Name: examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease
Uploaded: 2021-01-18T15:00:00
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Wir danken Dr. Alex Fulcher und Monash Micro Imaging für die Unterstützung bei der Wartung und Einrichtung des Mikroskops. Das Australian Regenerative Medicine Institute wird durch Zuschüsse der Regierung des Bundesstaates Victoria und der australischen Regierung unterstützt. Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium der Muscular Dystrophy Association (USA) an P.D.C (628882) finanziert.

Die Zebrafischpflege wurde gemäß den Standardarbeitsanweisungen durchgeführt, die vom Tierethikkomitee der Monash University unter der Zuchtkolonielizenz ERM14481 genehmigt wurden.
1. Bestimmung des Genotyps lebender Embryonen unter Verwendung einer Embryo-Genotypisierungsplattform.
<ol><li>Betäubung 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischembryonen durch Zugabe von Tricainmethansulfonat zu einer Endkonzentration von 0,016% (v/v) im Embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl<...

<ol>
	<li>Egan, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+Metabolism+and+the+Molecular+Regulation+of+Skeletal+Muscle+Adaptation.">Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation.</a> Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pax3/Pax7-dependent+population+of+skeletal+muscle+progenitor+cells.">A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells.</a> Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).</li><li>Sousa-Victor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geriatric+muscle+stem+cells+switch+reversible+quiescence+into+senescence.">Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence.</a> Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).</li><li>Egerman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Increases+with+Age+and+Inhibits+Skeletal+Muscle+Regeneration.">GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration.</a> Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscular+dystrophies.">The muscular dystrophies.</a> The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).</li><li>Emery, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Duchenne muscular dystrophy. , (1993).</li><li>Anne Helbling-Leclerc, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+laminin+&#945;2-chain+gene+(LAMA2)+cause+merosin-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">Mutations in the laminin &#945;2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).</li><li>Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+muscular+dystrophies:+loss+of+cytoskeleton-extracellular+matrix+linkage.">Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage.</a> Cell. 80 (5), 675-679 (1995).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient,+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles.">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134 (1), 37-47 (2008).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Gurevich, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+division+of+clonal+muscle+stem+cells+coordinates+muscle+regeneration+in+vivo.">Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo.</a> Science. 353 (6295), (2016).</li><li>Lambert, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+rapid+cellular+extraction+from+live+zebrafish+embryos+and+larvae:+Development+and+application+to+genotyping.">An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping.</a> PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish.">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xirp+Proteins+Mark+Injured+Skeletal+Muscle+in+Zebrafish.">Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).</li><li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-inflicted+Injury+of+Zebrafish+Embryonic+Skeletal+Muscle.">Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).</li><li>Nguyen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Undergo+Extensive+Clonal+Drift+during+Tissue+Growth+via+Meox1-Mediated+Induction+of+G2+Cell-Cycle+Arrest.">Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).</li><li>Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+skeletal+muscle+growth+and+regeneration+in+amniotes+and+teleosts:+Emerging+themes.">Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).</li></ol>

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch obligate geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, deren Funktion bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie verändert wird und in der Folge den Prozess der Muskelregeneration behindert. Hier beschreiben wir ein Hochdurchsatzprotokoll zur Untersuchung der Muskelregeneration in lebenden Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen. Der erste Schritt der Pipeline verwendet eine Embryo-Genotypisierungsplattform14, eine benutzerfreundliche u...

Die Skelettmuskulatur macht 30-50% der menschlichen Körpermasse aus und ist nicht nur für die Fortbewegung unverzichtbar, sondern dient auch als kritisches Stoffwechsel- und Speicherorgan1. Obwohl sie postmitotisch ist, ist die Skelettmuskulatur hochdynamisch und behält nach einer Verletzung eine enorme Regenerationsfähigkeit. Dies wird auf das Vorhandensein von geweberesidenten Stammzellen (auch Satellitenzellen genannt) zurückgeführt, die sich unter der Basallamina von Myofibern befinden und durch die Transkriptionsfaktoren gepaartes Boxprotein 7 (pax7)und/oder gepaartes Boxprotein 3 (pax3)gekennzeichnetsind,unter anderem2,3. Nach einer Verletzung wird die Satellitenzelle aktiviert und durchläuft eine Zellproliferation, um einen Pool von Myoblasten zu erzeugen, die sich anschließend zu neuen Muskelfasern differenzieren. Die hochkonservierte Kaskade von pro-regenerativen Signalen, die die Aktivierung von Satellitenzellen und die robuste Muskelreparatur regulieren, ist unter verschiedenen Bedingungen wie Myopathien und homöostatischem Altern betroffen4,5.
Eine solche vielfältige Gruppe von Myopathien ist die Muskeldystrophie, die durch fortschreitenden Muskelschwund und Degeneration gekennzeichnet ist6. Diese Krankheiten sind die Folge genetischer Mutationen in Schlüsselproteinen, einschließlich Dystrophin und Laminin-α2 (LAMA2), die für die Bindung von Muskelfasern an die extrazelluläre Matrix verantwortlich sind7,8. Angesichts der Tatsache, dass Proteine, die an Muskeldystrophie beteiligt sind, eine so zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Muskelstruktur spielen, wurde viele Jahre lang angenommen, dass ein Versagen in diesem Prozess der Mechanismus war, der für die Krankheitspathogenese verantwortlich war9. Neuere Studien haben jedoch Defekte in der Regulation von Muskelstammzellen und anschließende Beeinträchtigungen der Muskelregeneration als zweite mögliche Grundlage für die bei Muskeldystrophie beobachtete Muskelpathologie identifiziert10,11. Daher sind weitere Studien erforderlich, um zu untersuchen, wie eine Beeinträchtigung der Muskelstammzellfunktion und der damit verbundenen Nischenelemente zur Muskeldystrophie beiträgt.
In den letzten zehn Jahren hat sich zebrafisch (Danio rerio) zu einem wichtigen Wirbeltiermodell für die Krankheitsmodellierung entwickelt12. Dies ist auf die schnelle äußere Entwicklung des Zebrafischembros zurückzuführen, gepaart mit seiner optischen Klarheit, die die direkte Visualisierung von Muskelaufbau, Wachstum und Funktion ermöglicht. Darüber hinaus ist nicht nur die Entwicklung und Struktur der Muskeln bei Zebrafischen hoch konserviert, sie zeigen auch einen hochkonservierten Prozess der Muskelregeneration13. Folglich stellen Zebrafische ein ausgezeichnetes System dar, um die Pathobiologie von Muskelerkrankungen zu untersuchen und zu untersuchen, wie die Muskelregeneration darin beeinflusst wird. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode entwickelt, die die rechtzeitige Untersuchung der Skelettmuskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht. Diese Hochdurchsatz-Pipeline beinhaltet eine Methode zur Genotypisierung lebender Embryonen14, nach der eine Nadelstichverletzung durchgeführt wird und das Ausmaß der Muskelregeneration mit Polarisationslichtmikroskopie abgebildet wird. Die Anwendung dieser Technik wird daher die Regenerationsfähigkeit der Muskeln in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen aufdecken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-3013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri Dishes</td>
			<td>Pacific Laboratory Products PT</td>
			<td>S9014S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction chips</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG chips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo genotyping platform</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG base unit</td>
			<td>Zebrafish Embryo Genotyper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plate dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Commonly referred to as FluoroDish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermoline Scientific</td>
			<td>TEI-43L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>PTP03-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing microscope</td>
			<td>Abrio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease

Die Skelettmuskulatur hat eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich nach einer Verletzung zu regenerieren, die von obligaten Gewebe-ansässigen Muskelstammzellen angetrieben wird. Nach einer Verletzung wird die Muskelstammzelle aktiviert und durchläuft eine Zellproliferation, um einen Pool von Myoblasten zu erzeugen, die sich anschließend zu neuen Muskelfasern differenzieren. Bei vielen Muskelschwundzuständen, einschließlich Muskeldystrophie und Alterung, ist dieser Prozess beeinträchtigt, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Der Prozess der Muskelregeneration bei Zebrafischen ist hoch konserviert, wobei Säugetiersysteme ein ausgezeichnetes System zur Untersuchung der Muskelstammzellfunktion und -regeneration bei Muskelschwunderkrankungen wie Muskeldystrophie bieten. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen zu untersuchen. Der erste Schritt beinhaltet die Verwendung einer Genotypisierungsplattform, die die Bestimmung des Genotyps der Larven ermöglicht, bevor eine Verletzung hervorgeschleudert wird. Nach der Bestimmung des Genotyps wird der Muskel mit einem Nadelstich verletzt, worauf hin die Polarisationslichtmikroskopie verwendet wird, um das Ausmaß der Muskelregeneration zu bestimmen. Wir bieten daher eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Die Fähigkeit, die Doppelbrechung der Skelettmuskulatur zu quantifizieren, bietet eine nicht-invasive, aber stark reproduzierbare Methode, um das Ausmaß von Muskelschäden zu untersuchen und zu vergleichen und die Muskelregeneration in vivo zuuntersuchen. Doppelbrechung resultiert aus der Beugung von polarisiertem Licht durch die pseudokristalline Anordnung der Muskelsarkomere15, und nach Verletzung oder Schädigung des Muskels ist eine Verringerung der ...

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Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Muskelregeneration in einem Zebrafischmodell für Muskelerkrankungen zu untersuchen und zu quantifizieren. Diese Methode bietet eine Hochdurchsatz-Pipeline, die nicht nur kostengünstig, sondern auch hochgradig reproduzierbar ist, um das regenerative Potenzial eines erkrankten Muskels in einer In-vivo-Umgebung zu bewerten. Avnika Ruparelia, wissenschaftliche Mitarbeiterin am Australian Regenerative Medicine Institute, demonstriert mit mir das Verfahren.Für die Genotypisierung lebender Embryonen schälen Sie den klaren Schutzfilm von der Oberseite eines 24-Kammer-DNA-Extraktionschips und verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Filterspitze mit einer Schnittspitze, um einen einzelnen betäubten Embryo in 13 Mikroliter Embryomedium in jede Kammer des Chips zu übertragen. Wenn alle Embryonen geladen sind, montieren Sie den Chip vorsichtig auf die Genotypisierungsplattform des Zebrafischembryons, indem Sie zuerst eine Seite einlegen, gefolgt vom Rest des Chips. Befestigen Sie den magnetischen Plattformdeckel über dem Chip, um die Verdunstung des Embryomediums während des DNA-Extraktionsprotokolls zu verhindern, und schließen Sie den Deckel.Stellen Sie die Basiseinheit auf 2,4 Volt, 0,051 Ampere und 0,12 Watt ein und starten Sie das DNA-Extraktionsprotokoll. Die Plattform sollte anfangen zu vibrieren, was durch sanftes Berühren des Deckels beurteilt werden kann. Bereiten Sie während des laufenden Programms eine 24-Well-Platte vor, indem Sie jedem Bohrplatz einen Milliliter Embryomedium hinzufügen und Acht-Well-Strip-Röhrchen für die Sammlung von DNA-Material von jedem Embryo kennzeichnen.Drücken Sie nach acht Minuten Extraktion die Ein-/Aus-Taste, um die Vibration der Plattform zu stoppen, entfernen Sie vorsichtig den Magnetdeckel und heben Sie den Chip von der Plattform an. 10 Mikroliter Embryomedium aus einer Kammer in die entsprechende Vertiefung des Acht-Well-Streifenröhrchens übertragen und sofort zwei Tropfen frisches Embryomedium in die Kammern geben. Der Embryo wird aus der Kammer in eine geeignete Vertiefung der zuvor vorbereiteten 24-Well-Platte überführen.Wenn alle Embryonen übertragen wurden, legen Sie die Platte in einen 28 Grad Celsius Inkubator. Führen Sie die entsprechenden nachgeschalteten Genotypisierungstests an dem genetischen Material durch, das in den Acht-Well-Strip-Röhrchen gesammelt wurde, um den Genotyp jedes Embryos zu bestimmen. Sobald der Genotyp jedes Embryos identifiziert wurde, übertragen Sie die Embryonen auf 90-Millimeter-Petrischalen mit 25 Millilitern mittlerem Wasser und inkubieren Sie die Platten bei 28 Grad Celsius bis zur Muskelverletzung.Verwenden Sie vier Tage nach der Befruchtung eine Pipette, um eine betäubte Larve in eine neue Petrischale zu übertragen und überschüssiges Medium vorsichtig unter einem Seziermikroskop aus der Schale zu entfernen. Richten Sie den Fisch so aus, dass der Kopf links, der Schwanz rechts, die dorsale Region oben und die ventrale Region unten ist, und verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um einen schnellen präzisen Stich in ein bis zwei Somiten im Epaxialmuskel über der Analpore und horizontal zum Myoseptum zu machen. Tragen Sie einen Tropfen Embryomedium auf den verletzten Zebrafisch auf und übertragen Sie die Larve vorsichtig in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die einen Milliliter frisches Embryomedium pro Vertiefung enthält.Wenn alle Larven verletzt wurden, legen Sie die Platte in den 28 Grad Celsius Inkubator, bis die Zebrafische abgebildet sind. Um die Muskelregeneration zu quantifizieren, öffnen Sie ein eintägiges Bild nach der Verletzung in einem geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramm und verwenden Sie das Polygon-Tool, um eine Form um die Wundstelle zu zeichnen. Verwenden Sie die Software, um die Fläche und die mittlere Doppelbrechungsintensität des Bereichs zu messen und diese Werte in die Zellen D3 und E3 der bereitgestellten Vorlage zu kopieren.Zeichnen Sie zwei zusätzliche Regionen, die jeweils ein bis zwei unverletzte Somiten umfassen, und messen Sie die Fläche und die mittleren Doppelbrechungsdichten jeder dieser Regionen. Kopieren Sie diese Werte in die Zellen D4 und D5 sowie E4 und E5 in der Vorlage. Wiederholen Sie dann die Messung für dieselben Regionen im Bild von drei Tagen nach der Verletzung.Wenn die Doppelbrechung in allen Bildern auf die gleiche Weise gemessen wurde, berechnen Sie die normalisierte Doppelbrechung für jede Region, indem Sie die mittlere Doppelbrechungsintensität jeder Region durch ihre Fläche dividieren. Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt die durchschnittliche normalisierte Doppelbrechung der beiden unverletzten Regionen, um einen Referenzpunkt für den unverletzten Muskel bereitzustellen. Um das Ausmaß der Muskelverletzung am ersten Tag nach der Verletzung zu bestimmen, dividieren Sie die normalisierte Doppelbrechung der Verletzungsregion durch die durchschnittliche normalisierte Doppelbrechung der unverletzten Regionen.Um das Ausmaß der Muskelregeneration zu bestimmen, dividieren Sie die normalisierte Doppelbrechung der Verletzungsregion im Bild von drei Tagen nach der Verletzung durch die durchschnittliche normalisierte Intensität der unverletzten Regionen in diesem Stadium. Berechnen Sie schließlich den regenerativen Index, indem Sie den Wert für das Ausmaß der Muskelregeneration am dritten Tag nach der Verletzung durch den Wert für das Ausmaß der Muskelverletzung am ersten Tag nach der Verletzung dividieren. In dieser repräsentativen Analyse wurde ein Gelege von Embryonen aus einer Kreuzung zwischen zwei heterozygoten Lama2-Zebrafischen auf einen DNA-Extraktionschip übertragen und anschließend genotypisiert.Während Muskelverletzungen am ersten Tag nach der Verletzung zu einer Verringerung der Doppelbrechungsintensität führen, führt die erfolgreiche Regeneration des Muskels zu einer erhöhten Doppelbrechung innerhalb derselben Region. Es ist auch bemerkenswert, dass, während Wildtyplarven aufgrund einer normalen Muskelstrukturierung eine gleichmäßige Doppelbrechungsintensität aufweisen, die Doppelbrechungsintensität im Muskel von Lama2-Knockout-Larven ungleichmäßig und sehr sporadisch ist, wahrscheinlich aufgrund einer verminderten Muskelintegrität. Wie beobachtet, zeigen sowohl Wildtyp- als auch Lama2-defiziente Larven eine signifikant erhöhte Doppelbrechungsintensität in der Wundstelle drei Tage nach der Verletzung im Vergleich zu einem Tag nach der Verletzung, was darauf hindeutet, dass sich der Muskel regeneriert hat.Die Bestimmung des regenerativen Index zeigt, dass Lama2-defiziente Larven im Vergleich zu Wildtyptieren eine auffällige Zunahme der Muskelregeneration aufweisen. Während dieses Protokoll es uns ermöglicht, Veränderungen in der Regenerationsfähigkeit des Muskels in Modellen von Muskelerkrankungen zu identifizieren, müssen nachgeschaltete zelluläre und molekulare Analysen durchgeführt werden, um die Mechanismen zu identifizieren, die für die beobachteten Veränderungen verantwortlich sind. Mit dieser Methode konnten wir feststellen, wie eine beeinträchtigte Muskelstammzellfunktion und eine Beeinträchtigung der damit verbundenen Nischenelemente zur Pathogenese von Muskelerkrankungen beiträgt, so dass wir neue Krankheitsmechanismen identifizieren können.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Röntgenbeugung von intakten Murine Skelettmuskel als Werkzeug zur Untersuchung der strukturellen Basis von Muskelerkrankungen

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...