Name: examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease
Uploaded: 2021-01-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease at JoVE.com

Dr. Alex Fulcher'a ve Monash Micro Imaging'e mikroskop bakımı ve kurulumu konusunda yardımları için teşekkür ederiz. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Victoria Eyalet Hükümeti ve Avustralya Hükümeti'nin hibeleriyle desteklenmektedir. Bu çalışma, P.D.'ye (628882) bir Musküler Distrofi Derneği (ABD) projesi hibesi ile finanse .C.

Zebra balığı bakımı, Monash Üniversitesi Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanan standart işletme prosedürlerine göre, üreme kolonisi lisansı ERM14481 kapsamında gerçekleştirildi.
1. Embriyo genotip platformu kullanılarak canlı embriyoların genotipinin belirlenmesi.
<ol><li>Embriyo ortamında (5 mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO4) embriyo ortamında %0.016 (v/v) nihai konsantrasyona trikain metansülfonat ekleyerek döllenme sonrası3</s...

<ol>
	<li>Egan, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+Metabolism+and+the+Molecular+Regulation+of+Skeletal+Muscle+Adaptation.">Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation.</a> Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pax3/Pax7-dependent+population+of+skeletal+muscle+progenitor+cells.">A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells.</a> Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).</li><li>Sousa-Victor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geriatric+muscle+stem+cells+switch+reversible+quiescence+into+senescence.">Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence.</a> Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).</li><li>Egerman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Increases+with+Age+and+Inhibits+Skeletal+Muscle+Regeneration.">GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration.</a> Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscular+dystrophies.">The muscular dystrophies.</a> The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).</li><li>Emery, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Duchenne muscular dystrophy. , (1993).</li><li>Anne Helbling-Leclerc, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+laminin+&#945;2-chain+gene+(LAMA2)+cause+merosin-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">Mutations in the laminin &#945;2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).</li><li>Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+muscular+dystrophies:+loss+of+cytoskeleton-extracellular+matrix+linkage.">Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage.</a> Cell. 80 (5), 675-679 (1995).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient,+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles.">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134 (1), 37-47 (2008).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Gurevich, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+division+of+clonal+muscle+stem+cells+coordinates+muscle+regeneration+in+vivo.">Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo.</a> Science. 353 (6295), (2016).</li><li>Lambert, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+rapid+cellular+extraction+from+live+zebrafish+embryos+and+larvae:+Development+and+application+to+genotyping.">An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping.</a> PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish.">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xirp+Proteins+Mark+Injured+Skeletal+Muscle+in+Zebrafish.">Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).</li><li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-inflicted+Injury+of+Zebrafish+Embryonic+Skeletal+Muscle.">Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).</li><li>Nguyen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Undergo+Extensive+Clonal+Drift+during+Tissue+Growth+via+Meox1-Mediated+Induction+of+G2+Cell-Cycle+Arrest.">Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).</li><li>Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+skeletal+muscle+growth+and+regeneration+in+amniotes+and+teleosts:+Emerging+themes.">Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).</li></ol>

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında işlevi değiştirilen ve daha sonra kas yenilenme sürecini engelleyen zorunlu doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir. Burada, kas hastalığının canlı zebra balığı modellerinde kas yenilenmesini incelemek için yüksek verim protokolünü açıklıyoruz. Boru hattının ilk adımı, aşağı akış rejenerasyon testini gerçekleştirmeden önce, canlı larvaların genotipini belirlemek için kullanıcı dostu ve do?...

İskelet kası insan vücut kütlesinin% 30-50'sini oluşturur ve sadece hareketlilik için vazgeçilmez değildir, aynı zamanda kritik bir metabolik ve depolama organı olarak da hizmet eder1. Postmitotik olmasına rağmen, iskelet kası son derece dinamiktir ve yaralanmadan sonra muazzam bir rejeneratif kapasiteye sahip olur. Bu, miyofiberlerin bazal laminası altında bulunan ve transkripsiyon faktörleri ile işaretlenmiş kutu protein 7 ( pax7 ) ve / veya eşleştirilmiş kutu protein 3( pax3 ) ile işaretlenmiş doku yerleşik kök hücrelerin (uydu hücreleri olarak da adlandırılır) varlığınaatfedilir. Yaralanmadan sonra, uydu hücresi aktive edilir ve daha sonra yeni kas lifleri oluşturmak için farklılaşılan bir mioblast havuzu oluşturmak için hücre çoğalmasından geçer. Uydu hücresi aktivasyonunu ve sağlam kas onarımını düzenleyen pro-rejeneratif sinyallerin yüksek oranda korunmuş kaskadı miyopatiler ve homeostatik yaşlanma4,5gibi çeşitli durumlarda etkilenir.
Bu kadar çeşitli miyopatilerden biri, ilerleyici kas israfı ve dejenerasyon ile karakterize kas distrofisidir6. Bu hastalıklar, kas liflerinin hücre dışı matris7,8'ebağlanmasından sorumlu olan distrofin ve laminin-α2 (LAMA2) dahil olmak üzere anahtar proteinlerdeki genetik mutasyonların sonucudur. Kas distrofisine karışan proteinlerin kas yapısının korunmasında bu kadar merkezi bir rol oynadığı göz önüne alındığında, uzun yıllar boyunca bu süreçteki bir başarısızlığın hastalık patogenezden sorumlu mekanizma olduğuna inanılıyordu9. Bununla birlikte, son çalışmalar kas kök hücrelerinin düzenlenmesinde kusurlar ve kas yenilenmesinde daha sonra bozulmayı kas distrofisinde gözlenen kas patolojisinin ikinci olası temeli olarak tanımlamıştır10,11. Bu nedenle, kas kök hücre fonksiyonundaki ve ilişkili niş elemanlardaki bir bozukluğun kas distrofisine nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Son on yılda, zebra balığı (Danio rerio) hastalık modellemesi için önemli bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmıştır12. Bu, zebra balığı embriyosunun hızlı dış gelişimine, kas oluşumunun, büyümesinin ve işlevinin doğrudan görselleştirilmesine izin veren optik netliği ile birleştiğinde atfedilir. Ek olarak, sadece zebra balıklarında yüksek oranda korunan kas gelişimi ve yapısı değil, aynı zamanda yüksek oranda korunmuş bir kas rejenerasyon sürecigösterirler 13. Sonuç olarak, zebra balığı kas hastalıklarının patobiyolojisini incelemek ve kas yenilenmesinin içinde nasıl etkilendiğini keşfetmek için mükemmel bir sistemi temsil eder. Bu amaçla, kas hastalığının zebra balığı modellerinde iskelet kas rejenerasyonunun zamanında incelenmesini sağlayan bir yöntem geliştirdik. Bu yüksek verim boru hattı genotip canlı embriyolar için bir yöntem içerir14, ardından bir iğne-bıçak yaralanması gerçekleştirilir ve kas rejenerasyonunun boyutu polarize ışık mikroskopisi kullanılarak görüntülenmiştir. Bu nedenle bu tekniğin kullanımı, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kasın rejeneratif kapasitesini ortaya getirecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-3013R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri Dishes</td>
			<td>Pacific Laboratory Products PT</td>
			<td>S9014S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction chips</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG chips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo genotyping platform</td>
			<td>wFluidx</td>
			<td>ZEG base unit</td>
			<td>Zebrafish Embryo Genotyper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plate dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Commonly referred to as FluoroDish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermoline Scientific</td>
			<td>TEI-43L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>PTP03-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing microscope</td>
			<td>Abrio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease

İskelet kası, zorunlu doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilen yaralanmadan sonra yenilenme konusunda dikkat çekici bir yete sahiptir. Yaralanmadan sonra, kas kök hücresi aktive edilir ve daha sonra yeni kas lifleri oluşturmak için farklılaşarak bir mioblast havuzu oluşturmak için hücre çoğalmasından geçer. Kas distrofisi ve yaşlanma da dahil olmak üzere birçok kas israfı koşulunda, bu işlem bozulur ve bu da kasın yenilenememesine neden olur. Zebra balıklarında kas yenilenme süreci, kas distrofisi gibi kas israfı koşullarında kas kök hücre fonksiyonunu ve yenilenmeyi incelemek için mükemmel bir sistem sağlayan memeli sistemleri ile yüksek oranda korunur. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesini incelemek için bir yöntem sunuyoruz. İlk adım, bir yaralanma ortaya çıkmadan önce larvaların genotipinin belirlenmesine izin veren bir genotipleme platformunun kullanılmasını içerir. Genotip belirlendikten sonra, kas bir iğne bıçağı kullanılarak kas yaralanır, ardından kas yenilenmesinin boyutunu belirlemek için polarize edici ışık mikroskopisi kullanılır. Bu nedenle, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan yüksek verimli bir boru hattı sağlıyoruz.

İskelet kasının birefringence'ını ölçme yeteneği, kas hasarı seviyelerini incelemek ve karşılaştırmak ve kas yenilenmesini in vivoolarak incelemek için invaziv olmayan ancak oldukça tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Birefringence, polarize ışığın kas sarkoerlerinin sözde kristal dizisi15aracılığıyla kırınımından kaynaklanır ve kastaki yaralanma veya hasarı takiben, birefringence'da bir azalma belirgindir. Aynı şekilde, k...

Watch this Scientific Journal Video about Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease at JoVE.com

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Bu protokolün genel amacı, bir zebra balığı kas hastalığı modelinde kas yenilenmesini incelemek ve ölçmektir. Bu yöntem, sadece uygun maliyetli değil, aynı zamanda in vivo bir ortamda hastalıklı bir kasın rejeneratif potansiyelini puanlamada da yüksek oranda tekrarlanabilir yüksek verimli bir işlem hattı sağlar. Prosedürü benimle birlikte gösteren Avnika Ruparelia, Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü'nde araştırma görevlisi.Canlı embriyo genotipleme için, 24 odalı bir DNA ekstraksiyon çipinin üst yüzeyinden net koruyucu filmi soyun ve 13 mikrolitre embriyo ortamındaki tek bir uyuşturulmuş embriyoyu çipin her odasına aktarmak için kesik uçlu 20 mikrolitre filtre ucu kullanın. Tüm embriyolar yüklendiğinde, bir tarafı ilk sıraya, ardından çipin geri kalanını yerleştirerek çipi zebra balığı embriyo genotipleme platformuna hafifçe monte edin. DNA ekstraksiyon protokolü sırasında embriyo ortamının buharlaşmasını önlemek için manyetik platform kapağını çipin üzerine yapıştırın ve kapağı kapatın.Taban birimini 2,4 volt, 0,051 amper ve 0,12 watt olarak ayarlayın ve DNA çıkarma protokolünü başlatın. Platform titreşime başlamalıdır, bu da kapağı hafifçe dokunarak değerlendirilebilir. Program çalışırken, her kuyuya bir mililitre embriyo ortamı ekleyerek 24 kuyulu bir plaka hazırlayın ve her embriyodan DNA materyalinin toplanmasında kullanılacak sekiz kuyulu şerit tüpleri etiketleyin.Sekiz dakikalık ekstraksiyondan sonra, platformun titreşimini durdurmak için açma/kapa düğmesine basın, manyetik kapağı hafifçe çıkarın ve çipi platformdan kaldırın. Bir odadan 10 mikrolitre embriyo ortamını sekiz kuyulu şerit tüpün uygun kuyusuna aktarın ve hemen odalara iki damla taze embriyo ortamı ekleyin. Embriyoyu odadan daha önce hazırlanmış 24 kuyu plakasının uygun bir kuyusuna aktarın.Tüm embriyolar transfer edildiğinde, plakayı 28 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Her embriyonun genotipini belirlemek için sekiz kuyulu şerit tüplerde toplanan genetik materyal üzerinde uygun aşağı akış genotipleme testlerini gerçekleştirin. Her embriyonun genotipi belirlendikten sonra, embriyoları 25 mililitre orta su içeren 90 milimetre Petri kabına aktarın ve kas yaralanmasına kadar plakaları 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Döllenmeden dört gün sonra, uyuşturulduktan sonra bir larvayı yeni bir Petri kabına aktarmak için bir pipet kullanın ve fazla ortamları diseksiyon mikroskobu altında tabaktan dikkatlice çıkarın. Balığı başın solda, kuyruğun sağda, sırt bölgesinin yukarısında ve ventral bölgenin aşağısında olacak şekilde yönlendirin ve anal gözenek üzerindeki apolikal kasta bir ila iki somit içine hızlı bir kesin bıçak yapmak ve mioseptuma yatay yapmak için 30 kalibrelik bir iğne kullanın. Yaralı zebra balığına bir damla embriyo ortamı uygulayın ve larvayı kuyu başına bir mililitre taze embriyo ortamı içeren 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna dikkatlice aktarın.Tüm larvalar yaralandığında, zebra balığı görüntülenene kadar plakayı 28 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Kas yenilenmesini ölçmek için, uygun bir görüntü analizi yazılım programında bir günlük yaralanma sonrası görüntü açın ve yara bölgesinin etrafına bir şekil çizmek için çokgen aracını kullanın. Alanı ölçmek ve bölgenin birefringence yoğunluğu anlamına gelmek ve bu değerleri sağlanan şablonun D3 ve E3 hücrelerine kopyalamak için yazılımı kullanın.Her biri bir ila iki yaralanmamış somite yayılan iki ek bölge çizin ve alanı ölçün ve bu bölgelerin her birinin birefringence yoğunlukları anlamına gelir. Bu değerleri şablondaki D4 ve D5 ile E4 ve E5 hücrelerine kopyalayın. Ardından, yaralanma sonrası üç gün görüntüsünde aynı bölgeler için ölçümü tekrarlayın.Birefringence tüm görüntülerde aynı şekilde ölçüldüğünde, her bölgenin ortalama birefringence yoğunluğunu alanına bölerek her bölge için normalleştirilmiş birefringence'ı hesaplayın. Her zaman noktası için, yaralanmamış kas için bir referans noktası sağlamak için iki yaralanmamış bölgenin ortalama normalleştirilmiş birefringence'ını hesaplayın. Yaralanma sonrası ilk günde kas yaralanmasının boyutunu belirlemek için, yaralanma bölgesinin normalleştirilmiş birefringansını yaralanmamış bölgelerin ortalama normalleştirilmiş birefringence'ına bölün.Kas yenilenmesinin boyutunu belirlemek için, yaralanma sonrası üç gün içinde yaralanma bölgesinin normalleştirilmiş birefringence'ını, bu aşamada yaralanmamış bölgelerin ortalama normalleştirilmiş yoğunluğuna bölün. Son olarak, rejeneratif indeksi, yaralanma sonrası üçüncü günde kas yenilenmesinin değerini, yaralanma sonrası ilk gün kas yaralanmasının değerine bölerek hesaplayın. Bu temsili analizde, iki Lama2 heterozipöz zebra balığı arasındaki bir haçtan embriyo debriyajı DNA ekstraksiyon çipine aktarıldı ve daha sonra genotiplendi.Kas yaralanması, yaralanma sonrası ilk günde birefringence yoğunluğunda azalma ile sonuçlanırken, kasların başarılı bir şekilde yenilenmesi aynı bölgede birefringence artmasına neden olur. Ayrıca, vahşi tip larvaların normal bir kas deseni nedeniyle tek tip bir birefringence yoğunluğu göstermesine dikkat edilirken, Lama2 nakavt larvalarının kaslarındaki birefringence yoğunluğunun düzensiz ve kas bütünlüğünün azalması nedeniyle oldukça sporadik olması da dikkat çekicidir. Gözlemlendiği gibi, hem vahşi tip hem de Lama2 eksikliği olan larvalar, yaralanma sonrası üç günde, yaralanma sonrası bir günde kasın yenilendiğini gösteren önemli ölçüde artmış bir birefringence yoğunluğu göstermektedir.Rejeneratif indeksin belirlenmesi, Lama2 eksikliği olan larvaların vahşi tip hayvanlara kıyasla kas yenilenmesinde çarpıcı bir artış sergilediğini ortaya koymaktadır. Bu protokol, kas hastalığı modellerinde kasların yenilenme yeteneğindeki değişiklikleri tanımlamamıza izin verirken, gözlenen değişikliklerden sorumlu mekanizmaları tanımlamak için aşağı akış hücresel ve moleküler analiz yapılması gerekir. Bu yöntem, kas kök hücre fonksiyonlarının bozulmasının ve ilişkili niş elementlerdeki bir bozukluğun kas hastalığı patogenezine nasıl katkıda bulunduğunu belirlememizi sağlamıştır, bu nedenle yeni hastalık mekanizmalarını tanımlamamıza izin verir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Contractile fare faaliyet kaynaklı kas iskelet fenotipik uyarlamalar çalışmaya kronik stimulasyon uygulanması

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Kas hastalığının yapısal temelini Incelemek için bir araç olarak bozulmamış Murine Iskelet kasının X-ışını kırması

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...