Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31725023, 31861133019 в GW и 31171912 в CY).

1. Проектирование геноспецифических праймеров и получение sgRNA
<ol><li>Проверка сохраненной геномной области в интересующем гене с помощью анализа амплификации и секвенирования ПЦР. Амплифицируйте ген-мишень из геномной ДНК H. armigera и различайте экзоны и интроны. ПРИМЕЧАНИЕ: Специфи?...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edited+course+of+biomedical+research:+leaping+forward+with+CRISPR.">Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR.</a> Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).</li><li>Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+editing+in+biological+and+biomedical+investigation.">CRISPR editing in biological and biomedical investigation.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).</li><li>Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas+system+in+gene+therapy:+pre-clinical+progress+in+animal+model.">Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model.</a> DNA Repair. 46, 1-8 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+glaucoma+by+ciliary+body+aquaporin+1+disruption+using+CRISPR-Cas9.">Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).</li><li>Jiao, R., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+genome+editing+revolution.">The CRISPR/Cas9 genome editing revolution.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).</li><li>Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+CRISPR+technology+development+and+deployment+into+Agricultural+Production-Consumption+Systems.">Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems.</a> World Patent Information. 60, 101944 (2020).</li><li>Es, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+CRISPR-Cas9+genome+editing+machinery+in+food+and+agricultural+science:+Current+status,+future+perspectives,+and+associated+challenges.">The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges.</a> Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).</li><li>Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-enabled+tools+for+engineering+microbial+genomes+and+phenotypes.">CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).</li><li>Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+platforms+for+genome+editing+in+plants:+developments+and+applications.">CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications.</a> Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).</li><li>Pandey, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+and+multifaceted+CRISPR/Cas+gene+editing+tool+for+plant+research.">Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Mojica, F. J., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+CRISPR-Cas+technology:+from+prokaryotes+to+mammals.">On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals.</a> Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants.">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li><li>Koutroumpa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+induces+anosmia+in+a+crop+pest+moth.">Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).</li><li>Fitt, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+Heliothis+species+in+relation+to+agroecosystems.">The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).</li><li>Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+variation+for+host+plant+use+in+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)(Lepidoptera:+Noctuidae):+implications+for+management.">Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (H&#252;bner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management.</a> Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cloning,+prokaryotic+expression,+and+biochemical+characterization+of+a+soluble+trehalase+in+Helicoverpa+armigera+H&#252;bner+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera H&#252;bner (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).</li><li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-level+genome+assembly+of+Cydia+pomonella+provides+insights+into+chemical+ecology+and+insecticide+resistance.">A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).</li><li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+adaptation+to+polyphagy+and+insecticides+in+a+major+East+Asian+noctuid+pest.">Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).</li><li>Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+a+bitter+taste+receptor+family+in+a+polyphagous+insect+herbivore.">Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore.</a> Science Reports. 6, 23666 (2016).</li><li>Gouin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genomes+of+highly+polyphagous+lepidopteran+pests+(Spodoptera+frugiperda,+Noctuidae)+with+different+host-plant+ranges.">Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+validation+of+cadherin+as+a+receptor+of+Bt+toxin+Cry1Ac+in+Helicoverpa+armigera+utilizing+the+CRISPR/Cas9+system.">Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).</li><li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins.">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).</li><li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm.">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton.">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li><li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision.">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene &amp; Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li><li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm.">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li><li>Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Artificial+Diet+and+Hybrid+Sweet+Corn+for+the+Rearing+of+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner)+(Lepidoptera:+Noctuidae)+Based+on+Life+Table+Characteristics.">A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics.</a> Environmental Entomology. (1), 30 (2012).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Zheng, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae,+or+puparia.">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).</li><li>Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+isolating+mechanisms+in+fall+armyworm+host+strains+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).</li><li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth,+Helicoverpa+assulta(Lepidoptera:+Noctuidae).">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li><li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators:+ii.+Halisidota+argentata+pack.+(arctiidae),+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+(GEOMETRIDAE).">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li></ol>

У авторов нет никаких конфликтов интересов.

Применение системы CRISPR/Cas9 обеспечило мощную техническую поддержку для анализа функции генов и взаимодействия между различными генами. Подробный протокол, который мы представляем здесь, демонстрирует генерацию гомозиготного мутанта в H. armigera посредством редактирования генома CRISP...

Применение технологии редактирования генома обеспечивает эффективный инструмент для достижения мутантов генов-мишеней у различных видов. Появление системы кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/ассоциированного белка 9 (Cas9) обеспечивает новый метод манипулирования геномами1. Система CRISPR/Cas9 состоит из направляющей РНК (гРНК) и эндонуклеазы Cas92,3, в то время как гРНК может быть дополнительно разделена на две части: целевую комплементарную CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующую crRNA (tracrRNA). ГРНК интегрируется с эндонуклеазой Cas9 и образует рибонуклеопротеин (RNP). С гРНК эндонуклеаза Cas9 может быть направлена на определенный участок генома посредством комплементации основания. Домены RuvC и HNH Cas9 расщепляют целевой участок генома на три основания перед последовательностью протоспейсер-смежных мотивов (PAM) и создают двухцепочечный разрыв (DSB). Затем расщепление ДНК может быть восстановлено с помощью двух механизмов: негомологичного конечного соединения (NHEJ) или гомологического репарации (HDR)4. Восстановление DSB вводит вставки или делеции как способ инактивации целевого гена, потенциально вызывая полную потерю функции гена. Следовательно, углеродистость и специфичность системы CRISPR/Cas9 делают ее надежным методом для характеристики функций генов in vivo и анализа взаимодействий генов5.
С многочисленными достоинствами система CRISPR/Cas9 применяется в различных областях, включая биомедицину6,7, генную терапию8,9 и сельское хозяйство10,11,12, и используется для различных биологических систем, включая микроорганизмы13, растения14,15, нематоды16 и млекопитающих17 . У беспозвоночных многие виды насекомых были подвергнуты редактированию генома CRISPR/Cas9, такие как плодовая муха Drosophila melanogaster и более 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera является одним из самых разрушительных вредителей во всем мире23 и повреждает многочисленные культуры, включая хлопок, сою и сорго24,25. С развитием технологии секвенирования геном H. armigera, а также ряд видов насекомых Lepidoptera были полностью секвенированы 26,27,28,29. Большое количество генов резистентности и обонятельных рецепторов было идентифицировано и охарактеризовано от этих насекомых в последние годы19,27,28,29. Некоторые гены, связанные с резистентностью, были идентифицированы у H. armigera, такие как гены, кодирующие cadherin30, АТФ-связывающий кассетный транспортер31,32, а также HaTSPAN133. Нокаут этих генов с использованием технологии CRISPR/Cas9 приводит к высокому уровню устойчивости к токсину Bacillus thuringiensis (BT) у восприимчивых штаммов. Кроме того, Chang et al. (2017) выбили феромонный рецептор, который подтвердил его важную функцию в регулировании времени спаривания19. Эти отчеты свидетельствуют о том, что CRISPR/ Cas9 может выступать в качестве эффективного инструмента для изучения функции генов in vivo в системах насекомых. Однако подробная процедура модификации CRISPR/Cas9 в системах насекомых остается неполной, что ограничивает диапазон ее применения в функциональной геномике насекомых.
Здесь мы представляем протокол для выбивания функционального гена у H. armigera с использованием системы CRISPR/Cas9. Предоставляется подробный пошаговый протокол, включая разработку и подготовку генно-специфических праймеров для производства гРНК, сбора эмбрионов, микроинъекции, выращивания насекомых и идентификации мутантов. Этот протокол служит ценным справочным материалом для манипулирования любыми функциональными генами у H. armigera и может быть распространен на другие виды чешуекрылых.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2kb DNA ladder</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>World Precision Instrucments</td>
			<td>504949</td>
			<td>referred to as &#34;capillary glass&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Minnesota Mining and Manufacturing Corporation</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>5192000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Eppendorf Corporate</td>
			<td>G2835241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040</td>
			<td>used for mutant detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANamp Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN Corporate</td>
			<td>DP304-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36499</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and knockout mutant identification of crispr/cas9 genome-edited helicoverpa armigera (h&#252;bner)

Хлопковый червь, Helicoverpa armigera, является одним из самых разрушительных вредителей в мире. Сочетание молекулярной генетики, физиологии, функциональной геномики и поведенческих исследований сделало H. armigera модельным видом у Lepidoptera Noctuidae. Для изучения функций in vivo и взаимодействий между различными генами технология редактирования генома кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) / ассоциированного белка 9 (Cas9) является удобным и эффективным методом, используемым для выполнения функциональных геномных исследований. В этом исследовании мы предоставляем пошаговый систематический метод для завершения нокаута гена у H. armigera с использованием системы CRISPR / Cas9. Подробно описаны конструкция и синтез направляющей РНК (гРНК). Затем суммируются последующие этапы, состоящие из генно-специфического дизайна праймера для создания направляющей РНК (гРНК), сбора эмбрионов, микроинъекции, выращивания насекомых и обнаружения мутантов. Наконец, предоставляются рекомендации и заметки по устранению неполадок для повышения эффективности редактирования генов. Наш метод будет служить справочным материалом для применения редактирования генома CRISPR/Cas9 у H. armigera , а также у других чешуекрылых мотыльков.

Этот протокол предоставляет подробные шаги для получения линий нокаута генов H. armigera с использованием технологии CRISPR/Cas9. Репрезентативные результаты, полученные по этому протоколу, обобщены для отбора гДНК, сбора и инъекции эмбрионов, выращивания насекомых и обн?...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera HÃ¼bner at JoVE.com

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&amp;#252;bner

Здесь представлен протокол микроинъекции эмбриона Helicoverpa armigera (Hübner) и нокаутирующей мутантной идентификации, созданный путем редактирования генома CRISPR/Cas9. Мутантные насекомые позволяют проводить дальнейшие исследования функции генов и взаимодействия между различными генами in vivo.

Микроинъекция эмбриона и нокаут-мутантная идентификация CRISPR/Cas9 Генетически отредактированная Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Хлопковый червь является одним из самых разрушительных вредителей во всем мире. Редактирование генома с помощью технологии CRISPR/Cas9 позволяет продолжить исследование функции генов и взаимодействия между различными генами в этом организме. Двумя основными преимуществами данной методики является то, что она обладает высокой специфичностью и является передедливой.Чтобы выбрать мишени sgRNA, перейдите на онлайн-сайт CRISPR для поиска возможных направляющих сайтов и экзонов, близких к пяти основным нетранслируемым областям гена. Введите последовательность экзонов в текстовое поле и выберите целевой геном Helicoverpa armigera. Выберите опцию PAM для 20 BPNGG и оставьте остальные настройки на параметрах по умолчанию, согласно руководствам пользователя веб-сайта.Сравните прогнозируемые направляющие последовательности из программного обеспечения и выберите направляющую последовательность из 20 пар оснований, содержащих один или два гуанина вблизи пяти простых непереведенных областей с самой высокой прогнозируемой эффективностью и наименьшим количеством несоответствий для повышения эффективности редактирования и уменьшения нецелевого редактирования. Для подготовки эмбрионов отберите 50 здоровых особей из трехдневных самцов и двухдневных самок и смешайте их в чистой клетке сетки. Поместите в клетку кусочек влажного хлопка, содержащий 10% раствор сахара.Накройте клетки сетки марлей и закрепите марлю резинкой. Распылите воду на марлю, чтобы она оставалась влажной. Нарежьте черную ткань на соответствующий размер и замените влажную марлю этой черной тканью, чтобы обеспечить свободное положение яйцеклеток в течение 30 минут.Вставьте двустороннюю ленту на предметное стекло микроскопа. С помощью щипцов наклейте пластыри с яйцами в ряд на поверхность двусторонней ленты. Нажмите на край каждого пластыря, чтобы убедиться, что они прочно прилипают к ленте.Соберите от 50 до 100 яиц на предметное стекло микроскопа. Перед микроинъекцией держите микроскоп на льду, чтобы задержать развитие эмбрионов. Подготовьте иглу, потянув за капиллярное стекло с помощью съемника микропипетки, как описано в текстовой рукописи.Измельчите наконечник иглы с помощью микрошлифовальной машины до острого наконечника. Готовят инъекционные растворы, добавляя два микролитра коммерциализированного белка Cas9 и sgRNA в воду без RNace в ПЦР-трубке для получения 10-микролитровой объемной смеси. Хорошо перемешать путем пипетки и положить на лед.Задайте параметры электронного микроинжектора. Загрузите два микролитра смеси в иглу с помощью наконечника пипетки микрозагрузчика, отсасывая как можно больше остаточного воздуха в кончике иглы. Подключите инъекционную иглу к микроманипулятору и обеспечьте плотное соединение между двумя частями.Поместите слайд в чашку Петри и поставьте его на сцену микроскопа. Осторожно вставьте кончик иглы в верхнюю полусферу эмбриона под углом 45 градусов. Нажмите на педаль, чтобы доставить смесь в эмбрион, что приведет к небольшому расширению эмбриона.Немедленно втяните иглу из эмбриона и перемещайте чашку Петри одной рукой, пока следующий эмбрион не окажется рядом с иглой. Введите не менее 300 эмбрионов, используя ту же процедуру, чтобы обеспечить достаточное количество вылупления. Накройте крышку чашки Петри после инъекции.Когда цвет поверхности эмбрионов потемнеет, поместите искусственную диету в чашку Петри вокруг предметного стекла микроскопа. Подготовьте 24-луночные культуральные пластины и заполните каждую лунку до 1/3 ее объемной емкости искусственной диетой. Выделите вылупившихся личинок с помощью небольшой кисти и перенесите их на 24-луночную культуральную пластину, чтобы в одной скважине была одна личинка.Когда личинки вырастут до третьей стадии звезды, переведите их на новую стеклянную пластичную этру. Переведите недавно заключенных самцов G-zero и взрослых самок дикого типа в свежую сетчатую клетку в равном соотношении. Снабдите их 10%-ным раствором сахара, опущенным в ватные шарики.Выращивайте насекомых обычными методами до окукливания G-one. Используйте щипцы, чтобы аккуратно удалить заднюю ногу и поместить каждую ногу в трубку Lysing Matrix. Гомогенизировать заднюю ногу с помощью тканевого гомогенизатора.Извлеките геномную ДНК гомогенизированного образца с помощью коммерческого набора для экстракции гДНК в соответствии с инструкциями производителя. Амплифицируйте сегмент гена с помощью генотипирующих праймеров и условий реакции ПЦР из текстовой рукописи. Подтвердите генотип с помощью службы секвенирования генов.Поместите особей G-one того же генотипа в одну сетчатую клетку, самостоятельно скрестите потомство G-one и продолжайте скрининг с использованием тех же методов. Целевой сайт интересующего гена находился в его втором экзоне. Этот участок был высоко сохранен, и фрагмент целевой полосы синтезированной сгРНК был подтвержден с помощью электрофореза агарозного геля.Мутантное обнаружение одной мишени сгРНК выполнялось путем секвенирования продуктов ПЦР из родительских единиц G-one. Эффективность использования неперекрывающихся пар сгРНК в разных экзонах была продемонстрирована, поскольку большое удаление мутантов было легко отличить от сковород дикого типа. После получения определенного количества мутантных особей могут быть проведены электрофизиологические или поведенческие эксперименты для уточнения функции генов и взаимодействия между различными генами.

embryo-microinjection-knockout-mutant-identification-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Behavior

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

4.3K Views.  China University of Mining and Technology. Cotton bollworm is one of the most destructive pests worldwide. Genome editing with the CRISPR/Cas9 technology enables further research of gene function and interaction among different genes in this organism. The two main advantages of this technique are that it has high specificity and is hereditable.In order to choose the sgRNA targets, go to the CRISPR online website to search for possible guide sites and the exons close to the five prime untranslated region of the gene. Input the e...