Name: examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease
Uploaded: 2021-01-18T15:00:00
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Vorremmo ringraziare il Dr. Alex Fulcher e Monash Micro Imaging per l'assistenza con la manutenzione e la configurazione del microscopio. L'Australian Regenerative Medicine Institute è supportato da sovvenzioni del governo statale di Victoria e del governo australiano. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del progetto della Muscular Dystrophy Association (USA) a P.D.C (628882).

La manutenzione del pesce zebra è stata effettuata secondo le procedure operative standard approvate dal Comitato etico degli animali dell'Università di Monash con licenza di colonia riproduttiva ERM14481.
1. Determinazione del genotipo degli embrioni vivi utilizzando una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni.
<ol><li>Anestetizzare 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) embrioni di zebrafish aggiungendo tricaina metanosolfonato ad una concentrazione finale dello 0,016% (v/v) in terre...

<ol>
	<li>Egan, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+Metabolism+and+the+Molecular+Regulation+of+Skeletal+Muscle+Adaptation.">Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation.</a> Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+division+of+clonal+muscle+stem+cells+coordinates+muscle+regeneration+in+vivo.">Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo.</a> Science. 353 (6295), (2016).</li><li>Lambert, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+rapid+cellular+extraction+from+live+zebrafish+embryos+and+larvae:+Development+and+application+to+genotyping.">An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping.</a> PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. 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(71), e4351 (2013).</li><li>Nguyen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Undergo+Extensive+Clonal+Drift+during+Tissue+Growth+via+Meox1-Mediated+Induction+of+G2+Cell-Cycle+Arrest.">Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).</li><li>Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+skeletal+muscle+growth+and+regeneration+in+amniotes+and+teleosts:+Emerging+themes.">Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).</li></ol>

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato, la cui funzione è alterata in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, ostacolando successivamente il processo di rigenerazione muscolare. Qui, descriviamo un protocollo ad alto rendimento per esaminare la rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish vivi di malattia muscolare. Il primo passo della pipeline utilizza una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni14</sup...

Il muscolo scheletrico rappresenta il 30-50% della massa corporea umana e non è solo indispensabile per la locomozione, ma funge anche da organo metabolico e di stoccaggio critico1. Nonostante sia postmitotico, il muscolo scheletrico è altamente dinamico e mantiene un'enorme capacità rigenerativa dopo l'infortunio. Ciò è attribuito alla presenza di cellule staminali residenti nei tessuti (chiamate anche cellule satelliti), situate sotto la lamina basale delle miofibre e contrassegnate dai fattori di trascrizione accoppiati box protein 7 (pax7) e / o paired box protein 3 (pax3), tra gli altri2,3. A seguito di lesioni, la cellula satellite viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. La cascata altamente conservata di segnali pro-rigenerativi che regolano l'attivazione delle cellule satelliti e la robusta riparazione muscolare è influenzata in varie condizioni come le miopatie e l'invecchiamento omeostatico4,5.
Uno di questi diversi gruppi di miopatie è la distrofia muscolare, caratterizzata da progressivo deperimento muscolare e degenerazione6. Queste malattie sono la conseguenza di mutazioni genetiche in proteine chiave, tra cui distrofina e laminina-α2 (LAMA2), responsabili dell'attaccamento delle fibre muscolari alla matrice extracellulare7,8. Dato che le proteine implicate nella distrofia muscolare svolgono un ruolo così centrale nel mantenimento della struttura muscolare, per molti anni si è creduto che un fallimento in questo processo fosse il meccanismo responsabile della patogenesi della malattia9. Tuttavia, studi recenti hanno identificato difetti nella regolazione delle cellule staminali muscolari e conseguente compromissione nella rigenerazione muscolare come seconda possibile base per la patologia muscolare osservata nella distrofia muscolare10,11. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per indagare su come una compromissione della funzione delle cellule staminali muscolari e degli elementi di nicchia associati contribuisca alla distrofia muscolare.
Negli ultimi dieci anni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un importante modello di vertebrati per la modellazione delle malattie12. Ciò è attribuito al rapido sviluppo esterno dell'embrione di zebrafish, insieme alla sua chiarezza ottica, che consente la visualizzazione diretta della formazione, della crescita e della funzione muscolare. Inoltre, non solo lo sviluppo e la struttura del muscolo sono altamente conservati nel pesce zebra, ma mostrano anche un processo altamente conservato di rigenerazione muscolare13. Di conseguenza, i pesci zebra rappresentano un ottimo sistema per studiare la patobiologia delle malattie muscolari ed esplorare come la rigenerazione muscolare è influenzata in essa. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo che consente lo studio tempestivo della rigenerazione del muscolo scheletrico in modelli di zebrafish di malattia muscolare. Questa pipeline ad alto rendimento comporta un metodo per genotipizzare gli embrioni vivi14, a seguito del quale viene eseguita una lesione da pugnalata con ago e l'entità della rigenerazione muscolare viene cioè utilizzando la microscopia a luce polarizzante. L'utilizzo di questa tecnica rivelerà quindi la capacità rigenerativa del muscolo nei modelli di zebrafish di malattia muscolare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-3013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri Dishes</td>
			<td>Pacific Laboratory Products PT</td>
			<td>S9014S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction chips</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG chips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo genotyping platform</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG base unit</td>
			<td>Zebrafish Embryo Genotyper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plate dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Commonly referred to as FluoroDish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermoline Scientific</td>
			<td>TEI-43L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>PTP03-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing microscope</td>
			<td>Abrio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease

Il muscolo scheletrico ha una notevole capacità di rigenerarsi dopo una lesione, che è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato. A seguito di lesioni, la cellula staminale muscolare viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. In molte condizioni di deperimento muscolare, tra cui la distrofia muscolare e l'invecchiamento, questo processo è compromesso con conseguente incapacità del muscolo di rigenerarsi. Il processo di rigenerazione muscolare nel pesce zebra è altamente conservato con sistemi di mammiferi che forniscono un eccellente sistema per studiare la funzione e la rigenerazione delle cellule staminali muscolari, in condizioni di deperimento muscolare come la distrofia muscolare. Qui, presentiamo un metodo per esaminare la rigenerazione muscolare nei modelli di zebrafish di malattia muscolare. Il primo passo prevede l'utilizzo di una piattaforma di genotipizzazione che permette la determinazione del genotipo delle larve prima di suscitare una lesione. Dopo aver determinato il genotipo, il muscolo viene ferito usando una pugnalata con ago, a seguito della quale viene utilizzata la microscopia a luce polarizzante per determinare l'entità della rigenerazione muscolare. Forniamo quindi una pipeline ad alta produttività che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli zebrafish di malattia muscolare.

La capacità di quantificare la birifrangenza del muscolo scheletrico fornisce un metodo non invasivo ma altamente riproducibile per esaminare e confrontare i livelli di danno muscolare ed esaminare la rigenerazione muscolare in vivo. La birifrangenza deriva dalla diffrazione della luce polarizzata attraverso l'array pseudo-cristallino dei sarcomeri muscolari15e, a seguito di lesioni o danni al muscolo, è evidente una riduzione della birifrangenza. Allo s...

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Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di esaminare e quantificare la rigenerazione muscolare in un modello di zebrafish di malattia muscolare. Questo metodo fornisce una pipeline ad alto rendimento che non è solo conveniente, ma anche altamente riproducibile nel segnare il potenziale rigenerativo di un muscolo malato in un ambiente in vivo. A dimostrare la procedura con me sarà Avnika Ruparelia, ricercatrice presso l'Australian Regenerative Medicine Institute.Per la genotipizzazione di embrioni vivi, staccare il film protettivo trasparente dalla superficie superiore di un chip di estrazione del DNA a 24 camere e utilizzare una punta filtrante da 20 microlitri con una punta tagliata per trasferire un singolo embrione anestetizzato in 13 microlitri di mezzo embrionale in ciascuna camera del chip. Quando tutti gli embrioni sono stati caricati, montare delicatamente il chip sulla piattaforma di genotipizzazione dell'embrione di zebrafish posizionando un lato in primo luogo, seguito dal resto del chip. Apporre il coperchio della piattaforma magnetica sul chip per impedire l'evaporazione del mezzo embrionale durante il protocollo di estrazione del DNA e chiudere il coperchio.Impostare l'unità di base su 2,4 volt, 0,051 ampere e 0,12 watt e avviare il protocollo di estrazione del DNA. La piattaforma dovrebbe iniziare a vibrare, che può essere valutata toccando delicatamente il coperchio. Mentre il programma è in esecuzione, preparare una piastra a 24 pozzetti aggiungendo un millilitro di mezzo embrionale a ciascun pozzetto ed etichettare tubi a strisce a otto pozzetti da utilizzare per la raccolta di materiale di DNA da ciascun embrione.Dopo otto minuti di estrazione, premere il pulsante di accensione / spegnimento per interrompere la vibrazione della piattaforma, rimuovere delicatamente il coperchio magnetico e sollevare il chip dalla piattaforma. Trasferire 10 microlitri di mezzo embrionale da una camera nel pozzo appropriato del tubo a strisce a otto pozzi e aggiungere immediatamente due gocce di terreno embrionale fresco alle camere. Trasferire l'embrione dalla camera a un pozzo appropriato della piastra a 24 pozzi precedentemente preparata.Quando tutti gli embrioni sono stati trasferiti, posizionare la piastra in un'incubatrice a 28 gradi Celsius. Eseguire gli opportuni test di genotipizzazione a valle sul materiale genetico raccolto nei tubi a strisce a otto pozzi per determinare il genotipo di ciascun embrione. Una volta identificato il genotipo di ciascun embrione, trasferire gli embrioni in piastre di Petri da 90 millimetri contenenti 25 millilitri di acqua media e incubare le piastre a 28 gradi Celsius fino alla lesione muscolare.A quattro giorni dopo la fecondazione, utilizzare una pipetta per trasferire una larva anestetizzata in una nuova capsula di Petri e rimuovere con cura qualsiasi mezzo in eccesso dal piatto sotto un microscopio sezionante. Orienta il pesce in modo tale che la testa sia a sinistra, la coda sia a destra, la regione dorsale sia in alto e la regione ventrale sia verso il basso, e usa un ago calibro 30 per fare una pugnalata rapida e precisa in uno o due somiti nel muscolo epaxial sopra il poro anale e orizzontale al miosepto. Applicare una goccia di mezzo embrionale al pesce zebra ferito e trasferire con cura la larva in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di embrione fresco per pozzetto.Quando tutte le larve sono state ferite, posizionare la piastra nell'incubatrice a 28 gradi Celsius fino a quando il pesce zebra non viene ripreso. Per quantificare la rigenerazione muscolare, aprire un'immagine post-infortunio di un giorno in un programma software di analisi delle immagini appropriato e utilizzare lo strumento poligono per disegnare una forma attorno al sito della ferita. Utilizzare il software per misurare l'area e l'intensità media di birifrangenza della regione e copiare questi valori nelle celle D3 ed E3 del modello fornito.Disegna due regioni aggiuntive che coprono ciascuna da uno a due somiti illesi e misura l'area e le intensità di birifrangenza media di ciascuna di queste regioni. Copiare questi valori nelle celle D4 e D5 e E4 ed E5 nel modello. Quindi ripetere la misurazione per le stesse regioni nell'immagine dei tre giorni post-infortunio.Quando la birifrangenza è stata misurata nello stesso modo in tutte le immagini, calcolare la birifrangenza normalizzata per ogni regione dividendo l'intensità media di birifrangenza di ciascuna regione per la sua area. Per ogni punto temporale, calcolare la birifrangenza media normalizzata delle due regioni non lese per fornire un punto di riferimento per il muscolo non infortunato. Per determinare l'entità della lesione muscolare al primo giorno post-infortunio, dividere la birifrangenza normalizzata della regione della lesione per la birifrangenza media normalizzata delle regioni non ferite.Per determinare l'entità della rigenerazione muscolare, dividere la birifrangenza normalizzata della regione della lesione nell'immagine post-lesione di tre giorni per l'intensità media normalizzata delle regioni non ferite in questa fase. Infine, calcola l'indice rigenerativo dividendo il valore per l'estensione della rigenerazione muscolare al terzo giorno post-infortunio per il valore per l'entità della lesione muscolare al primo giorno post-infortunio. In questa analisi rappresentativa, una frizione di embrioni da un incrocio tra due pesci zebra eterozigoti Lama2 è stata trasferita in un chip di estrazione del DNA e successivamente genotipata.Mentre la lesione muscolare si traduce in una riduzione dell'intensità della birifrangenza al primo giorno dopo l'infortunio, la rigenerazione riuscita del muscolo si traduce in un aumento della birifrangenza all'interno della stessa regione. È anche interessante notare che mentre le larve selvatiche mostrano un'intensità di birifrangenza uniforme a causa di un normale pattern muscolare, l'intensità di birifrangenza nel muscolo delle larve knockout lama2 è irregolare e altamente sporadica probabilmente a causa di una ridotta integrità muscolare. Come osservato, sia il tipo selvatico che le larve carenti di Lama2 mostrano un'intensità di birifrangenza significativamente aumentata nel sito della ferita a tre giorni dopo l'infortunio rispetto a un giorno dopo l'infortunio, indicando che il muscolo si è rigenerato.La determinazione dell'indice rigenerativo rivela che le larve carenti di Lama2 mostrano un notevole aumento della rigenerazione muscolare rispetto agli animali selvatici. Mentre questo protocollo ci permetterà di identificare eventuali alterazioni nella capacità del muscolo di rigenerarsi in modelli di malattie muscolari, è necessario eseguire analisi cellulari e molecolari a valle per identificare i meccanismi responsabili dei cambiamenti osservati. Questo metodo ci ha permesso di identificare come la compromissione della funzione delle cellule staminali muscolari e una compromissione degli elementi di nicchia associati contribuiscano alla patogenesi della malattia muscolare, permettendoci quindi di identificare nuovi meccanismi di malattia.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Diffrazione a raggi X del muscolo scheletrico Murine intatto come strumento per studiare la base strutturale della malattia muscolare

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica