Name: examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease
Uploaded: 2021-01-18T15:00:00
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Nos gustaría agradecer al Dr. Alex Fulcher y a Monash Micro Imaging por su ayuda con el mantenimiento y la configuración del microscopio. El Instituto Australiano de Medicina Regenerativa cuenta con el apoyo de subvenciones del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia. Este trabajo fue financiado por una subvención del proyecto de la Asociación de Distrofia Muscular (EE.UU.) a P.D.C (628882).

El mantenimiento del pez cebra se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos operativos estándar aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Monash bajo la licencia de colonia de cría ERM14481.
1. Determinación del genotipo de embriones vivos mediante una plataforma de genotipado embrionario.
<ol><li>Anestesiar 3 días después de la fertilización (dpf) embriones de pez cebra mediante la adición de metanosulfonato de tricaína a una concentración final de 0.016%...

<ol>
	<li>Egan, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+Metabolism+and+the+Molecular+Regulation+of+Skeletal+Muscle+Adaptation.">Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation.</a> Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Increases+with+Age+and+Inhibits+Skeletal+Muscle+Regeneration.">GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration.</a> Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscular+dystrophies.">The muscular dystrophies.</a> The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).</li><li>Emery, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Duchenne muscular dystrophy. , (1993).</li><li>Anne Helbling-Leclerc, P. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+division+of+clonal+muscle+stem+cells+coordinates+muscle+regeneration+in+vivo.">Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo.</a> Science. 353 (6295), (2016).</li><li>Lambert, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+rapid+cellular+extraction+from+live+zebrafish+embryos+and+larvae:+Development+and+application+to+genotyping.">An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping.</a> PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish.">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xirp+Proteins+Mark+Injured+Skeletal+Muscle+in+Zebrafish.">Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).</li><li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-inflicted+Injury+of+Zebrafish+Embryonic+Skeletal+Muscle.">Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).</li><li>Nguyen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Undergo+Extensive+Clonal+Drift+during+Tissue+Growth+via+Meox1-Mediated+Induction+of+G2+Cell-Cycle+Arrest.">Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).</li><li>Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+skeletal+muscle+growth+and+regeneration+in+amniotes+and+teleosts:+Emerging+themes.">Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).</li></ol>

La regeneración del músculo esquelético está impulsada por células madre musculares residentes en el tejido obligado, cuya función se altera en muchas enfermedades musculares como la distrofia muscular, impidiendo posteriormente el proceso de regeneración muscular. Aquí, describimos un protocolo de alto rendimiento para examinar la regeneración muscular en modelos vivos de pez cebra de enfermedad muscular. El primer paso de la tubería utiliza una plataforma de genotipado de embriones14,q...

El músculo esquelético representa el 30-50% de la masa corporal humana, y no solo es indispensable para la locomoción, sino que también sirve como un órgano metabólico y de almacenamiento crítico1. A pesar de ser postmitótico, el músculo esquelético es altamente dinámico y conserva una tremenda capacidad regenerativa después de una lesión. Esto se atribuye a la presencia de células madre residentes en tejidos (también llamadas células satélite), localizadas bajo la lámina basal de miofiberes y marcadas por los factores de transcripción pareados de proteína de caja 7 (pax7)y/o proteína de caja pareada 3 (pax3),entre otros2,3. Después de la lesión, la célula satélite se activa y sufre proliferación celular para generar un grupo de mioblastos, que posteriormente se diferencian para formar nuevas fibras musculares. La cascada altamente conservada de señales pro-regenerativas que regulan la activación de las células satélite y la reparación muscular robusta se ve afectada en diversas condiciones, como las miopatías y el envejecimiento homeostático4,5.
Uno de estos grupos diversos de miopatías es la distrofia muscular, caracterizada por desgaste muscular progresivo y degeneración6. Estas enfermedades son consecuencia de mutaciones genéticas en proteínas clave, entre ellas la distrofina y la laminina-α2 (LAMA2), responsables de la unión de las fibras musculares a la matriz extracelular7,8. Dado que las proteínas implicadas en la distrofia muscular juegan un papel tan central en el mantenimiento de la estructura muscular, durante muchos años se creyó que un fallo en este proceso era el mecanismo responsable de la patogénesis de la enfermedad9. Sin embargo, estudios recientes han identificado defectos en la regulación de las células madre musculares y el posterior deterioro en la regeneración muscular como segunda posible base para la patología muscular observada en la distrofia muscular10,11. Como tal, se necesitan más estudios para investigar cómo un deterioro en la función de las células madre musculares y los elementos de nicho asociados contribuyen a la distrofia muscular.
Durante la última década, el pez cebra(Danio rerio)se ha convertido en un importante modelo de vertebrados para el modelado de enfermedades12. Esto se atribuye al rápido desarrollo externo del embrión de pez cebra, junto con su claridad óptica, que permite la visualización directa de la formación muscular, el crecimiento y la función. Además, no solo el desarrollo y la estructura del músculo están altamente conservados en el pez cebra, sino que también muestran un proceso altamente conservado de regeneración muscular13. En consecuencia, el pez cebra representa un excelente sistema para estudiar la patobiología de las enfermedades musculares y explorar cómo se ve afectada la regeneración muscular en ella. Con este fin, hemos desarrollado un método que permite el estudio oportuno de la regeneración del músculo esquelético en modelos de pez cebra de enfermedad muscular. Esta tubería de alto rendimiento implica un método para genotipar embriones vivos14,después del cual se realiza una lesión por apuñalamiento con aguja y se toma una imagen del grado de regeneración muscular mediante microscopía de luz polarizante. Por lo tanto, la utilización de esta técnica revelará la capacidad regenerativa del músculo en modelos de enfermedad muscular de pez cebra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-3013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri Dishes</td>
			<td>Pacific Laboratory Products PT</td>
			<td>S9014S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction chips</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG chips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo genotyping platform</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG base unit</td>
			<td>Zebrafish Embryo Genotyper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plate dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Commonly referred to as FluoroDish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermoline Scientific</td>
			<td>TEI-43L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>PTP03-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing microscope</td>
			<td>Abrio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease

El músculo esquelético tiene una notable capacidad para regenerarse después de una lesión, que es impulsada por células madre musculares residentes en el tejido obligado. Después de la lesión, la célula madre muscular se activa y sufre proliferación celular para generar un grupo de mioblastos, que posteriormente se diferencian para formar nuevas fibras musculares. En muchas condiciones de desgaste muscular, incluida la distrofia muscular y el envejecimiento, este proceso se ve afectado, lo que resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. El proceso de regeneración muscular en el pez cebra está altamente conservado con sistemas de mamíferos que proporcionan un excelente sistema para estudiar la función y regeneración de las células madre musculares, en condiciones de desgaste muscular como la distrofia muscular. Aquí, presentamos un método para examinar la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular. El primer paso consiste en el uso de una plataforma de genotipado que permite la determinación del genotipo de las larvas antes de provocar una lesión. Una vez determinado el genotipo, el músculo se lesiona mediante una puñalada con aguja, tras la cual se utiliza la microscopía de luz polarizante para determinar el grado de regeneración muscular. Por lo tanto, proporcionamos una tubería de alto rendimiento que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

La capacidad de cuantificar la birrefringencia del músculo esquelético proporciona un método no invasivo pero altamente reproducible para examinar y comparar los niveles de daño muscular, y examinar la regeneración muscular in vivo. La birrefringencia resulta de la difracción de la luz polarizada a través de la matriz pseudocristalina de los sarcómeros musculares15, y después de una lesión o daño al músculo, es evidente una reducción en la bir...

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Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

El objetivo general de este protocolo es examinar y cuantificar la regeneración muscular en un modelo de pez cebra de enfermedad muscular. Este método proporciona una tubería de alto rendimiento que no solo es rentable, sino también altamente reproducible para calificar el potencial regenerativo de un músculo enfermo en un entorno in vivo. Demostrando el procedimiento conmigo estará Avnika Ruparelia, investigadora del Instituto Australiano de Medicina Regenerativa.Para el genotipado de embriones vivos, pele la película protectora transparente de la superficie superior de un chip de extracción de ADN de 24 cámaras y use una punta de filtro de 20 microlitros con una punta cortada para transferir un solo embrión anestesiado en 13 microlitros de medio embrionario a cada cámara del chip. Cuando todos los embriones hayan sido cargados, monte suavemente el chip en la plataforma de genotipado de embriones de pez cebra colocando un lado en primer lugar, seguido por el resto del chip. Coloque la tapa de la plataforma magnética sobre el chip para evitar la evaporación del medio embrionario durante el protocolo de extracción de ADN y cierre la tapa.Configure la unidad base a 2,4 voltios, 0,051 amperios y 0,12 vatios e inicie el protocolo de extracción de ADN. La plataforma debe comenzar a vibrar, lo que se puede evaluar tocando suavemente la tapa. Mientras se ejecuta el programa, prepare una placa de 24 pozos agregando un mililitro de medio embrionario a cada pozo y etiquete los tubos de tira de ocho pozos que se utilizarán para la recolección de material de ADN de cada embrión.Después de ocho minutos de extracción, presione el botón de encendido / apagado para detener la vibración de la plataforma, retire suavemente la tapa magnética y levante el chip de la plataforma. Transfiera 10 microlitros de medio embrionario de una cámara al pozo apropiado del tubo de tira de ocho pozos e inmediatamente agregue dos gotas de medio embrionario fresco a las cámaras. Transfiera el embrión de la cámara a un pozo apropiado de la placa de 24 pozos previamente preparada.Cuando todos los embriones hayan sido transferidos, coloque la placa en una incubadora de 28 grados centígrados. Realizar los ensayos de genotipado aguas abajo apropiados sobre el material genético recogido en los tubos de tira de ocho pozos para determinar el genotipo de cada embrión. Una vez identificado el genotipo de cada embrión, transferir los embriones a placas de Petri de 90 milímetros que contengan 25 mililitros de agua media e incubar las placas a 28 grados centígrados hasta la lesión muscular.A los cuatro días después de la fertilización, use una pipeta para transferir una larva anestesiada a una nueva placa de Petri y retire cuidadosamente cualquier exceso de medio de la placa bajo un microscopio de disección. Oriente el pez de tal manera que la cabeza esté a la izquierda, la cola esté a la derecha, la región dorsal esté hacia arriba y la región ventral hacia abajo, y use una aguja de calibre 30 para hacer una puñalada rápida y precisa en uno o dos somitas en el músculo epaxial por encima del poro anal y horizontal al mioseptum. Aplique una gota de medio embrionario al pez cebra lesionado y transfiera cuidadosamente la larva a un pozo de una placa de 24 pozos que contenga un mililitro de medio embrionario fresco por pozo.Cuando todas las larvas se hayan lesionado, coloque la placa en la incubadora de 28 grados Celsius hasta que se tome la imagen del pez cebra. Para cuantificar la regeneración muscular, abra una imagen de un día después de la lesión en un programa de software de análisis de imágenes apropiado y use la herramienta de polígono para dibujar una forma alrededor del sitio de la herida. Utilice el software para medir el área y la intensidad media de birrefringencia de la región y copie estos valores en las celdas D3 y E3 de la plantilla proporcionada.Dibuje dos regiones adicionales, cada una de las que abarque de uno a dos somitas ilesos y mida el área y las intensidades medias de birrefringencia de cada una de estas regiones. Copie estos valores en las celdas D4 y D5 y E4 y E5 de la plantilla. Luego repita la medición para las mismas regiones en la imagen de tres días después de la lesión.Cuando la birrefringencia se haya medido de la misma manera en todas las imágenes, calcule la birrefringencia normalizada para cada región dividiendo la intensidad media de birrefringencia de cada región por su área. Para cada punto de tiempo, calcule la birrefringencia normalizada promedio de las dos regiones no lesionadas para proporcionar un punto de referencia para el músculo no lesionado. Para determinar el alcance de la lesión muscular en el primer día después de la lesión, divida la birrefringencia normalizada de la región de la lesión por la birrefringencia normalizada promedio de las regiones no lesionadas.Para determinar el grado de regeneración muscular, divida la birrefringencia normalizada de la región de la lesión en la imagen de tres días posterior a la lesión por la intensidad normalizada promedio de las regiones no lesionadas en esta etapa. Finalmente, calcule el índice regenerativo dividiendo el valor de la extensión de la regeneración muscular en el tercer día después de la lesión por el valor de la extensión de la lesión muscular en el primer día después de la lesión. En este análisis representativo, una nidada de embriones de un cruce entre dos peces cebra heterocigotos Lama2 se transfirió a un chip de extracción de ADN y posteriormente se genotipó.Mientras que la lesión muscular resulta en una reducción en la intensidad de la birrefringencia en el primer día después de la lesión, la regeneración exitosa del músculo resulta en un aumento de la birrefringencia dentro de la misma región. También es digno de mención que mientras que las larvas de tipo silvestre muestran una intensidad de birrefringencia uniforme debido a un patrón muscular normal, la intensidad de birrefringencia en el músculo de las larvas knockout de Lama2 es desigual y altamente esporádica probablemente debido a una integridad muscular reducida. Como se observó, tanto las larvas de tipo silvestre como las deficientes en Lama2 demuestran un aumento significativo de la intensidad de birrefringencia en el sitio de la herida a los tres días posteriores a la lesión en comparación con un día después de la lesión, lo que indica que el músculo se ha regenerado.La determinación del índice regenerativo revela que las larvas deficientes en Lama2 muestran un aumento sorprendente en la regeneración muscular en comparación con los animales de tipo salvaje. Si bien este protocolo nos permitirá identificar cualquier alteración en la capacidad del músculo para regenerarse en modelos de enfermedad muscular, es necesario realizar análisis celulares y moleculares aguas abajo para identificar los mecanismos que son responsables de los cambios observados. Este método nos ha permitido identificar cómo la función deteriorada de las células madre musculares y un deterioro en los elementos de nicho asociados contribuyen a la patogénesis de la enfermedad muscular, lo que nos permite identificar nuevos mecanismos de enfermedad.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...