Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

L.Y.T.C anerkender generøs støtte fra New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant og University of Toronto's Medicine by Design Initiative, som modtager støtte fra Canada First Research Excellence Fund (CFREF).

1. Forberedelse af buffer
BEMÆRK: Proteinrensningsbufferpræparat kan forekomme på enhver dag; her blev det gjort før eksperimenterne begyndte.
<ol><li>Klargør lysis/ekvilibreringsbuffer indeholdende 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), 300 mM natriumchlorid (NaCl), 5% glycerol og 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Der tilsættes 1,5 mL 1M Tris, 1,8 mL 5M NaCl, 1,5 mL glycerol, 25,2 mL deioniseret vand (ddH2O) i et 50 mL centrifugerør, og tilsæt 10,5 μL på 14,2 M...

<ol>
	<li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks.">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li><li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li><li>Chen, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA.">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li><li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+gene+networks.">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li><li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing:+advances+and+prospects.">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li><li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes.">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li><li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer.">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li><li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Mart&#237;nez-P&#233;rez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing:+A+multiobjective+evolutionary+approach.">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li><li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands:+enhanced+models,+scalability,+and+speed.">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li><li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+costs:+Data.">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li><li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics.">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA.">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li><li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage.">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).</li><li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DNA+to+power+nanostructures.">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li><li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA.">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li><li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems.">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li><li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement.">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).</li><li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -. B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handhold-mediated+strand+displacement:+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions.">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li><li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors.">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li><li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles.">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).</li><li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits.">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li><li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.8+&#197;+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11.">2.8 &#197; crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. 301 (1), 117-128 (2000).</li><li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors.">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li><li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis.">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li><li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors.">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li><li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+elongation,+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase.">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li><li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li><li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortase-tag+expressed+protein+ligation:+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step.">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li><li>Zhang, W. -. B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li></ol>

Denne undersøgelse viser en DNA nanoteknologi-inspireret tilgang til at kontrollere aktiviteten af T7 RNA polymerase ved kovalent kobling en N-terminalt SNAP-tagged rekombinant T7 RNAP med en BG-funktionaliseret oligonukleotid, som efterfølgende blev brugt til at programmere TMDSD reaktioner. Ved design blev SNAP-tag placeret på N-terminus af polymerase, da C-endestationen for vild type T7 RNAP er begravet i proteinstrukturkernen og gør vigtige kontakter med DNA-skabelonen28. Tidligere forsøg...

DNA computing bruger et sæt designet oligonukleotider som medium til beregning. Disse oligonukleotider er programmeret med sekvenser til dynamisk at samle i henhold til brugerdefineret logik og reagere på specifikke nukleinsyreinput. I proof-of-concept-undersøgelser består beregningens output typisk af et sæt fluorescerende mærkede oligonuleotider, der kan påvises via gelelektroforese eller fluorescenspladelæsere. I løbet af de sidste 30 år er stadig mere komplekse DNA-beregningskredsløb blevet påvist, såsom forskellige digitale logiske kaskader, kemiske reaktionsnetværk og neurale netværk1,2,3. For at hjælpe med udarbejdelsen af disse DNA-kredsløb er matematiske modeller blevet brugt til at forudsige funktionaliteten af syntetiske genkredsløb4,5og beregningsværktøjer er udviklet til ortogonalt DNA-sekvensdesign6,7,8,9,10 . Sammenlignet med siliciumbaserede computere omfatter fordelene ved DNA-computere deres evne til at kommunikere direkte med biomolekyler, fungere i opløsning i mangel af en strømforsyning samt deres samlede kompakthed og stabilitet. Med fremkomsten af næste generations sekventering, omkostningerne ved at syntetisere DNA-computere har været faldende i de sidste to årtier med en hastighed hurtigere end Moores lov11. Anvendelser af sådanne DNA-baserede computere er nu begyndt at dukke op, såsom for sygdomsdiagnose12,13, til kraftoverførsel molekylær biofysik14,og som datalagring platforme15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Figur 1: Mekanisme for toehold-medieret DNA-strengforskydning. Toehold, δ, er en gratis, ubundet sekvens på en delvis duplex. Når et supplerende domæne (δ*) introduceres på en anden streng, fungerer det frie δ domæne som et fodfæste for hybridisering, hvilket giver mulighed for, at resten af strengen (ɑ*) langsomt fortrænger sin konkurrent gennem en zippe / unzipping reversibel reaktion kendt som strengmigration. Efterhånden som længden af δ øges, falder ΔG for fremadrettede reaktioner, og forskydning sker lettere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Til dato anvender de fleste DNA-computere et veletableret motiv inden for dynamisk DNA-nanoteknologi kendt som toehold-medieret DNA-strengforskydning (TMDSD, figur 1)16. Dette motiv består af en delvist dobbeltstrenget DNA (dsDNA) duplex, der viser korte "toehold" udhæng (dvs. 7- til 10 nukleotider (nt)). Nukleinsyre "input" tråde kan interagere med den delvise duplexes gennem fodfæste. Dette fører til forskydning af en af strengene fra den delvise duplex, og denne frigjorte streng kan derefter tjene som input til downstream delvise duplexes. Således muliggør TMDSD signalkascading og informationsbehandling. I princippet kan ortogonale TMDSD-motiver fungere uafhængigt i opløsning, hvilket muliggør parallel informationsbehandling. Der har været en række variationer over TMDSD-reaktionen, såsom toehold-medieret DNA-strengudveksling (TMDSE)17, "leakless" toeholds med dobbeltlange domæner18, sekvens-mismatched toeholds19og "handhold"-medieret strengforskydning20. Disse innovative designprincipper giver mulighed for mere finjusterede TMDSD-energiske og dynamikker til forbedring af DNA-databehandlingens ydeevne.
Syntetiske genkredsløb, såsom transskriptionsgenkredsløb, er også i stand til beregning21,22,23. Disse kredsløb er reguleret af protein transskription faktorer, som aktiverer eller undertrykke transskription af et gen ved at binde sig til specifikke regulatoriske DNA-elementer. Sammenlignet med DNA-baserede kredsløb har transskriptionskredsløb flere fordele. For det første har enzymatisk transskription en meget højere omsætningshastighed end eksisterende katalytiske DNA-kredsløb, hvilket genererer flere kopier af output pr. enkelt kopi af input og giver et mere effektivt middel til signalforstærkning. Derudover kan transskriptionskredsløb producere forskellige funktionelle molekyler, såsom aptamers eller messenger RNA (mRNA) kodning til terapeutiske proteiner, som beregningsoutput, som kan udnyttes til forskellige applikationer. Men en stor begrænsning af de nuværende transskriptionskredsløb er deres manglende skalerbarhed. Dette skyldes, at der er et meget begrænset sæt ortogonale proteinbaserede transskriptionsfaktorer, og de novo-design af nye proteintransskriptionsfaktorer er fortsat teknisk udfordrende og tidskrævende.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Figur 2: Abstraktion og mekanisme af "tether" og "bur" polymerase kompleks. (A og B) En oligonuleotid tether er enzymatisk mærket til en T7 polymerase gennem SNAP-tag reaktion. Et bur bestående af en "faux" T7 promotor med en tether-supplement udhæng gør det muligt at hybridisere til tøjre og blokere transskriptionelle aktivitet. (C) Når operatøren (a*b*) er til stede, binder den sig til fodfæste på oligonucleotidsbindingen(ab) og fortrænger burets b*-region, således at transskriptionen kan forekomme. Dette tal er blevet ændret fra Chou og Shih27. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Dette papir introducerer en ny byggesten til molekylær databehandling, der kombinerer funktionaliteterne i transskriptionskredsløb med skalerbarheden af DNA-baserede kredsløb. Denne byggesten er en T7 RNAP kovalent fastgjort med en enkeltstrenget DNA-tether (Figur 2A). For at syntetisere denne DNA-tøjrede T7 RNAP blev polymerase smeltet til en N-terminal SNAP-tag24 og rekombinant udtrykt i Escherichia coli. SNAP-mærket blev derefter reageret med et oligonuleotid, der blev funktionaliseret med BG-substratet. Oligonucleotid tether tillader positionering af molekylære gæster i nærheden af polymerase via DNA hybridisering. En sådan gæst var en konkurrencedygtig transskriptionsblokker kaldet et "bur", som består af en "faux" T7 promotor DNA-duplex uden gen nedstrøms (Figur 2B). Når buret er bundet til RNAP via sinoligonucleotid tether, bremser det polymeraseaktiviteten ved at udkonkurrere andre DNA-skabeloner til RNAP-binding, hvilket gør RNAP i en "OFF"-tilstand (figur 2C).
For at aktivere polymerase til en "ON" tilstand blev T7 DNA-skabeloner med enkeltstrengede "operatør" domæner opstrøms af T7-promotoren af genet designet. Operatøren domæne (dvs. domæne a * b * Figur 2C) kan være designet til at fortrænge buret fra RNAP via TMDSD og placere RNAP proksimale til T7 promotor af genet, og dermed indlede transskription. Alternativt blev DNA-skabeloner også designet, hvor operatørsekvensen var et supplement til hjælpekernekernesalve, der kaldes "kunstige transskriptionsfaktorer" (dvs. TFA- og TFB-strenge i figur 3A). Når begge tråde introduceres i reaktionen, samles de på operatørwebstedet og opretter et nyt pseudo-sammenhængende domæne a * b *. Dette domæne kan derefter fortrænge buret via TMDSD for at indlede transskription (Figur 3B). Disse tråde kan leveres enten eksogent eller produceres.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Figur 3: Selektiv programmering af polymeraseaktivitet gennem en trekomponent switch-aktivator. (A) Når transskriptionsfaktorerne (TFA og TFB) er til stede, binder de sig til operatordomænet opstrøms promotoren og danner en pseudostrenget sekvens (a*b*), der kan fortrænge buret gennem toehold medieret DNA-forskydning. (B) Dette a * b * domæne kan fortrænge buret via TMDSD at indlede transskription. Dette tal er blevet ændret fra Chou og Shih27. Forkortelser: TF = transskriptionsfaktor; RNAP = RNA polymerase; TMDSD = toehold-medieret DNA-strengforskydning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Brugen af nukleinsyre-baserede transskription faktorer for in vitro transskriptionion regulering tillader skalerbar gennemførelse af sofistikerede kredsløb adfærd såsom digital logik, feedback, og signal cascading. For eksempel kan man bygge logik gate kaskader ved at designe nukleinsyre sekvenser således, at udskrifter fra en opstrøms gen aktivere en downstream gen. Et program, der udnytter kaskade og multiplexing gjort i stand til af denne foreslåede teknologi er udviklingen af mere sofistikerede molekylære computing kredsløb til bærbare diagnostik og molekylær databehandling. Derudover kan integration af molekylær databehandling og de novo RNA-syntesefunktioner muliggøre nye applikationer. For eksempel kan et molekylært kredsløb være designet til at detektere en eller en kombination af brugerdefinerede RNA'er som input og output terapeutiske RNA'er eller mRNAs, der kodning funktionelle peptider eller proteiner til punkt-of-care medicinske applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

DNA nanoteknologi muliggør programmerbar selvmontering af nukleinsyrer i brugerordinerede former og dynamikker til forskellige applikationer. Dette arbejde viser, at begreber fra DNA nanoteknologi kan bruges til at programmere den enzymatiske aktivitet af phage-afledt T7 RNA polymerase (RNAP) og opbygge skalerbare syntetiske genregulerende netværk. For det første konstrueres en RNAP,der er bundet af RNAP med oliigonuleotid, via udtryk for en N-terminalt SNAP-mærket RNAP og efterfølgende kemisk kobling af SNAP-mærket med en benzylguanine (BG)-modificeret oligonukleotid. Dernæst bruges nukleinsyrestrengforskydning til at programmere polymerasetransskription on-demand. Derudover kan hjælpekernekernesyresamlinger bruges som "kunstige transskriptionsfaktorer" til at regulere samspillet mellem den DNA-programmerede T7 RNAP med sine DNA-skabeloner. Denne in vitro transskription reguleringsmekanisme kan gennemføre en række kredsløb adfærd såsom digital logik, feedback, kaskade, og multiplexing. Sammensætningen af denne genregulerende arkitektur letter design abstraktion, standardisering og skalering. Disse funktioner vil gøre det muligt hurtigt at prototyping af in vitro genetiske anordninger til applikationer såsom bio-sensing, sygdomsdetektering, og datalagring.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Figur 5: SDS-PAGE analyse af SNAP T7 RNAP udtryk og in vitro transskription assay. (A) SNAP T7 RNAP protein rensning analyse, SNAP T7 RNAP molekylvægt: 119.4kDa. FT = flow-through fra kolonnen, W1 = elution fraktioner af vaskebuffer indeholdende urenheder, E1-3 = elution fraktioner indeholdende renset produkt, og DE = 10x fortyndet total afs...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

Vi beskriver ingeniørien af en ny DNA-tøjret T7 RNA polymerase til regulering af in vitro transskription reaktioner. Vi diskuterer trinene til proteinsyntese og karakterisering, validere proof-of-concept transskriptionel regulering, og diskutere dens anvendelser i molekylær computing, diagnostik, og molekylær informationsbehandling.

DNA-tøjret RNA Polymerase til programmerbar In vitro transskription og molekylær beregning

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Vi foreslår en metode til regulering af polymeraseaktivitet ved hjælp af kunstige nukleinsyretransskriptionsfaktorer. Denne genregulerende arkitektur kan tjene som en byggesten for fremtidige in vitro genetiske enheder. Ved at binde et DNA-bindingsdomæne til en T7 RNA-polymerase kombinerer denne teknik skalerbarheden af DNA-baserede kredsløb med funktionaliteten af transskriptionskredsløb.Begynd med at lave ni fortyndinger af enkeltstrenget BG-oligonuleotid til et sidste volumen på 50 mikroliter dobbeltdestilleret vand, fra fem til et til et til et til fem nøgletal, som angivet i tabellen. Forbered en reaktionsblanding til hver fortynding ved at blande to mikroliter SNAP-buffer med fire mikroliter BG-oligonuleotid og fire mikroliter af SNAP T7 RNAP. Forbered RNAP-styringen ved at erstatte oligonuleotid med dobbeltdestilleret vand og DNA-kontrollen ved at erstatte SNAP T7 RNAP med dobbeltdestilleret vand.Konfigurer 11 reaktioner ved at tilføje to mikroliter af hver prøve til fire mikroliter SNAP-buffer og to mikroliter af proteinbelastningsfarvestof pr. prøve. Varm reaktionerne i 10 minutter ved 70 grader Celsius, før du lægger to mikroliter af hver prøve på en fire til 12% glasagtig proteingel i 35 minutters gelelektroforese på is ved 200 volt. I slutningen af løbet skal gelen vaskes med tre vandudvekslinger på en shaker i mindst 10 minutter pr. vask efterfulgt af nukleinsyrefarvning med cyaninfarve i 15 minutter.Billede gelen på en passende gel imaging system, og plette gelen igen med 20 milliliter Coomassie blå. Efter en time, de-plet med dobbelt destilleret vand i mindst en time, før billeddannelse gelen igen. For oligonucleotid-tøjret SNAP T7 rensning, først forberede elution buffer ved at blande 50 mikroliter af en molar spor, med 100 mikroliter af fem molar natriumchlorid, med 850 mikroliter af dobbelt destilleret vand.Placer derefter en ionbytningskolonne pr. prøve i individuelle to millilitercentrifugerør, og vask kolonnerne med rensningsbuffer ved centrifugering, indtil hele bufferen er blevet eluteret fra hver kolonne. Fortynd hver prøve med rensningsbuffer ved et 3-1 rensningsbuffer til prøveforhold, og der indlæses 400 mikroliter af prøven i hver kolonne. Når hele bufferen er blevet udvundet som demonstreret, opsamles og mærkes flowet for hver prøve.Vask kolonnerne tre gange med 400 mikroliter rensebuffer pr. vask, indtil hele bufferen er blevet eluteret pr. vask, indsamling og mærkning af strømningsgennemstrømningerne efter behov. Efter den sidste vask, indsamle eluted protein ved at tilføje 50 mikroliter af elution buffer i midten af kolonnen, og centrifugere kolonnen tre gange, indtil alle 50 mikroliter af buffer er blevet eluted. Saml og mærk eluten efter hver centrifugering, samle elute i et enkelt rør efter den sidste centrifugering, samtidig med at et lille volumen af hver elute til gelanalyse.Mål absorbansen af de resterende elute aliquots ved 260 og 280 nanometer, og tilsæt glycerol til prøverne i et en-til-en-forhold for minus 20 graders opbevaring indtil deres anvendelse. Brug en 500 mikroliter 30 kilodalton centrifical filter enhed til buffer udveksling af det samlede elute produkt med 2x opbevaring buffer. Og mål absorbansen som demonstreret.Derefter tilsættes glycerol til produktet i et en-til-en-forhold for minus 20 grader Celsius opbevaring. For at vurdere elutes af SDS-PAGE, køre prøverne i en passende protein stigen på en fire til 12% glasagtig gel i 35 minutter ved 200 volt, eller indtil farvestof front migrerer til slutningen af gelen. For at demonstrere den tøjrede RNAP's kontrolaktivitet efter behov blandes 2,4 mikroliter af hver skabelon med fem mikroliter af 5x udglødningsbuffer og 14,2 mikroliter dobbeltdestilleret vand.Inkuber den resulterende en mikromolar dobbeltstrenget DNA CAGE ved 75 grader Celsius i to minutter. Og udgløde sans og anti-sense stammer af promotor og malakit grøn aptamer DNA skabelon på samme måde som angivet i tabellen. Ved afslutningen af inkubationerne tilsættes den tøjrede SNAP T7 RNAP til det dobbelte strandede DNA CAGE med et 1-5 molarforhold til en endelig koncentration på 500 nanomolar RNAP.Efter 15 minutter ved stuetemperatur anbringes prøven på is og blandes 2,5 mikroliter af 10x in vitro transskriptionsbuffer med en mikroliter på 25 millimolar ribonucleoside triphosphat, en mikroliter af en millimolar malakitgrøn, 2,5 mikroliter af RNAP CAGE-blandingen, 2,5 mikroliter hver af en mikromolar transskriptionsfaktorer A og B oligonucleotides tråde, og tre mikroliter af en millimolar malakit grøn aptamer skabelon i 10 mikroliter af dobbelt destilleret vand. I 15 mikroliter af dobbelt destilleret vand, oprette en anden reaktion, der indeholder 2,5 mikroliter af 10x in vitro transskription buffer, en mikroliter af 25 millimolar ribonucleoside triphosphat mix, en mikroliter af en millimolar malakit grøn, 2,5 mikroliter af RNAP CAGE blandingen, og tre mikroliter af en millimolar malakit grøn aptamer skabelon. For kun at oprette en reaktion, der indeholder buffer, blandes 2,5 mikroliter af 10x in vitro transskription buffer, en mikroliter af 25 millimolar ribonucleoside triphosphat mix, en mikroliter af en millimolar malakit grøn, og tre mikroliter af en millimolar malakit grøn aptamer skabelon i 17,5 mikroliter af dobbelt destilleret vand.Når alle reaktionerne er blevet forberedt, overføre hver reaktion til en 384-brønd plade, og overvåge malakit grøn aptamer transskription på en fluorescens pladelæser i to timer ved 37 grader Celsius ved en 610 nanometer excitation, og en 655 nanometer emission. I slutningen af aflæsningen skal du placere pladen på is og køre RNA-produktet fra hver brønd i en denaturerende 12% TBE-urea polyacrylic gel i 70 grader Celsius TBE buffer ved 280 volt i 20 minutter, eller indtil farvestoffronten når slutningen af gelen. Derefter plette gelen med cyanin farvestof nukleinsyre plet i 10 minutter på en orbital shaker, før billeddannelse som påvist.Et vellykket udtryk og rensning af rekombinantEN SNAP T7 RNAP-protein kan bekræftes ved hjælp af SDS-PAGE. Efter SDS-PAGE kan den enzymatiske aktivitet valideres ved in vitro transskription reaktion. Vellykket kobling af BG funktionaliserede oligonukleotider kan verificeres via 18% denaturering TBE-urea PAGE.Sammenlignet med det uændrede oligonukleotid øger tilsætning af BG-moietietiet til oligonuleotid sin molekylvægt. Som observeret i denne repræsentative cyaninfarvepletgel for at bekræfte DNA-bundet T7 RNAP-rensning fra overskydende BG-oligonuleotider indeholdt den oprindelige strøm gennem fraktionen for det meste overskydende BG-oligonukleotid samt en lille del af den DNA-tøjrede polymerase, der ikke binder sig til kationbytteharpiksen. Pool fortynding fraktioner indeholdt kun det enkelte bånd af RNAP oligo forårsaget af cyanin farvestof bindende for oligoukleotid tether, med up-koncentreret produkt lane udviser det samme, men mørkere bånd betyder en vellykket up-koncentration.De samme mønstre observeres af Coomassie blå farvning, med en lille gel mobilitet skift observeret i den ikke konjugerede RNAP kontrol. Her vises fluorescerende signal produceret i slutningen af in vitro-transskriptionen i realtids kinetik. I denne analyse blev der observeret en 336 gange aktivering i fluorescenssignalet, hvilket viste en robust kontrol af polymeraseaktiviteten.Når du forsøger denne protokol, skal du huske at vaske SDS grundigt af gelen før nukleinsyrefarvning. Dette skyldes, at STS vil fange farvestoffet i gelen, hvilket resulterer i højt baggrundssignal. Anvendelse af vores metode til et stort genkredsløb med flere kaskader vil vise skalerbarheden og komponeringen af det tøjrede transskriptionssystem.Denne teknik er i øjeblikket bruges til at udvikle gen kredsløb i stand til neurale netværk stil beregning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Montering af Semi-kunstige Molekylær Machine og dens anvendelse til påvisning af DNA-skader

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Udvikling af Amelogenin-chitosan Hydrogel for<em&gt; In Vitro</em&gt; Emalje genvækst med en tæt grænseflade

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In vitro</em&gt; Enzymatisk assay til måling Transskription Inhibering af gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Brug Syntetisk Biologi Engineer levende celler der Grænseflade med Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimering af en Multiplex RNA-baserede udtryk analyse ved hjælp af bryst kræft arkivalier

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...