Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

وتعترف L.Y.T.C بالدعم السخي المقدم من صندوق الحدود الجديدة لاستكشاف البحوث (NFRF-E)، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC) منحة ديسكفري، ومبادرة الطب حسب التصميم في جامعة تورنتو، التي تتلقى التمويل من صندوق كندا للتميز البحثي الأول (CFREF).

1. إعداد المخزن المؤقت
ملاحظة: يمكن أن يحدث إعداد العازلة تنقية البروتين في أي يوم; هنا، تم القيام به قبل بدء التجارب.
<ol><li>إعداد تحلل / توازن العازلة التي تحتوي على 50 mM تريس (هيدروكسي ميثيل)أمينوميثان (تريس)، 300 mM كلوريد الصوديوم (NaCl)، 5٪ الجلسرين، و 5 مليون β ميركابتوثانول (BME)، P...

<ol>
	<li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks.">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li><li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li><li>Chen, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA.">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li><li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+gene+networks.">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li><li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing:+advances+and+prospects.">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li><li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes.">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li><li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer.">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li><li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Mart&#237;nez-P&#233;rez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing:+A+multiobjective+evolutionary+approach.">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li><li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands:+enhanced+models,+scalability,+and+speed.">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li><li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+costs:+Data.">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li><li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics.">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA.">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li><li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage.">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).</li><li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DNA+to+power+nanostructures.">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li><li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA.">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li><li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems.">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li><li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement.">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).</li><li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -. B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handhold-mediated+strand+displacement:+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions.">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li><li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors.">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li><li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles.">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).</li><li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits.">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li><li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.8+&#197;+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11.">2.8 &#197; crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. 301 (1), 117-128 (2000).</li><li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors.">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li><li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis.">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li><li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors.">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li><li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+elongation,+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase.">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li><li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li><li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortase-tag+expressed+protein+ligation:+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step.">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li><li>Zhang, W. -. B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li></ol>

توضح هذه الدراسة نهجا مستوحى من تكنولوجيا النانو من الحمض النووي للسيطرة على نشاط T7 RNA polymerase من خلال اقتران مركب T7 RNAP المؤتلف N-terminally SNAP الموسومة ب Oligonucleotide الذي يعمل في BG ، والذي تم استخدامه لاحقا لبرنامج ردود فعل TMDSD. حسب التصميم ، تم وضع علامة SNAP في N-terminus من البوليميراز ، حيث يتم دفن C-terminus م...

تستخدم حوسبة الحمض النووي مجموعة من أوليغونوكليوتيدات مصممة كوسيلة للحساب. تتم برمجة هذه oligonucleotides مع تسلسل لتجميع ديناميكي وفقا للمنطق المحدد من قبل المستخدم والاستجابة لمدخلات الحمض النووي محددة. في دراسات إثبات المفهوم ، يتكون ناتج الحساب عادة من مجموعة من أوليغونوكليوتيدات الفلورسنت التي يمكن اكتشافها عن طريق الكهروضوئيات الهلامية أو قارئات لوحات الفلورسينس. على مدى السنوات ال 30 الماضية ، وقد ثبت الدوائر الحسابية الحمض النووي معقدة على نحو متزايد ، مثل مختلف الشلالات المنطق الرقمي ، وشبكات التفاعل الكيميائي ، والشبكات العصبية1،2،3. للمساعدة في إعداد هذه الدوائر الحمض النووي، وقد استخدمت نماذج رياضية للتنبؤ وظائف الدوائر الجينية الاصطناعية4،5، وقد وضعت أدوات حسابية لتصميم تسلسل الحمض النووي متعامدة6،7،8،9،10 . بالمقارنة مع أجهزة الكمبيوتر القائمة على السيليكون ، وتشمل مزايا أجهزة الكمبيوتر الحمض النووي قدرتها على التفاعل مباشرة مع الجزيئات الحيوية ، وتعمل في حل في غياب إمدادات الطاقة ، فضلا عن إحكام واستقرارها العام. مع ظهور تسلسل الجيل القادم ، كانت تكلفة تصنيع أجهزة الكمبيوتر الحمض النووي في انخفاض على مدى العقدين الماضيين بمعدل أسرع من قانون مور11. تطبيقات هذه الحواسيب المستندة إلى الحمض النووي بدأت تظهر الآن ، مثل لتشخيص المرض12،13، لتشغيل الفيزياء الحيوية الجزيئية14، وكمنصات لتخزين البيانات15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> الشكل 1:آلية إزاحة حبلا الحمض النووي بوساطة موطئ القدم. موطئ القدم، δ، هو تسلسل حر وغير منضم على مزدوجة جزئية. عندما يتم تقديم مجال تكميلي (δ*) على حبلا ثان ، يعمل نطاق δ الحر كمسند إصبع قدم للتهجين ، مما يسمح لبقية الخيط (Ο*) بإزاحة منافسه ببطء من خلال رد فعل قابل للعكس مضغوط / فك الضغط يعرف باسم هجرة حبلا. مع زيادة طول δ، ينخفض ΔG لرد الفعل الأمامي، ويحدث الإزاحة بسهولة أكبر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
حتى الآن ، فإن غالبية أجهزة الكمبيوتر الحمض النووي استخدام عزر راسخة في مجال تكنولوجيا النانو الحمض النووي الديناميكي المعروف باسم التشريد حبلا الحمض النووي بوساطة موطئ القدم (TMDSD ، الشكل 1)16. يتكون هذا الشعار من ثنائية جزئيا تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) المزدوج المزدوج عرض قصيرة "موطئ قدم" يتدلى (أي 7- إلى 10 النيوكليوتيدات (NT)). يمكن أن تتفاعل خيوط "الإدخال" من الحمض النووي مع الدوبلين الجزئي من خلال موطئ القدم. يؤدي هذا إلى إزاحة أحد الخيوط من الدوبلين الجزئي، ويمكن أن يكون هذا الخيط المحرر بمثابة مدخل للدوبلين الجزئيين في المصب. وهكذا، TMDSD تمكن تتالي الإشارات ومعالجة المعلومات. من حيث المبدأ ، يمكن أن تعمل زخارف TMDSD المتعامدة بشكل مستقل في الحل ، مما يتيح معالجة المعلومات الموازية. كان هناك عدد من الاختلافات على رد فعل TMDSD، مثل تبادل حبلا الحمض النووي بوساطة موطئ القدم (TMDSE)17، "تسرب" موطئ قدم مع نطاقات مزدوجة طويلة18،أضواء غير متطابقة تسلسل19،و "اليد" بوساطة حبلاالنزوح 20. تسمح مبادئ التصميم المبتكرة هذه بمزيد من حيوية وديناميكيات TMDSD المضبوطة بدقة لتحسين أداء حوسبة الحمض النووي.
الدوائر الجينية الاصطناعية، مثل الدوائر الجينية النسخية، هي أيضا قادرة على حساب21،22،23. يتم تنظيم هذه الدوائر من خلال عوامل نسخ البروتين ، والتي تنشط أو تقمع نسخ الجين عن طريق الربط بعناصر الحمض النووي التنظيمية المحددة. بالمقارنة مع الدوائر المستندة إلى الحمض النووي ، فإن الدوائر النسخية لها العديد من المزايا. أولا، النسخ الأنزيمي له معدل دوران أعلى بكثير من دوائر الحمض النووي الحفازة الحالية، وبالتالي توليد نسخ أكثر من الإخراج لكل نسخة واحدة من المدخلات وتوفير وسيلة أكثر كفاءة لتضخيم الإشارات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تنتج الدوائر النسخية جزيئات وظيفية مختلفة ، مثل aptamers أو ترميز الحمض النووي الريبي messenger (mRNA) للبروتينات العلاجية ، كخرجات حساب ، والتي يمكن استغلالها لتطبيقات مختلفة. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية للدوائر النسخية الحالية هو عدم قابليتها للتوسع. وذلك لأن هناك مجموعة محدودة جدا من عوامل النسخ القائمة على البروتين المتعامدة، وتصميم دي نوفو من عوامل نسخ البروتين الجديدة لا تزال صعبة من الناحية الفنية وتستغرق وقتا طويلا.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> الشكل 2: التجريد وآلية "الحبل" و "قفص" مجمع البوليميراز. (A و B) يتم وضع علامة على حبل أوليغونوكليوتيد أنزيميا إلى بوليمراز T7 من خلال رد فعل SNAP-tag. قفص يتكون من "فو" T7 المروج مع تراكم حبل تكملة يسمح لها التهجين إلى الحبل ومنع النشاط النسخي. (ج) عندما يكون المشغل(أ * ب *) موجودا ، فإنه يرتبط بمؤشر القدم على حبل oligonucleotide(ab)ويشرد منطقة b * من القفص ، مما يسمح بالنص. تم تعديل هذا الرقم من تشو وشيه27. الاختصارات: RNAP = RNA بوليمراز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تقدم هذه الورقة لبنة جديدة للحوسبة الجزيئية تجمع بين وظائف الدوائر النسخية وقابلية التوسع في الدوائر القائمة على الحمض النووي. هذه الكتلة البناء هو T7 RNAP المرفقة بشكل مشترك مع حبل الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل (الشكل 2A). لتجميع هذا الحمض النووي المربوطة T7 RNAP، تم دمج البوليميراز إلى N-محطة SNAP-tag24 وأعرب عنه بشكل مركب في الإشريكية القولونية. ثم تفاعلت علامة SNAP مع أوليغونوكليوتيد وظيفية مع ركيزة BG. يسمح حبل أوليغونوكليوتيد بوضع الضيوف الجزيئيين على مقربة من البوليميراز عن طريق تهجين الحمض النووي. وكان أحد هؤلاء الضيوف مانع النسخ التنافسية المشار إليها باسم "قفص"، الذي يتكون من "فو" T7 المروج الحمض النووي المزدوج مع عدم وجود جين المصب(الشكل 2B). عندما ملزمة RNAP عبر الحبل oligonucleotide لها، القفص الأكشاك نشاط البوليميراز عن طريق المنافسة قوالب الحمض النووي الأخرى لربط RNAP، مما يجعل RNAP في حالة "إيقاف" (الشكل 2C).
لتنشيط البوليميراز إلى حالة "ON" ، تم تصميم قوالب الحمض النووي T7 مع نطاقات "المشغل" الوحيدة التي تقطعت بها السبل في المنبع لمروج T7 للجين. يمكن تصميم مجال المشغل (أي المجال أ * ب * الشكل 2C)لإزاحة القفص من RNAP عبر TMDSD ووضع RNAP في مكان قريب من مروج T7 للجين ، وبالتالي بدء النسخ. وبدلا من ذلك، صممت قوالب الحمض النووي أيضا حيث كان تسلسل المشغل مكملا لخيوط الحمض النووي المساعدة التي يشار إليها باسم "عوامل النسخ الاصطناعي" (أي فروع TFA و TFB في الشكل 3A). عندما يتم إدخال كلا الخيوط في رد الفعل ، فإنها سوف تتجمع في موقع المشغل ، وخلق مجال جديد شبه متجاورة أ * ب *. يمكن لهذا المجال ثم إزاحة القفص عبر TMDSD لبدء النسخ(الشكل 3B). ويمكن توفير هذه الخيوط إما بشكل خارجي أو إنتاجها.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> الشكل 3:البرمجة الانتقائية لنشاط البوليميراز من خلال منشط تبديل مكون من ثلاثة مكونات. (أ)عندما تكون عوامل النسخ (TFA و TFB)موجودة ، فإنها ترتبط بمجال المشغل في المنبع للمروج ، مما يشكل تسلسلا زائفا تقطعت به السبل(a *b *) قادرا على إزاحة القفص من خلال إزاحة الحمض النووي بوساطة موطئ القدم. (ب) هذا النطاق * ب * يمكن أن تحل محل القفص عبر TMDSD لبدء النسخ. تم تعديل هذا الرقم من تشو وشيه27. المختصرات: TF = عامل النسخ؛ RNAP = RNA بوليمراز; TMDSD = إزاحة حبلا الحمض النووي بوساطة موطئ القدم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
استخدام عوامل النسخ المستندة إلى الحمض النووي لتنظيم النسخ في المختبر يسمح للتنفيذ القابل للتطوير لسلوكيات الدوائر المتطورة مثل المنطق الرقمي ، وردود الفعل ، وتتالي الإشارات. على سبيل المثال، يمكن للمرء بناء سلاسل بوابة المنطق عن طريق تصميم تسلسل الحمض النووي بحيث النصوص من الجينات المنبع تنشيط الجينات المصب. أحد التطبيقات التي تستغل المتتالية والمتعددة التي يمكن أن تكون قادرة على هذه التكنولوجيا المقترحة هو تطوير دوائر الحوسبة الجزيئية أكثر تطورا للتشخيص المحمول ومعالجة البيانات الجزيئية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج الحوسبة الجزيئية وقدرات التوليف الحمض النووي الريبي دي نوفو تمكين تطبيقات جديدة. على سبيل المثال، يمكن تصميم الدائرة الجزيئية للكشف عن واحد أو مزيج من الرنانات المعرفة من قبل المستخدم كمدخلات وإخراج الرنانات العلاجية أو mRNAs ترميز الببتيدات الوظيفية أو البروتينات للتطبيقات الطبية نقطة الرعاية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

تكنولوجيا النانو الحمض النووي تمكن البرمجة الذاتي التجميع من الأحماض النووية في الأشكال التي يحددها المستخدم وديناميات لتطبيقات متنوعة. هذا العمل يدل على أن المفاهيم من تكنولوجيا النانو الحمض النووي يمكن استخدامها لبرنامج النشاط الأنزيمي من البوليميراز T7 الحمض النووي الريبي المستمدة من phage (RNAP) وبناء شبكات تنظيمية الجينات الاصطناعية قابلة للتطوير. أولا، تم تصميم RNAP T7 المربوطة oligonucleotide عن طريق التعبير عن RNAP N-TERMINALLY SNAP الموسومة والربط الكيميائي اللاحق للSNAP-tag مع oligonucleotide المعدلة بنزيلجوانين (BG). بعد ذلك ، يتم استخدام إزاحة حبلا الحمض النووي لبرنامج نسخ البوليميراز عند الطلب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تجميعات الحمض النووي المساعدة ك "عوامل نسخ اصطناعية" لتنظيم التفاعلات بين T7 RNAP المبرمجة بالحمض النووي مع قوالب الحمض النووي الخاصة به. يمكن لهذه الآلية التنظيمية للنسخ في المختبر تنفيذ مجموعة متنوعة من سلوكيات الدوائر مثل المنطق الرقمي ، وردود الفعل ، المتتالية ، والتعدد. تسهل قابلية إنشاء هذه البنية التنظيمية الجينية تجريد التصميم والتوحيد القياسي والتحجيم. وستمكن هذه الميزات من النماذج الأولية السريعة للأجهزة الوراثية المختبرية لتطبيقات مثل الاستشعار البيولوجي، والكشف عن الأمراض، وتخزين البيانات.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> الشكل 5: تحليل SDS-PAGE لتعبير SNAP T7 RNAP ومقايسة النسخ في المختبر. (A) SNAP T7 RNAP تحليل تنقية البروتين، SNAP T7 RNAP الوزن الجزيئي: 119.4kDa. FT = التدفق من خلال العمود، W1 = كسور elution من المخزن المؤقت غسل تحتوي على ال...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

نحن نصف هندسة رواية الحمض النووي المربوطة T7 الحمض النووي الحمض النووي RNA بوليمرات لتنظيم ردود الفعل في المختبر النسخ. نناقش خطوات تخليق البروتين وتوصيفه، والتحقق من صحة تنظيم النسخ لإثبات المفهوم، ومناقشة تطبيقاته في الحوسبة الجزيئية، والتشخيص، ومعالجة المعلومات الجزيئية.

الحمض النووي المربوطة الحمض النووي RNA بوليمراز للبرمجة في النسخ المختبري والحوسبة الجزيئية

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

نقترح طريقة لتنظيم نشاط البوليميراز باستخدام عوامل نسخ الحمض النووي الاصطناعي. يمكن أن تكون هذه البنية التنظيمية الجينية بمثابة لبنة لبناء الأجهزة الوراثية المختبرية في المستقبل. من خلال ربط مجال ربط الحمض النووي إلى بوليمرات T7 RNA ، تجمع هذه التقنية بين قابلية التوسع في الدوائر المستندة إلى الحمض النووي ، مع وظيفة الدوائر النسخية.ابدأ بإجراء تسعة تمييعات من أوليغونوكليوتيد BG أحادية التقطعت إلى حجم نهائي من 50 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج ، من خمس إلى واحد إلى واحد إلى خمس نسب ، كما هو مبين في الجدول. إعداد خليط رد فعل واحد لكل تخفيف عن طريق خلط اثنين من microliters من العازلة SNAP مع أربعة ميكرولترات من أوليغونوكليوتيد BG، وأربعة ميكرولترات من SNAP T7 RNAP. إعداد التحكم RNAP عن طريق استبدال oligonucleotide مع الماء المقطر مزدوجة، والسيطرة على الحمض النووي عن طريق استبدال سناب T7 RNAP مع الماء المقطر مزدوجة.إعداد 11 ردود الفعل عن طريق إضافة اثنين من microliters من كل عينة إلى أربعة ميكرولترات من العازلة SNAP، واثنين من microliters من البروتين تحميل صبغة لكل عينة. سخني التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية، قبل تحميل اثنين من الميكرويترات من كل عينة على هلام بروتين حيوي من 4 إلى 12٪ لمدة 35 دقيقة من الكهرومورفوريس الهلامي على الجليد عند 200 فولت. في نهاية الشوط، اغسل الجل بثلاثة مبادلات مياه على شاكر لمدة 10 دقائق على الأقل لكل غسل، يليه تلطيخ الحمض النووي بصبغة سيانين لمدة 15 دقيقة.صورة هلام على نظام التصوير هلام المناسبة، ووصمة عار هلام مرة أخرى مع 20 ملليلتر من الأزرق Coomassie. بعد ساعة واحدة، وإزالة وصمة عار مع الماء المقطر مزدوجة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل تصوير هلام مرة أخرى. لتنقية SNAP T7 المربوطة ب oligonucleotide ، أولا ، قم بإعداد حاجز elution عن طريق خلط 50 ميكرولتر من أثر مولار واحد ، مع 100 ميكرولتر من خمسة كلوريد صوديوم مولار ، مع 850 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج.بعد ذلك، ضع عمود تبادل أيون واحد لكل عينة في أنبوبي طرد مركزي من ملليلتر، واغسل الأعمدة بحاجز تنقية عن طريق الطرد المركزي حتى يتم إزالة كل العازل من كل عمود. تمييع كل عينة مع عازلة تنقية في مخزن مؤقت للتنقية ثلاثة إلى واحد إلى نسبة العينة، وتحميل 400 ميكرولتر من العينة في كل عمود. عند كافة المخزن المؤقت تم eluted كما هو موضح، تجميع وتسمية التدفق من خلال كل عينة.غسل الأعمدة ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من العازلة تنقية لكل غسل حتى تم eluted كل العازلة لكل غسل، وجمع ووضع العلامات على تدفق من خلال حسب الاقتضاء. بعد الغسيل الأخير ، اجمع البروتين الملوت بإضافة 50 ميكرولتر من العازلة elution إلى وسط العمود ، والطرد المركزي للعمود ثلاث مرات حتى يتم إلغاء جميع ال 50 ميكرولتر من العازلة. جمع وتسمية elute بعد كل الطرد المركزي، وتجميع elute في أنبوب واحد بعد الطرد المركزي الماضي، في حين ترك حجم صغير من كل elute لتحليل هلام.قياس امتصاص aliquots elute المتبقية في 260 و 280 نانومتر، وإضافة الجلسرين إلى العينات بنسبة واحد إلى واحد لتخزين ناقص 20 درجة حتى استخدامها. استخدم وحدة تصفية مركزية سعة 500 ميكرولتر 30 كيلودالتون لتبادل إجمالي المنتج elute مع مخزن تخزين مؤقت 2x. وقياس الامتصاص كما هو موضح.ثم إضافة الجلسرين إلى المنتج بنسبة واحد إلى واحد للتخزين ناقص 20 درجة مئوية. لتقييم elutes بواسطة SDS-PAGE، قم بتشغيل العينات في سلم بروتين مناسب على هلام حيوي من 4 إلى 12٪ لمدة 35 دقيقة عند 200 فولت، أو حتى تهاجر جبهة الصبغة إلى نهاية الجل. لإظهار نشاط التحكم عند الطلب في RNAP المربوطة، امزج 2.4 ميكرولتر من كل قالب مع خمسة ميكرولترات من العازلة 5x، و 14.2 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج.احتضان الناتجة عن واحد micromolar مزدوجة تقطعت بهم السبل قفص الحمض النووي في 75 درجة مئوية لمدة دقيقتين. وآني الشعور وسلالات مضادة للإحساس من المروج وmalachite الأخضر aptamer قالب الحمض النووي بنفس الطريقة كما هو مبين في الجدول. في نهاية الحضانات، أضف SNAP T7 RNAP المربوط إلى قفص الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بنسبة 1 إلى 5 أضراس إلى تركيز نهائي قدره 500 نانومولار RNAP.بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ضع العينة على الجليد، واخلط 2.5 ميكرولتر من 10x في المخزن المؤقت للنسخ المختبري مع ميكرولتر واحد من 25 ملليمولار ريبونوكليوسيد ثلاثي الفوسفات، وميكرونيتر واحد من مالاتشيت ملليمولار واحد أخضر، و 2.5 ميكرولتر من خليط RNAP CAGE، و 2.5 ميكرولتر لكل من عوامل النسخ الميكروبية واحد A و B oligonucleotides وثلاثة ميكرولترات من قالب واحد ملاخي ملاخي أخضر في 10 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. في 15 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج ، قم بإعداد رد فعل ثان يحتوي على 2.5 ميكرولتر من 10x في مخزن النسخ المختبري ، وميكرولتر واحد من 25 مزيج ثلاثي الفوسفات ثلاثي الريبونوكليوسيد من المليمولار ، و2.5 ميكرولتر من خليط RNAP CAGENAP ، وثلاثة ميكرولترات من قالب ملاطخي أخضر واحد من ملاط لإعداد رد فعل يحتوي على العازلة فقط، مزيج 2.5 ميكرولتر من 10x في المخزن المؤقت النسخ المختبري، ميكرولتر واحد من 25 ملليمولار ريبونوكليوسيد مزيج ثلاثي الفوسفات، ميكرولتر واحد من واحد ملاكيت مليومولار الأخضر، وثلاثة ميكرولتر من قالب واحد ملاخية ملاخية الأخضر aptamer في 17.5 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج.عندما يتم إعداد جميع ردود الفعل ، قم بنقل كل رد فعل إلى لوحة 384 بئرا ، وراقب نسخ aptamer الأخضر malachite على قارئ لوحة مضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية عند إثارة 610 نانومتر ، وانبعاث 655 نانومتر. في نهاية القراءة، ضع اللوحة على الجليد، وتشغيل المنتج الجيش الملكي النيبالي من كل بئر في إزالة الطبيعة 12٪ TBE-اليوريا هلام البولي أكريليك في 70 درجة مئوية TBE العازلة في 280 فولت لمدة 20 دقيقة، أو حتى الجبهة صبغ يصل إلى نهاية الجل. ثم، وصمة عار هلام مع صبغة السيانين وصمة عار حمض النيوكليك لمدة 10 دقائق على شاكر المدارية، قبل التصوير كما هو موضح.يمكن تأكيد نجاح التعبير وتنقية بروتين SNAP T7 RNAP المؤتلف باستخدام SDS-PAGE. بعد SDS-PAGE، يمكن التحقق من صحة النشاط الأنزيمي من خلال رد فعل النسخ في المختبر. يمكن التحقق من اقتران ناجح من Oligonucleotides BG وظيفية عن طريق 18٪ denaturing TBE-urea PAGE.بالمقارنة مع أوليغونوكليوتيد غير المعدلة، إضافة moiety BG إلى أوليغونوكليوتيد يزيد من وزنه الجزيئي. كما لوحظ في هذا الممثل صبغة السيانين وصمة عار هلام لتأكيد الحمض النووي المربوطة T7 RNAP تنقية من oligonucleotides BG الزائدة، وتدفق الأولي من خلال جزء يحتوي على معظمها فائض BG oligonucleotide، فضلا عن جزء صغير من البوليميراز الحمض النووي المربوطة التي لم ترتبط راتنج تبادل cation. تحتوي كسور تخفيف المسبح فقط على النطاق الوحيد من أوليغو RNAP الناجم عن ربط صبغة السيانين بحبل oligonucleotide ، مع عرض حارة المنتج المركزة نفسها ، ولكن الفرقة الداكنة مما يدل على تركيز ناجح.ويلاحظ نفس الأنماط من قبل تلطيخ الأزرق Coomassie، مع تحول حركة هلام صغير لوحظ في السيطرة RNAP غير المقترنة. هنا، تظهر إشارة الفلورسنت المنتجة في نهاية النسخ في المختبر في الحركية في الوقت الحقيقي. في هذا التحليل، لوحظ تنشيط 336 أضعاف في إشارة الفلورية، مما يدل على وجود سيطرة قوية على نشاط البوليميراز.عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أن تغسل بدقة SDS قبالة هلام قبل تلطيخ الحمض النووي. وذلك لأن STS سوف فخ الصبغة في هلام، مما أدى إلى إشارة خلفية عالية. تطبيق طريقتنا على دائرة جينية كبيرة مع سلاسل متعددة سوف تظهر قابلية وتكليف نظام النسخ المربوطة.وتستخدم هذه التقنية حاليا لتطوير دوائر جينية قادرة على حساب نمط الشبكة العصبية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

التكيف من الروبوت في الرنين المغناطيسي الوظيفي لمسي 3T

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

تطوير أميلوجينين-الشيتوزان هيدروجيل ل<em&gt; في المختبر</em&gt; إعادة نمو المينا مع واجهة الكثيفة

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الأنزيمية الفحص لقياس النسخ تثبيط من قبل الغاليوم (III) وH<sub&gt; 3</sub&gt; 5،10،15-تريس (pentafluorophenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

باستخدام البيولوجيا الاصطناعية إلى المهندس الخلايا الحية تتفاعل مع المواد القابلة للبرمجة

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

الأمثل للتحليل متعدد التعبير المستندة إلى الجيش الملكي النيبالي استخدام المواد الأرشيفية سرطان الثدي

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...