Name: examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease
Uploaded: 2021-01-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר אלכס פולצ'ר, ול-מונאש מיקרו הדמיה על הסיוע בתחזוקת מיקרוסקופ והגדרתם. המכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית נתמך על ידי מענקים מממשלת מדינת ויקטוריה וממשלת אוסטרליה. עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט של האגודה לניוון שרירים (ארה"ב) ל-P.D.C (628882).

תחזוקת דגי הזברה בוצעה בהתאם לנהלי ההפעלה הסטנדרטיים שאושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת מונאש תחת רישיון מושבת הרבייה ERM14481.
1. קביעת הגנוטיפ של עוברים חיים באמצעות פלטפורמת גנוטיפינג עוברית.
<ol><li>2000 גרם ל-3 ימים לאחר ההפריה (dpf) עוברים של דגי זברה על ידי הוספת ...

<ol>
	<li>Egan, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+Metabolism+and+the+Molecular+Regulation+of+Skeletal+Muscle+Adaptation.">Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation.</a> Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pax3/Pax7-dependent+population+of+skeletal+muscle+progenitor+cells.">A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells.</a> Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).</li><li>Sousa-Victor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geriatric+muscle+stem+cells+switch+reversible+quiescence+into+senescence.">Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence.</a> Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).</li><li>Egerman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Increases+with+Age+and+Inhibits+Skeletal+Muscle+Regeneration.">GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration.</a> Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscular+dystrophies.">The muscular dystrophies.</a> The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).</li><li>Emery, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Duchenne muscular dystrophy. , (1993).</li><li>Anne Helbling-Leclerc, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+laminin+&#945;2-chain+gene+(LAMA2)+cause+merosin-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">Mutations in the laminin &#945;2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).</li><li>Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+muscular+dystrophies:+loss+of+cytoskeleton-extracellular+matrix+linkage.">Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage.</a> Cell. 80 (5), 675-679 (1995).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient,+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles.">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134 (1), 37-47 (2008).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Gurevich, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+division+of+clonal+muscle+stem+cells+coordinates+muscle+regeneration+in+vivo.">Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo.</a> Science. 353 (6295), (2016).</li><li>Lambert, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+rapid+cellular+extraction+from+live+zebrafish+embryos+and+larvae:+Development+and+application+to+genotyping.">An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping.</a> PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish.">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xirp+Proteins+Mark+Injured+Skeletal+Muscle+in+Zebrafish.">Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).</li><li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-inflicted+Injury+of+Zebrafish+Embryonic+Skeletal+Muscle.">Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).</li><li>Nguyen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Undergo+Extensive+Clonal+Drift+during+Tissue+Growth+via+Meox1-Mediated+Induction+of+G2+Cell-Cycle+Arrest.">Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).</li><li>Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+skeletal+muscle+growth+and+regeneration+in+amniotes+and+teleosts:+Emerging+themes.">Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).</li></ol>

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שרירים תושב רקמות מחייבים, שתפקידם משתנה במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, ובהמשך פוגע בתהליך של התחדשות השרירים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול תפוקה גבוהה כדי לבחון התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה חיים של מחלת שרירים. השלב הראשון של הצינור משתמש ב...

שריר השלד מהווה 30-50% ממסת גוף האדם, והוא לא רק הכרחי לקטר, אלא הוא משמש גם כאיבר מטבולי ואחסון קריטי1. למרות היותו פוסט-מיטוטי, שריר השלד דינמי מאוד ושומר על יכולת התחדשות אדירה בעקבות פציעה. זה מיוחס לנוכחות של תאי גזע תושב רקמות (המכונה גם תאי לווין), הממוקם מתחת למינה הבסיסית של myofibers ומסומן על ידי גורמי שעתוק זיווג חלבון תיבה 7 (pax7) ו / או חלבון תיבת מזווג 3 (pax3), בין היתר2,3. בעקבות פציעה, תא הלוויין מופעל ועובר התפשטות תאים כדי ליצור מאגר של myoblasts, אשר לאחר מכן להבדיל כדי ליצור סיבי שריר חדשים. מפל שמור מאוד של אותות פרו-רגנרטיביים המסדירים את הפעלת תאי הלוויין ותיקון שרירים חזק מושפע בתנאים שונים כגון מיופתיות והזדקנות הומיאוסטטית4,5.
קבוצה מגוונת כזו של מיופתיות היא ניוון שרירים, המאופיין בבזבוז שרירים מתקדם וניוון6. מחלות אלה הן תוצאה של מוטציות גנטיות בחלבונים מרכזיים, כולל דיסטרופין ולמינין-α2 (LAMA2), האחראי על צירוף סיבי שריר למטריקס החוץ תאי7,8. בהתחשב בכך חלבונים מעורבים ניוון שרירים לשחק תפקיד מרכזי כזה בשמירה על מבנה השריר, במשך שנים רבות האמינו כי כישלון בתהליך זה היה המנגנון האחראי על פתוגנזההמחלה 9. עם זאת, מחקרים אחרונים זיהו פגמים בוויסות תאי גזע שרירים ופגיעה לאחר מכן בהתחדשות השרירים כבסיס אפשרי שני לפתולוגיית השרירים שנצפו בניוון שרירים10,11. ככזה, דרושים מחקרים נוספים כדי לחקור כיצד פגיעה בתפקוד תאי גזע שרירים ואלמנטים נישה הקשורים תורם ניוון שרירים.
בעשור האחרון, דגי זברה(דניו rerio)הופיעו כמודל בעל חוליות חשוב עבור מודל מחלות12. זה מיוחס להתפתחות החיצונית המהירה של העובר דג הזברה, יחד עם הבהירות האופטית שלו, המאפשרת הדמיה ישירה של היווצרות שרירים, צמיחה ותפקוד. בנוסף, לא רק הפיתוח והמבנה של שריר שמור מאוד דגי זברה, הם גם מציגים תהליך שמור מאוד שלהתחדשות שרירים 13. כתוצאה מכך, דגי זברה מייצגים מערכת מצוינת לחקר הפתוביולוגיה של מחלות שרירים, ולחקור כיצד התחדשות השרירים מושפעת ממנה. לכך פיתחנו שיטה המאפשרת מחקר בזמן של התחדשות שרירי השלד במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים. צינור תפוקה גבוה זה כרוך בשיטה לגנוטיפ עוברים חיים14, ולאחר מכן מתבצעת פגיעה דקירת מחט ומידת התחדשות השרירים מצטלם באמצעות מיקרוסקופיית אור מקוטבת. ניצול טכניקה זו יחשוף אפוא את היכולת המתחדשת של השריר במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-3013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri Dishes</td>
			<td>Pacific Laboratory Products PT</td>
			<td>S9014S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction chips</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG chips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo genotyping platform</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG base unit</td>
			<td>Zebrafish Embryo Genotyper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plate dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Commonly referred to as FluoroDish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermoline Scientific</td>
			<td>TEI-43L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>PTP03-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing microscope</td>
			<td>Abrio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease

לשריר השלד יש יכולת יוצאת דופן להתחדש בעקבות פציעה, המונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות. בעקבות פציעה, תא גזע השריר מופעל ועובר התפשטות תאים כדי ליצור מאגר של myoblasts, אשר לאחר מכן להבדיל כדי ליצור סיבי שריר חדשים. במצבים רבים של בזבוז שרירים, כולל ניוון שרירים והזדקנות, תהליך זה נפגע וכתוצאה מכך חוסר היכולת של השריר להתחדש. תהליך התחדשות השרירים בדגי זברה נשמר מאוד במערכות יונקים המספקות מערכת מצוינת לחקר תפקוד תאי גזע שריריים והתחדשות, בתנאים מבזבזי שרירים כגון ניוון שרירים. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים. הצעד הראשון כרוך בשימוש בפלטפורמת genotyping המאפשרת קביעת הגנוטיפ של הזחלים לפני גרימת פציעה. לאחר שקבע את הגנוטיפ, השריר נפגע באמצעות דקירת מחט, שלאחריה מיקרוסקופיה אור מקוטב משמש כדי לקבוע את מידת התחדשות השרירים. לכן אנו מספקים צינור תפוקה גבוהה המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

היכולת לכמת את ההעתקה הדו-צדדית של שריר השלד מספקת שיטה לא פולשנית אך ניתנת לשחזור רב כדי לבחון ולהשוות רמות של נזק לשרירים, ולבחון התחדשות שרירים ב- vivo. Birefringence נובע עקיפה של אור מקוטב דרך המערך פסאודו גבישי של sarcomeres שריר15, ולאחר פציעה או נזק לשריר, ניכרת ...

Watch this Scientific Journal Video about Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease at JoVE.com

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבחון ולכומת התחדשות שרירים במודל דגי זברה של מחלת שרירים. שיטה זו מספקת צינור תפוקה גבוהה כי הוא לא רק חסכוני, אלא גם רבייה מאוד ניקוד הפוטנציאל המתחדש של שריר חולה בסביבה in vivo. הדגמת ההליך איתי תהיה אבניקה רופארליה, עמיתת מחקר במכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית.עבור גנוטיפינג עובר חי, לקלף את סרט המגן הברור מפני השטח העליונים של שבב מיצוי DNA 24 תאים ולהשתמש קצה מסנן microliter 20 עם קצה לחתוך להעביר עובר אחד מרדים ב 13 microliters של מדיום עובר לתוך כל תא של השבב. כאשר כל העוברים נטענו, הר בעדינות את השבב על פלטפורמת הגנוטיפינג של עובר דג הזברה על ידי הצבת צד אחד בראשון, ואחריו שאר השבב. הדביק את מכסה הפלטפורמה המגנטית מעל השבב כדי למנוע אידוי של מדיום עובר במהלך פרוטוקול מיצוי ה- DNA ולסגור את המכסה.הגדר את יחידת הבסיס ל- 2.4 וולט, 0.051 אמפר ו- 0.12 וואט והתחל את פרוטוקול חילוץ הדנ"א. הפלטפורמה צריכה להתחיל לרטט, אשר ניתן להעריך על ידי נגיעה עדינה במכסה. בזמן שהתוכנית פועלת, הכינו צלחת של 24 באר על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום עובר לכל באר ולסמן צינורות רצועה שמונה באר שישמשו לאיסוף חומר DNA מכל עובר.לאחר שמונה דקות של מיצוי, לחץ על כפתור ההפעלה / כיבוי כדי לעצור את הרטט של הפלטפורמה, הסר בעדינות את המכסה המגנטי והרם את השבב מהפלטפורמה. מעבירים 10 מיקרוליטרים של עובר בינוני מתא אחד לבאר המתאימה של צינור הפסים שמונה-well ומיד מוסיפים שתי טיפות של מדיום עובר טרי לתאים. מעבירים את העובר מהתא לבאר מתאימה של צלחת 24-באר שהוכנה בעבר.כאשר כל העוברים הועברו, מניחים את הצלחת באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס. בצע את בדיקות הגנוטיפינג המתאימות במורד הזרם על החומר הגנטי שנאסף בצינורות הרצועה שמונה בארות כדי לקבוע את הגנוטיפ של כל עובר. לאחר הגנוטיפ של כל עובר זוהה, להעביר את העוברים ל 90 מילימטר צלחות פטרי המכיל 25 מיליליטר של מים בינוניים ודגורת הצלחות ב 28 מעלות צלזיוס עד פגיעה בשרירים.בארבעה ימים לאחר ההפריה, השתמשו בצינור כדי להעביר זחל אחד מרדים לצלחת פטרי חדשה ולהסיר בזהירות כל מדיום עודף מהמנה תחת מיקרוסקופ ניתוח. כוון את הדג כך שהראש נמצא בצד שמאל, הזנב הוא בצד ימין, אזור הגב הוא למעלה, והאזור הגחון הוא למטה, ולהשתמש מחט 30 מד כדי להפוך דקירה מדויקת מהירה לתוך אחד עד שני סומיטים בשריר epaxial מעל נקבובית anal ואופקי myoseptum. החל טיפה של בינוני עובר על דג הזברה הפצוע ולהעביר בזהירות את הזחל לתוך באר אחת של צלחת 24 באר המכילה מיליליטר אחד של מדיום עובר טרי לבאר.כאשר כל הזחלים נפצעו, מניחים את הצלחת בחממה של 28 מעלות צלזיוס עד שדג הזברה מדמה. כדי לכמת את התחדשות השרירים, פתח תמונה של יום אחד לאחר פציעה בתוכנת ניתוח תמונה מתאימה והשתמש בכלי המצולע כדי לצייר צורה סביב אתר הפצע. השתמש בתוכנה כדי למדוד את האזור ולהתכוון לעוצמת ה- birefringence של האזור ולהעתיק ערכים אלה לתאים D3 ו- E3 של התבנית שסופקה.צייר שני אזורים נוספים שכל אחד מהם משתרע על פני סומיט אחד עד שני סומיטים שלא נפגעו ומדוד את האזור ומשמעותו עוצמות birefringence של כל אחד מהאזורים האלה. העתק ערכים אלה לתאים D4 ו- D5 ו- E4 ו- E5 בתבנית. לאחר מכן חזור על המדידה עבור אותם אזורים בתמונת שלושת הימים שלאחר הפציעה.כאשר ההשתתפות הדו-צדדית נמדדה באותו אופן בכל התמונות, חשב את ההשתנות המנורמלת עבור כל אזור על-ידי חלוקת עוצמת ההשתתפות הממוצעת של כל אזור לפי האזור שלו. עבור כל נקודת זמן, לחשב את birefringence מנורמל הממוצע של שני האזורים ללא פגע כדי לספק נקודת התייחסות עבור השריר ללא פגע. כדי לקבוע את היקף הפגיעה בשרירים ביום הראשון לאחר הפציעה, חלקו את ההפרשה המנורמלת של אזור הפציעה על ידי ההפרשה הנורמלית הממוצעת של האזורים שלא נפגעו.כדי לקבוע את מידת התחדשות השרירים, חלקו את ההפרשה המנורמלת של אזור הפציעה בשלושת הימים שלאחר הפגיעה בעוצמה הנורמלית הממוצעת של האזורים הלא נפגעים בשלב זה. לבסוף, לחשב את המדד הרגנרטיבי על ידי חלוקת הערך להיקף התחדשות השריר ביום השלישי לאחר הפגיעה על ידי הערך להיקף הפגיעה בשריר ביום הראשון לאחר הפציעה. בניתוח מייצג זה, מצמד של עוברים מהצלבה בין שני דגי זברה הטרוזיגוס Lama2 הועבר לשבב מיצוי DNA ולאחר מכן genotyped.בעוד פגיעה בשרירים גורמת לירידה בעוצמת ההפחתה ביום הראשון לאחר הפציעה, התחדשות מוצלחת של השרירים גורמת לירידה בעוצמה בתוך אותו אזור. ראוי לציין גם כי בעוד זחלים מסוג בר להציג עוצמת birefringence אחידה עקב דפוס שרירים נורמלי, עוצמת birefringence בשריר של Lama2 נוקאאוט זחלים אינה אחידה מאוד ספורדי סביר בשל שלמות שריר מופחתת. כפי שנצפה, הן סוג פראי וזחלים Lama2 לקוי להפגין עוצמת birefringence מוגברת באופן משמעותי באתר הפצע בשלושה ימים לאחר פציעה לעומת ביום אחד לאחר פציעה, המציין כי השריר התחדש.קביעת המדד המתחדש מגלה כי זחלים לקויים Lama2 להציג עלייה בולטת התחדשות שרירים לעומת חיות סוג בר. בעוד פרוטוקול זה יאפשר לנו לזהות כל שינוי ביכולת של השריר להתחדש במודלים של מחלת שרירים, במורד הזרם ניתוח תאי ומולקולרי צריך להתבצע כדי לזהות את המנגנונים האחראים לשינויים שנצפו. שיטה זו אפשרה לנו לזהות כיצד תפקוד לקוי של תאי גזע שרירים ופגיעה באלמנטים נישה הקשורים תורם פתוגנזה מחלת שרירים, ולכן מאפשר לנו לזהות מנגנוני מחלה חדשניים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

באמצעות תגובת מגע עוררת ו תנועת מבחנים להעריך שריר ביצועים ופונקציות של דג זברה

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...