirus NL63 into the cell.</a> Journal of Virology. 92, (2018).</li><li>El Baba, R., Herbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+epigenomic+networks+entailed+in+coronavirus+infections+and+COVID-19.">Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19.</a> Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).</li><li>Pinto, B. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2+expression+is+increased+in+the+lungs+of+patients+with+comorbidities+associated+with+severe+COVID-19.">ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19.</a> Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).</li><li>Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+link+between+ACE2+deficiency+and+SARS-CoV-2+infection.">The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection.</a> European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).</li><li>Gordon, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SARS-CoV-2+protein+interaction+map+reveals+targets+for+drug+repurposing.">A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing.</a> Nature. 583, 459-468 (2020).</li><li>Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viral+RNA+capping+machinery+as+a+target+for+antiviral+drugs.">The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs.</a> Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mehta, S., Jeffrey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+receptors+and+signaling:+epigenetic+factors+in+the+regulation+of+innate+immunity.">Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity.</a> Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).</li><li>Poppe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NF-kappaB-dependent+and+-independent+transcriptome+and+chromatin+landscapes+of+human+coronavirus+229E-infected+cells.">The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells.</a> PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).</li><li>Schafer, A., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+landscape+during+coronavirus+infection.">Epigenetic landscape during coronavirus infection.</a> Pathogens. 6 (1), 8 (2017).</li><li>Carletti, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+priming+of+cell+intrinsic+innate+antiviral+signaling+by+the+unfolded+protein+response.">Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response.</a> Nature Communications. 10, 3889 (2019).</li><li>Heil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+recognition+of+single-stranded+RNA+via+toll-like+receptor+7+and+8.">Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8.</a> Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).</li><li>Sze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+restriction+factor+SAMHD1+limits+human+T+cell+leukemia+virus+type+1+infection+of+monocytes+via+STING-mediated+apoptosis.">Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis.</a> Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).</li><li>Kikkert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+by+human+respiratory+RNA+viruses.">Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses.</a> Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+editing+of+HIV-1+mRNAs+enhances+viral+gene+expression.">Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).</li><li>Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+coronavirus+entry+into+cells.">Visualizing coronavirus entry into cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).</li></ol>

Immuno-RNA-FISH, RNA ve hücresel proteinlerin çift boyanma için güvenilir bir yöntemdir. Burada, hücre hatlarında ve HAE kültürlerinde SARS-CoV-2 RNA ve hücresel proteinlerin tespit edilmesine izin veren değiştirilmiş bir immün-RNA-FISH protokolü tanımlanmıştır. Bu protokol, hücre monolayerleri veya belirli dokular dahil olmak üzere farklı hücre modellerinde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Yöntem, uygun prob yerelleştirmesi tarafından başlatılan bir HCR kavramına dayanır. Daha sonra, siny...

SARS-CoV-2, 2019'un sonunda ortaya çıkan ve birkaç ay sonra benzeri görülmemiş bir pandemiye neden olan yeni bir insan betakoronavirüsüdür. Virüs bilimde yeni olduğu için biyolojisinin çoğu ve konak hücreler üzerindeki etkisi bilinmemektedir. Bu nedenle, temel biyolojik özellikleri ve konak üzerindeki etkileri anlaşılacaksa, enfeksiyon sırasında virüs-hücre ve -doku tromizminin haritalandırılması önemlidir. Biyokimyasal, biyolojik ve fiziksel tahliller de dahil olmak üzere virüs konak etkileşimlerini incelemek için çeşitli teknikler kullanılır. In situ hibridizasyon, bir hücre veya dokudaki belirli DNA veya RNA dizilerine lokalize olan etiketli tamamlayıcı DNA, RNA veya değiştirilmiş nükleik asit probları kullanan yaygın bir yöntemdir.
Bir HCR1ile sinyal-gürültü oranını yükselterek hassasiyeti artırmak için değişiklikler içeren yeni bir RNA floresan in situ hibridizasyon (RNA-FISH) yöntemi geliştirilmiştir. HCR, RNA lokalizasyonunun tek hücre düzeyinde incelenmesine izin verir. Yüksek özgüllüğü, duyarlılığı ve çözünürlüğü nedeniyle, bu yöntem sadece temel bilim çalışmaları için değil, aynı zamanda uygulama projeleri için de yararlıdır, örneğin teşhis. Son zamanlarda, bu yöntemin fizibilitesi, tamamen farklılaştırılmış 3D insan hava yolu epitel (HAE) kültürleri içinde siliated hücrelere lokalize SARS-CoV-2 RNA'sını tespit etmek için gösterilmiştir2. HAE kültürleri, "doğal enfeksiyon" mikroçevrimiz3,4bağlamında viral enfeksiyonu incelemek için kullanılan en gelişmiş araçlardan birini oluşturur.
SARS-CoV-2 de dahil olmak üzere insan koronavirüsleri (HCoV) hakkında çeşitli raporlar, HCoV enfeksiyonu ve patofizyolojisi açısından epigenetik değişikliklerin önemini vurgulamaktadır [5'tegözden geçirilmiştir ], örneğin, anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE-2) reseptörü6,7'yikodlayan genin metilasyon deseni. İlginçtir ki, kütle spektrometrik taraması SARS-CoV-2 proteom8ile etkileşime giren birkaç epigenetik faktör tanımladı. Daha spesifik olarak, yapısal olmayan protein 5 (NSP5) epigenetik regülatöre bağlanır, histone deacetylaz 2 ve katalitik olarak inaktif NSP5 (C145A) tRNA metiltransfeaz 1 (24) ile etkileşime girer. Ek olarak, NSP16 metiltransferaz aktivitesi metiltransferaz inhibitörü, sinefungin9tarafından engellenir. Ancak bu epigenetik faktörlerin COVID-19'daki kesin rolü belirsizliğini korumaktadır. HCoV replikasyonu enfekte hücrenin sitoplazmında gerçekleşir ve epigenetik değişikliklerle düzenlenen enflamatuar yanıtları tetikler10.
Örneğin, HCoV-229E nükleer faktör-kappa B sinyalini ince ayarlar ve belirli bölgelerde H3K36 ve H4K5'in asetilasyonını artırarak konak hücresel kromatin manzarasını derinden yeniden programlar11. Orta Doğu solunum sendromuna bağlı koronavirüs enfeksiyonu H3K27me3 seviyelerini arttırır ve spesifik interferon duyarlı genlerin alt kümelerinin promotör bölgelerinde H3K4me3'ün tükenmesi12. Ek olarak, viral RNA, flavivirüsler13, retrovirüsler 14,15ve koronavirüsler16için gösterildiği gibi hücre immün yanıtlarını tetikler. Viral RNA'daki epigenetik belirteçler, insan immün yetmezlik virüsünün m7A metilasyonunda gösterildiği gibi hücresel sensörler tarafından tanınmada rol oynayabilir-1 RNA17. Bununla birlikte, sorular devam etmektedir: SARS-CoV-2 RNA'nın bağışıklık yanıtı üzerindeki etkisi nedir ve epigenetik izler söz konusu mudur?
Burada, hücre hatlarının ve 3D dokuların (tamamen farklılaştırılmış HAE) immünofluoresans analizi ile birlikte optimize edilmiş bir RNA-FISH yöntemi tanımlanmıştır. FISH ve immunofluorescence gibi sitolojik yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, HCR tabanlı bu yeni nesil in situ hibridizasyon yöntemi hiçbir zaman virüs tespiti için kullanılmamıştır (yeni bir yayın hariç)2. Genel olarak, immünostaining ve FISH aşağıdaki adımları gerektirir: probların veya antikorların penetrasyonunu sağlamak için permeabilizasyon; hücresel malzemenin sabit ve korunduğu sabitleme; antikorların veya nükleik asit problarının uygulandığı tespit; ve son olarak, görselleştirme için örneklerin montajı.
Mevcut protokoller bu genel özellikleri paylaşsa da, ilgili parametrelere göre belirgin bir şekilde değişir. Burada, HAE kültürlerinde ve Vero hücrelerinde SARS-CoV-2 RNA'sını tespit etmek için optimize edilmiş, basit, immün-RNA-FISH protokolü tanımlanmıştır. Teknik aşağıdaki adımları içerir: (1) paraformaldehitli hücrelerin sabitlenmesi; (2) deterjan veya metanol (MeOH) ile permeabilizasyon; (3) dereceli bir dizi MeOH çözümü ile rehidrasyon (yalnızca HAE kültürleri); (4) algılama; (5) SARS-CoV-2 RNA'yı tespit etmek için HCR teknolojisini kullanarak amplifikasyon; (6) immünostaining; ve (7) konfokal mikroskop altında görüntüleme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td >ZEISS </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grant Bio, Mini Rocker- Shaker</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td>12965501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator Galaxy170R</td>
			<td >New Brunswick</td>
			<td>CO170R-230-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer Comfort</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td>5355 000 011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips</td>
			<td >LabSolute</td>
			<td >7695022</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL tubes</td>
			<td >FL-MEDICAL</td>
			<td >5.350.023.053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12-well plate</td>
			<td >TTP</td>
			<td >92412</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical centrifuge tube</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >5.332.547.254</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >serological pipets</td>
			<td >VWR Collection</td>
			<td >612-5523P, 612-5827P</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >slide glass</td>
			<td >PTH CHEMLAND</td>
			<td >04-296.202.03</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transwell ThinCerts</td>
			<td >Grainer bio-one</td>
			<td >665641</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#946;5-tubulin </td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td > sc-134234</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disodium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S51136-500G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >EGT101.25</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Amplification Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BAM01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S013922</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S012522</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Hybridization Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPH03821</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >PRE134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Wash Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPW01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >HEP001.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >63138-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >32213-1L-M</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopotassium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5655-100G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6148-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PIPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >PIP666.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5405-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Prolong Diamond Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >P36970</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >SOD001.5</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trisodium Citrate 2-hydrate</td>
			<td >POCH</td>
			<td > 6132-04-3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween-20</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >TWN580.500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence Spectraviewer</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td>Modeling spectral parameters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ Fiji</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Acquiring and processing z-stack images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of sars-cov-2 using immuno rna-fluorescence in situ hybridization

Bu makale, hücre hattında şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA'sını ve insan hava yolu epitelinin üç boyutlu (3D) kültürlerini görselleştirmek için immünofluoresans ile birlikte in situ hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, prob lokalizasyonu tarafından başlatılan HCR'ye güvenerek viral RNA'nın son derece spesifik ve hassas görselleştirilmesine izin verir. Bölünmüş başlatıcı problar, floresan etiketli amplifikatörler tarafından sinyalin güçlendirilmiş hale gelir ve konfokal mikroskopide ihmal edilebilir arka plan floresan ile sonuçlanır. Amplifikatörlerin farklı floresan boyalarla etiketlenerek çeşitli hedeflerin aynı anda tanınmasını kolaylaştırır. Bu da, dokulardaki enfeksiyonun haritalandırılmasının viral patogenez ve replikasyonunu tek hücre düzeyinde daha iyi anlamasını sağlar. Bu yöntemin immünofluoresans ile birleşmesi, konak epigenomunun değişimi ve immün yanıt yolları da dahil olmak üzere konak-virüs etkileşimlerinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir. Hassas ve spesifik HCR teknolojisi sayesinde, bu protokol bir tanı aracı olarak da kullanılabilir. Tekniğin, gelecekte ortaya çıkabilecek kodlamayan RNA'lar ve RNA virüsleri de dahil olmak üzere herhangi bir RNA'nın algılanmasını sağlamak için kolayca değiştirilebileceğini hatırlamak da önemlidir.

Bu yazıda açıklanan immün-RNA-FISH protokolü iki hücresel sistem kullanılarak gerçekleştirilmiştir: Bir Vero hücre hattı ve 3D HAE kültürü. Her iki hücresel model için ana adımlar Tablo 2. SARS-CoV-2'nin HAE kültürlerinde görselleştirilmesi için RNA-FISH protokolü, doku örnekleri için tipik olan adımları içerir, yani% 100 MeOH ile permeabilizasyon ve dereceli bir Dizi MeOH-PBS ve% 0.1 Ara çözeltisi ile rehidrasyon. RNA-FISH tamamlandıktan s...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Burada, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA'yı görselleştirmek için RNA floresan in situ hibridizasyonunu (RNA-FISH) immünofluoresans ile birleştiren basit bir yöntemi açıklıyoruz. Bu protokol, SARS-CoV-2 RNA konakçı etkileşimlerinin moleküler özelliklerinin tek hücre düzeyinde anlaşılmasını artırabilir.

Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

HiBiT Tabanlı Bir Biyoreporter Kullanılarak SARS-CoV-2 Reseptör Bağlayıcı Etki Alanı Antikorunun Tespiti

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...