Name: examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease
Uploaded: 2021-01-18T15:00:00
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私たちは、アレックス・フルチャー博士とモナッシュマイクロイメージングに顕微鏡のメンテナンスとセットアップの支援を感謝したいと思います。オーストラリア再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの助成金によって支援されています。この研究は、P..C D.(628882)に対する筋ジストロフィー協会(米国)プロジェクト助成金によって資金提供されました。

ゼブラフィッシュのメンテナンスは、コロニーの飼育ライセンスERM14481の下でモナッシュ大学動物倫理委員会によって承認された標準的な操作手順に従って行われました。
1. 胚遺伝子型プラットフォームを用いた生きた胚の遺伝子型の決定
<ol><li>受精後3日間(dpf)ゼブラフィッシュ胚を、トリケインメタンスルホン酸を胚培地中の0.016%(v/v)の最終濃度(5 mM NaCl、0.17mM KCl、0.3...

<ol>
	<li>Egan, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+Metabolism+and+the+Molecular+Regulation+of+Skeletal+Muscle+Adaptation.">Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation.</a> Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Increases+with+Age+and+Inhibits+Skeletal+Muscle+Regeneration.">GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration.</a> Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscular+dystrophies.">The muscular dystrophies.</a> The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).</li><li>Emery, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Duchenne muscular dystrophy. , (1993).</li><li>Anne Helbling-Leclerc, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Gurevich, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+division+of+clonal+muscle+stem+cells+coordinates+muscle+regeneration+in+vivo.">Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo.</a> Science. 353 (6295), (2016).</li><li>Lambert, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+rapid+cellular+extraction+from+live+zebrafish+embryos+and+larvae:+Development+and+application+to+genotyping.">An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping.</a> PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish.">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xirp+Proteins+Mark+Injured+Skeletal+Muscle+in+Zebrafish.">Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).</li><li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-inflicted+Injury+of+Zebrafish+Embryonic+Skeletal+Muscle.">Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).</li><li>Nguyen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Undergo+Extensive+Clonal+Drift+during+Tissue+Growth+via+Meox1-Mediated+Induction+of+G2+Cell-Cycle+Arrest.">Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).</li><li>Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+skeletal+muscle+growth+and+regeneration+in+amniotes+and+teleosts:+Emerging+themes.">Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).</li></ol>

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋肉疾患で機能が変化し、その後筋肉再生のプロセスを妨げる義務組織常駐筋幹細胞によって駆動される。ここでは、筋肉疾患の生きているゼブラフィッシュモデルにおける筋肉再生を調べるための高スループットプロトコルについて述べる。パイプラインの第1ステップは、下流再生アッセイを行う前に、生きた幼虫の遺伝子型を決定するユー...

骨格筋は人体質量の30~50%を占め、移動に欠かせないだけでなく、重要な代謝・貯蔵器官1としても機能する。死後であるにもかかわらず、骨格筋は非常に動的であり、傷害後の驚異的な再生能力を保持する。これは、組織常駐幹細胞(衛星細胞とも呼ばれる)の存在に起因し、ミオファイバーの基底層薄層の下に位置し、組み合わされたボックスタンパク質7(pax7)および/またはペアドボックスタンパク質3(pax3)の転写因子によってマークされ、とりわけ2、3である。傷害後、衛星細胞は活性化され、細胞増殖を受けて筋芽細胞のプールを生成し、その後分化して新しい筋線維を形成する。衛星細胞の活性化および堅牢な筋肉修復を調節する再生前信号の高度に保存されたカスケードは、ミオパチーおよび恒育老化4、5などの様々な条件で影響を受ける。
このような多様な筋障害のグループの1つは、筋ジストロフィーであり、進行性の筋消耗と変性を特徴とする6.これらの疾患は、ジストロフィンおよびラミニンα2(LAMA2)を含む主要タンパク質における遺伝子変異の結果であり、細胞外マトリックス7,8への筋線維の付着を担う。筋ジストロフィーに関与するタンパク質が筋肉構造を維持する上で中心的な役割を果たしていることを考えると、この過程での障害が病態病病の原因となるメカニズムであると長年考えられていた9。しかし、最近の研究では、筋ジストロフィー10,11で観察された筋病理の第2の可能な基礎として、筋幹細胞の調節およびそれに続く筋再生の障害を同定した。したがって、筋幹細胞機能の障害および関連するニッチ要素が筋ジストロフィーにどのように寄与するかを調査するために、さらなる研究が必要です。
過去10年間、ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、疾患モデリング12の重要な脊椎動物モデルとして登場しました。これは、ゼブラフィッシュ胚の急速な外部発達に起因し、その光学的明瞭さと相まって、筋肉の形成、成長、および機能を直接視覚化することができる。また、ゼブラフィッシュにおいて高度に保存された筋肉の発達と構造だけでなく、筋肉再生13の高度に保存されたプロセスも示している。その結果、ゼブラフィッシュは、筋肉疾患の病理生物学を研究し、筋肉再生がどのように影響を受けるかを探求するための優れたシステムを表しています。そのために、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける骨格筋再生のタイムリーな研究を可能にする方法を開発しました。この高スループットパイプラインは、生きた胚14を遺伝子型化する方法を含み、その後、針刺し損傷が行われ、偏光顕微鏡を用いて筋肉再生の程度が画像化される。したがって、この技術の利用は、筋肉疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉の再生能力を明らかにする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-3013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri Dishes</td>
			<td>Pacific Laboratory Products PT</td>
			<td>S9014S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction chips</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG chips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo genotyping platform</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG base unit</td>
			<td>Zebrafish Embryo Genotyper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plate dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Commonly referred to as FluoroDish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermoline Scientific</td>
			<td>TEI-43L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>PTP03-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing microscope</td>
			<td>Abrio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease

骨格筋は、組織常駐筋幹細胞によって駆動される傷害後に再生する顕著な能力を有する。傷害後、筋肉幹細胞は活性化され、細胞増殖を受けて筋芽細胞のプールを生成し、その後分化して新しい筋線維を形成する。筋ジストロフィーや老化を含む多くの筋肉の消耗条件では、このプロセスは、再生する筋肉の障害をもたらす損なわれます。ゼブラフィッシュの筋肉再生のプロセスは、筋ジストロフィーなどの筋肉消耗状態で、筋幹細胞機能および再生を研究するための優れたシステムを提供する哺乳類系と高度に保存されています。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生を検討する方法を紹介する。最初のステップは、損傷を引き起こす前に幼虫の遺伝子型の決定を可能にするジェノタイピングプラットフォームの使用を含む。遺伝子型を決定した後、針刺しを用いて筋肉が傷つい、その後、偏光顕微鏡が筋肉再生の程度を決定するために使用される。したがって、我々は、筋肉疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉再生の検査を可能にする高スループットパイプラインを提供する。

骨格筋の複屈折を定量化する能力は、筋肉の損傷のレベルを調べて比較し、生体内の筋肉再生を調べるための非侵襲的だが再現性の高い方法を提供する。二屈折は、筋サルコメア15の擬似結晶配列を通る偏光の回折から生じ、筋肉への傷害または損傷に続いて、複屈折の減少が明らかである。同様に、幹細胞の活性化と分化は、傷害部位内に?...

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Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

このプロトコルの全体的な目標は、筋肉疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉再生を調べ、定量化することです。この方法は、費用対効果が高いだけでなく、in vivo設定で病気の筋肉の再生電位をスコアリングする上で非常に再現性の高い高スループットパイプラインを提供します。私と一緒に手順を実証することは、オーストラリア再生医学研究所の研究員であるアヴニカ・ルパレリアです。生きた胚のジェノタイピングでは、24室のDNA抽出チップの上面から透明な保護フィルムを剥離し、カットチップ付きの20マイクロリットルフィルターチップを使用して、13マイクロリットルの胚培地中の単一の麻酔付き胚をチップの各チャンバーに移します。すべての胚がロードされたら、1つの側を最初に配置し、続いてチップの残りの部分を置くことによって、ゼブラフィッシュ胚ジェノタイピングプラットフォームにチップを静かに取り付けます。磁気プラットフォームの蓋をチップの上に貼り付けて、DNA抽出プロトコル中に胚媒体の蒸発を防ぎ、蓋を閉じます。ベースユニットを2.4ボルト、0.051アンペア、0.12ワットに設定し、DNA抽出プロトコルを開始します。プラットフォームは、蓋を静かに触れることによって評価することができる振動を開始する必要があります。プログラムが実行されている間に、各ウェルに1ミリリットルの胚培地を加えて24ウェルプレートを準備し、各胚からのDNA材料の収集に使用される8ウェルストリップチューブにラベルを付けます。8分間の抽出の後、オン/オフボタンを押してプラットフォームの振動を止め、磁気蓋を静かに取り外し、チップをプラットフォームから持ち上げます。1つのチャンバーから10マイクロリットルの胚培地を8ウェルストリップチューブの適切な井戸に移し、すぐに2滴の新鮮な胚培地をチャンバーに加える。胚をチャンバーから、以前に調製した24ウェルプレートの適切なウェルに移します。すべての胚が移された時、プレートを28°Cのインキュベーターに入れる。8ウェルストリップチューブに集められた遺伝物質に対して適切な下流のジェノタイピングアッセイを実行し、各胚の遺伝子型を決定する。各胚の遺伝子型が同定されたら、25ミリリットルの中水を含む90ミリメートルのペトリ皿に胚を移し、筋肉が損傷するまで28°Cでプレートをインキュベートする。受精後4日で、ピペットを使用して1匹の麻酔幼虫を新しいペトリ皿に移し、解剖顕微鏡で余分な培地を皿から慎重に取り除きます。魚の向きを左に、尾が右にあり、背部領域が上にあり、腹側領域が下がるように、30ゲージ針を使用して、肛門の上の精液筋の1〜2つのスマイトに迅速に正確な刺し傷を行い、ミオセプタムに水平に向けます。負傷したゼブラフィッシュに胚培地の滴を塗布し、幼虫を井戸あたり1ミリリットルの新鮮な胚培地を含む24ウェルプレートの1つの井戸に慎重に移します。すべての幼虫が負傷した場合は、ゼブラフィッシュが画像化されるまで、プレートを28°Cのインキュベーターに入れる。筋肉の再生を定量化するには、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで 1 日の傷害後画像を開き、ポリゴン ツールを使用して創傷部位の周囲に図形を描画します。このソフトウェアを使用して領域を測定し、領域の複屈折強度を意味し、これらの値を提供されたテンプレートのセルD3およびE3にコピーします。1~2個のスマイトにまたがる2つの追加領域をそれぞれ描き、その領域を測定し、これらの領域のそれぞれの複屈折強度を意味する。これらの値をテンプレートのセル D4 と D5、E4 および E5 にコピーします。その後、損傷後3日間の画像で同じ領域の測定を繰り返します。複屈折が全ての画像で同様に測定された場合、各領域の平均複屈折強度をその領域で割って各領域の正規化複屈折を計算する。各時点について、2つの損傷のない領域の平均正規化複屈折を計算して、損傷していない筋肉の基準点を提供する。1日目の傷害後の筋肉損傷の程度を決定するために、傷害領域の正常化された複屈折を、損傷していない領域の平均正常化された複屈折で割る。筋肉再生の程度を決定するために、損傷後3日間の傷害領域の正規化複屈折を、この段階での損傷していない領域の平均正常化された強度で割る。最後に、3日目の術後の筋肉再生の程度の値を、1日目の傷害後の筋肉損傷の程度の値で割って回生指数を計算する。この代表的な分析では、2つのLama2ヘテロ接合ゼブラフィッシュの間の十字架からの胚のクラッチをDNA抽出チップに移し、その後遺伝子型化した。筋肉の傷害は、1日目の1日目の傷害後に複屈折強度の低下をもたらすが、筋肉の再生に成功すると、同じ領域内での複屈折の増加をもたらす。また、野生型の幼虫は正常な筋肉のパターニングに起因する均一な複屈折強度を示す一方で、Lama2ノックアウト幼虫の筋肉の複屈折強度は不均一であり、筋肉の完全性が低下する可能性が高い。観察されたように、野生型とLama2欠損幼虫の両方が、傷害後1日の1日に比べて傷害部位の複屈折強度が有意に増加したことを示し、筋肉が再生したことを示す。再生指数の決定は、Lama2欠損幼虫が野生型動物と比較して筋肉再生の顕著な増加を示すことを明らかにする。このプロトコルは、筋肉疾患のモデルで再生する筋肉の能力の変化を特定することができますが、下流の細胞および分子分析は、観察された変化の原因となるメカニズムを特定するために行う必要があります。この方法により、筋幹細胞機能の障害や関連ニッチ元素の障害が筋疾患の病態にいかに寄与しているかを特定することができ、新しい疾患メカニズムを同定することができました。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

筋肉疾患の構造的基礎を研究するためのツールとしての無傷のマウス骨格筋のX線回折

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...