Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

L.Y.T.C erkent genereuze steun van de New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant en het Medicine by Design Initiative van de Universiteit van Toronto, dat financiering ontvangt van het Canada First Research Excellence Fund (CFREF).

1. Buffervoorbereiding
OPMERKING: Eiwitzuiveringsbuffervoorbereiding kan op elke dag plaatsvinden; hier werd het gedaan voordat de experimenten begonnen.
<ol><li>Bereid lysis/equilibratiebuffer met 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris), 300 mM natriumchloride (NaCl), 5% glycerol en 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Voeg 1,5 ml 1M Tris, 1,8 ml 5M NaCl, 1,5 ml glycerol, 25,2 ml gedeïoniseerd water (ddH2O) toe aan een centrifugebuis van 50 ml en voeg vlak voor gebruik 10,5...

<ol>
	<li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks.">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li><li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li><li>Chen, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA.">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li><li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+gene+networks.">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li><li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing:+advances+and+prospects.">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li><li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes.">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li><li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer.">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li><li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Mart&#237;nez-P&#233;rez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing:+A+multiobjective+evolutionary+approach.">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li><li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands:+enhanced+models,+scalability,+and+speed.">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li><li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+costs:+Data.">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li><li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics.">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA.">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li><li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage.">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).</li><li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DNA+to+power+nanostructures.">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li><li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA.">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li><li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems.">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li><li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement.">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).</li><li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -. B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handhold-mediated+strand+displacement:+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions.">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li><li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors.">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li><li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles.">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).</li><li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits.">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li><li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.8+&#197;+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11.">2.8 &#197; crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. 301 (1), 117-128 (2000).</li><li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors.">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li><li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis.">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li><li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors.">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li><li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+elongation,+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase.">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li><li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li><li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortase-tag+expressed+protein+ligation:+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step.">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li><li>Zhang, W. -. B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li></ol>

Deze studie demonstreert een dna-nanotechnologie-geïnspireerde benadering om de activiteit van T7 RNA-polymerase te beheersen door covalent een N-terminaal SNAP-gelabelde recombinant T7 RNAP te koppelen aan een BG-gefunctionaliseerd oligonucleotide, dat vervolgens werd gebruikt om TMDSD-reacties te programmeren. Door het ontwerp werd de SNAP-tag gepositioneerd op het N-eindpunt van het polymerase, omdat het C-eindpunt van wild-type T7 RNAP begraven ligt in de kern van de eiwitstructuur en belangrijke contacten legt met ...

DNA-computing maakt gebruik van een set ontworpen oligonucleotiden als medium voor berekening. Deze oligonucleotiden zijn geprogrammeerd met sequenties om dynamisch te assembleren volgens door de gebruiker gespecificeerde logica en te reageren op specifieke nucleïnezuurinputs. In proof-of-concept studies bestaat de output van de berekening meestal uit een set fluorescerend gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gedetecteerd via gel-elektroforese of fluorescentieplaatlezers. In de afgelopen 30 jaar zijn steeds complexere DNA-computationele circuits aangetoond, zoals verschillende digitale logische cascades, chemische reactienetwerken en neurale netwerken1,2,3. Om te helpen bij de voorbereiding van deze DNA-circuits, zijn wiskundige modellen gebruikt om de functionaliteit van synthetische gencircuits te voorspellen4,5,en computationele hulpmiddelen zijn ontwikkeld voor orthogonaal DNA-sequentieontwerp6,7,8,9,10 . In vergelijking met op silicium gebaseerde computers omvatten de voordelen van DNA-computers hun vermogen om rechtstreeks met biomoleculen te communiceren, in oplossing te werken bij afwezigheid van een voeding, evenals hun algehele compactheid en stabiliteit. Met de komst van next-generation sequencing zijn de kosten van het synthetiseren van DNA-computers de afgelopen twee decennia sneller gedaald dan de wet van Moore11. Toepassingen van dergelijke DNA-gebaseerde computers beginnen nu op te komen, zoals voor ziektediagnose12,13,voor het aandrijven van moleculaire biofysica14en als gegevensopslagplatforms15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Figuur 1: Mechanisme van door de retentie gemedieerde verplaatsing van DNA-strengen. De toehold, δ, is een vrije, ongebonden reeks op een gedeeltelijke duplex. Wanneer een complementair domein (δ*) op een tweede streng wordt geïntroduceerd, dient het vrije δ domein als houvast voor hybridisatie, waardoor de rest van de streng (ɑ*) zijn concurrent langzaam kan verdringen door een ritsende / unzipping omkeerbare reactie die bekend staat als strengmigratie. Naarmate de lengte van δ toeneemt, neemt de ΔG voor de voorwaartse reactie af en vindt verplaatsing gemakkelijker plaats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tot op heden gebruiken de meeste DNA-computers een gevestigd motief op het gebied van dynamische DNA-nanotechnologie dat bekend staat als teenhold-gemedieerde DNA-strengverplaatsing (TMDSD, figuur 1)16. Dit motief bestaat uit een gedeeltelijk dubbelstrengs DNA (dsDNA) duplex met korte "teenvaste" overhangen (d.w.z. 7- tot 10 nucleotiden (nt)). Nucleïnezuur "input" strengen kunnen interageren met de partiële duplexen door de teen. Dit leidt tot de verplaatsing van een van de strengen van de gedeeltelijke duplex, en deze bevrijde streng kan dan dienen als input voor stroomafwaartse gedeeltelijke duplexen. TMDSD maakt dus signaalcassering en informatieverwerking mogelijk. In principe kunnen orthogonale TMDSD-motieven onafhankelijk in oplossing werken, waardoor parallelle informatieverwerking mogelijk is. Er zijn een aantal variaties geweest op de TMDSD-reactie, zoals teenhold-gemedieerde DNA-strenguitwisseling (TMDSE)17,"lekloze" teengrepen met dubbellangedomeinen 18,sequentie-niet-overeenkomende teengrepen19en "handhold"-gemedieerde strengverplaatsing20. Deze innovatieve ontwerpprincipes maken nauwkeuriger afgestemde TMDSD-energetica en dynamiek mogelijk voor het verbeteren van dna-rekenprestaties.
Synthetische gencircuits, zoals transcriptionele gencircuits, zijn ook in staat om21,22,23teberekenen. Deze circuits worden gereguleerd door eiwittranscriptiefactoren, die transcriptie van een gen activeren of onderdrukken door zich te binden aan specifieke regulerende DNA-elementen. In vergelijking met DNA-gebaseerde circuits hebben transcriptionele circuits verschillende voordelen. Ten eerste heeft enzymatische transcriptie een veel hogere omloopsnelheid dan bestaande katalytische DNA-circuits, waardoor meer kopieën van de output per enkele kopie van de ingang worden gegenereerd en een efficiëntere manier van signaalversterking wordt geboden. Bovendien kunnen transcriptionele circuits verschillende functionele moleculen produceren, zoals aptameren of boodschapper-RNA (mRNA) die coderen voor therapeutische eiwitten, als berekeningsoutputs, die voor verschillende toepassingen kunnen worden gebruikt. Een belangrijke beperking van de huidige transcriptionele circuits is echter hun gebrek aan schaalbaarheid. Dit komt omdat er een zeer beperkte set orthogonale eiwitgebaseerde transcriptiefactoren is en het de novo ontwerp van nieuwe eiwittranscriptiefactoren technisch uitdagend en tijdrovend blijft.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Figuur 2: Abstractie en mechanisme van "tether" en "cage" polymerase complex. (A en B) Een oligonucleotide tether wordt enzymatisch gelabeld op een T7 polymerase door middel van de SNAP-tag reactie. Een kooi bestaande uit een "faux" T7-promotor met een tether-complementoverhang maakt het mogelijk om te hybridiseren naar de tether en transcriptionele activiteit te blokkeren. (C) Wanneer de operator (a*b*) aanwezig is, bindt hij zich aan de teengreep op de oligonucleotide tether (ab) en verplaatst het b* gebied van de kooi, waardoor transcriptie kan plaatsvinden. Dit cijfer is aangepast van Chou en Shih27. Afkortingen: RNAP = RNA polymerase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Dit artikel introduceert een nieuwe bouwsteen voor moleculaire computing die de functionaliteiten van transcriptionele circuits combineert met de schaalbaarheid van dna-gebaseerde circuits. Deze bouwsteen is een T7 RNAP covalent bevestigd met een enkelstrengs DNA-tether(Figuur 2A). Om deze DNA-gebonden T7 RNAP te synthetiseren, werd het polymerase gefuseerd tot een N-terminal SNAP-tag24 en recombinant uitgedrukt in Escherichia coli. De SNAP-tag werd vervolgens gereageerd met een oligonucleotide gefunctionaliseerd met het BG-substraat. De oligonucleotide-tether maakt de positionering van moleculaire gasten in de nabijheid van het polymerase mogelijk via DNA-hybridisatie. Een van die gasten was een competitieve transcriptionele blokker die een "kooi" wordt genoemd, die bestaat uit een "faux" T7 promotor DNA-duplex zonder gen stroomafwaarts(Figuur 2B). Wanneer de kooi via zijn oligonucleotide-tether aan de RNAP wordt gebonden, blokkeert de kooi de polymeraseactiviteit door andere DNA-sjablonen voor RNAP-binding te overtreffen, waardoor de RNAP in een "OFF" -toestand wordt weergegeven(Figuur 2C).
Om het polymerase tot een "ON" -toestand te activeren, werden T7 DNA-sjablonen met enkelstrengs "operator" -domeinen stroomopwaarts van de T7-promotor van het gen ontworpen. Het operatordomein (d.w.z. domein a*b* Figuur 2C)kan worden ontworpen om de kooi via TMDSD van de RNAP te verplaatsen en de RNAP proximaal aan de T7-promotor van het gen te plaatsen, waardoor transcriptie wordt geïnitieerd. Als alternatief werden ook DNA-sjablonen ontworpen waarbij de operatorsequentie complementair was aan hulpnucleïnezuurstrengen die worden aangeduid als "kunstmatige transcriptiefactoren" (d.w.z. TFA- en TFB-strengen in figuur 3A). Wanneer beide strengen in de reactie worden geïntroduceerd, zullen ze zich op de operatorlocatie verzamelen, waardoor een nieuw pseudo-aaneengesloten domein a * b *ontstaat. Dit domein kan vervolgens de kooi verplaatsen via TMDSD om transcriptie te initiëren(Figuur 3B). Deze strengen kunnen zowel exogene als geproduceerd worden geleverd.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Figuur 3: Selectieve programmering van polymeraseactiviteit door middel van een driecomponentenschakelaaractivator. (A) Wanneer de transcriptiefactoren (TFA en TFB) aanwezig zijn, binden ze zich aan het operatordomein stroomopwaarts van de promotor en vormen ze een pseudo-enkelstrengssequentie ( a *b *) die in staat is de kooi te verplaatsen door middel van teengemedieerde DNA-verplaatsing. (B) Dit a*b*-domein kan de kooi via TMDSD verplaatsen om transcriptie te initiëren. Dit cijfer is aangepast van Chou en Shih27. Afkortingen: TF = transcriptiefactor; RNAP = RNA-polymerase; TMDSD = tenen-gemedieerde DNA-strengverplaatsing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het gebruik van op nucleïnezuur gebaseerde transcriptiefactoren voor in vitro transcriptionele regulatie maakt de schaalbare implementatie van geavanceerd circuitgedrag mogelijk, zoals digitale logica, feedback en signaalcassalisatie. Men kan bijvoorbeeld logische poortcascades bouwen door nucleïnezuursequenties zo te ontwerpen dat de transcripties van een stroomopwaarts gen een stroomafwaarts gen activeren. Een toepassing die gebruik maakt van de cascadering en multiplexing die door deze voorgestelde technologie mogelijk wordt gemaakt, is de ontwikkeling van meer geavanceerde moleculaire computercircuits voor draagbare diagnostiek en moleculaire gegevensverwerking. Bovendien kan de integratie van de moleculaire computing en de novo RNA-synthesemogelijkheden nieuwe toepassingen mogelijk maken. Een moleculair circuit kan bijvoorbeeld worden ontworpen om één of een combinatie van door de gebruiker gedefinieerde RNA's te detecteren als inputs en output therapeutische RNA's of mRNA's die coderen voor functionele peptiden of eiwitten voor point-of-care medische toepassingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

DNA-nanotechnologie maakt programmeerbare zelfassemblage van nucleïnezuren in door de gebruiker voorgeschreven vormen en dynamieken voor diverse toepassingen mogelijk. Dit werk toont aan dat concepten uit de DNA-nanotechnologie kunnen worden gebruikt om de enzymatische activiteit van het faag-afgeleide T7-RNA-polymerase (RNAP) te programmeren en schaalbare synthetische genregulerende netwerken te bouwen. Ten eerste wordt een oligonucleotide-gebonden T7 RNAP ontworpen via expressie van een N-terminale SNAP-gelabelde RNAP en daaropvolgende chemische koppeling van de SNAP-tag met een benzylguanine (BG)-gemodificeerd oligonucleotide. Vervolgens wordt nucleïnezuurstrengverplaatsing gebruikt om polymerasetranscriptie op aanvraag te programmeren. Bovendien kunnen hulpnucleïnezuurassemblages worden gebruikt als "kunstmatige transcriptiefactoren" om de interacties tussen de DNA-geprogrammeerde T7 RNAP met zijn DNA-sjablonen te reguleren. Dit in vitro transcriptie regulerende mechanisme kan een verscheidenheid aan circuitgedragingen implementeren, zoals digitale logica, feedback, cascadering en multiplexing. De composability van deze genregulerende architectuur vergemakkelijkt ontwerpabstractie, standaardisatie en schaling. Deze functies zullen de snelle prototyping van in vitro genetische apparaten mogelijk maken voor toepassingen zoals bio-sensing, ziektedetectie en gegevensopslag.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Figuur 5: SDS-PAGE analyse van SNAP T7 RNAP expressie en in vitro transcriptie assay. (A) SNAP T7 RNAP eiwitzuiveringsanalyse, SNAP T7 RNAP molecuulgewicht: 119.4kDa. FT = doorstroming uit de kolom, W1 = elutiefracties van wasbuffer die onzuiverheden bevatten, E1-3 = elutiefracties die gezuiverd product bevatten en DE = 10x verdunde totale on...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

We beschrijven de engineering van een nieuw DNA-gebonden T7-RNA-polymerase om in vitro transcriptiereacties te reguleren. We bespreken de stappen voor eiwitsynthese en karakterisering, valideren proof-of-concept transcriptionele regulatie en bespreken de toepassingen ervan in moleculaire computing, diagnostiek en moleculaire informatieverwerking.

DNA-gebonden RNA-polymerase voor programmeerbare in vitro transcriptie en moleculaire berekening

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

We stellen een methode voor voor het reguleren van polymerase-activiteit met behulp van kunstmatige nucleïnezuurtranscriptiefactoren. Deze genregulerende architectuur kan dienen als bouwsteen voor toekomstige in vitro genetische apparaten. Door een DNA-bindend domein aan een T7-RNA-polymerase te binden, combineert deze techniek de schaalbaarheid van dna-gebaseerde circuits met de functionaliteit van transcriptionele circuits.Begin met het maken van negen verdunningen van enkelstrengs BG-oligonucleotide tot een eindvolume van 50 microliter dubbel gedestilleerd water, van vijf tot één tot één tot vijf verhoudingen, zoals aangegeven in de tabel. Bereid één reactiemengsel voor elke verdunning door twee microliter SNAP-buffer te mengen met vier microliter BG-oligonucleotide en vier microliter SNAP T7 RNAP. Bereid de RNAP-controle voor door het oligonucleotide te vervangen door dubbel gedestilleerd water en de DNA-controle door de SNAP T7 RNAP te vervangen door dubbel gedestilleerd water.Stel 11 reacties in door twee microliter van elk monster toe te voegen aan vier microliter SNAP-buffer en twee microliter eiwitbeladingskleurstof per monster. Verwarm de reacties gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius, voordat u twee microliter van elk monster op een vier tot 12% glasachtige eiwitgel laadt voor 35 minuten gel-elektroforese op ijs op 200 volt. Was aan het einde van de run de gel met drie wateruitwisselingen op een shaker gedurende ten minste 10 minuten per wasbeurt, gevolgd door nucleïnezuurkleuring met cyaninekleurstof gedurende 15 minuten.Stel de gel voor op een geschikt gelbeeldvormingssysteem en kleur de gel opnieuw met 20 milliliter Coomassie-blauw. Na een uur, de-stain met dubbel gedestilleerd water gedurende ten minste een uur voordat de gel opnieuw wordt afgebeeld. Voor oligonucleotide-gebonden SNAP T7-zuivering bereidt u eerst een elutiebuffer door 50 microliter van één molair spoor te mengen met 100 microliter vijf molair natriumchloride, met 850 microliter dubbel gedestilleerd water.Plaats vervolgens één ionenuitwisselingskolom per monster in afzonderlijke centrifugebuizen van twee milliliter en was de kolommen met zuiveringsbuffer door centrifugatie totdat alle buffer uit elke kolom is geëlueerd. Verdun elk monster met zuiveringsbuffer met een verhouding van drie op één zuiveringsbuffer tot monster en laad 400 microliter monster in elke kolom. Wanneer alle buffer is geëlueerd zoals gedemonstreerd, verzamelt en labelt u de doorstroom voor elk monster.Was de kolommen driemaal met 400 microliter zuiveringsbuffer per wasbeurt totdat alle buffers per wasgoed zijn geëlueerd, waarbij de doorstroom wordt verzameld en geëtiketteerd. Verzamel na de laatste wasbeurt het geëlueerde eiwit door 50 microliter elutiebuffer in het midden van de kolom toe te voegen en de kolom drie keer te centrifugeren totdat alle 50 microliter buffer is geëlueerd. Verzamel en label de elute na elke centrifugatie, bundel de elute in een enkele buis na de laatste centrifugatie, terwijl een klein volume van elke elute overblijft voor gelanalyse.Meet de absorptie van de resterende elute aliquots op 260 en 280 nanometer en voeg glycerol toe aan de monsters in een één-op-één verhouding voor min 20 graden opslag tot hun gebruik. Gebruik een 500 microliter 30 kilodalton centrifische filtereenheid om het totale eluutproduct te bufferen met 2x opslagbuffer. En meet de absorptie zoals aangetoond.Voeg vervolgens glycerol toe aan het product in een één-op-één verhouding voor opslag van min 20 graden Celsius. Om de eluten door SDS-PAGE te beoordelen, voert u de monsters in een geschikte eiwitladder uit op een glasvochtgel van vier tot 12% gedurende 35 minuten bij 200 volt, of totdat de voorkant van de kleurstof naar het uiteinde van de gel migreert. Om de on-demand controleactiviteit van de vastgebonden RNAP te demonstreren, mengt u 2,4 microliter van elke sjabloon met vijf microliter 5x gloeibuffer en 14,2 microliter dubbel gedestilleerd water.Incubeer de resulterende micromolaire dubbelstrengs DNA CAGE bij 75 graden Celsius gedurende twee minuten. En gloei de zintuiglijke en anti-zintuig stammen van de promotor en malachiet groene aptamer DNA sjabloon op dezelfde manier als aangegeven in de tabel. Voeg aan het einde van de incubaties de vastgebonden SNAP T7 RNAP toe aan de dubbelstrengs DNA CAGE met een één tot vijf molaire verhouding tot een uiteindelijke concentratie van 500 nanomolaire RNAP.Plaats het monster na 15 minuten bij kamertemperatuur op ijs en meng 2,5 microliter 10x in vitro transcriptiebuffer met één microliter ribonucleosidetrifosfaat, één microliter van één millimolair malachietgroen, 2,5 microliter van het RNAP CAGE-mengsel, 2,5 microliter elk van één micromolaire transcriptiefactoren A en B oligonucleotiden strengen; en drie microliter van één millimolachietgroen aptameersjabloon in 10 microliter dubbel gedestilleerd water. Zet in 15 microliter dubbel gedestilleerd water een tweede reactie op met 2,5 microliter 10x in vitro transcriptiebuffer, één microliter 25 millimolar ribonucleoside trifosfaatmengsel, één microliter één millimolair malachietgroen, 2,5 microliter van het RNAP CAGE-mengsel en drie microliter van één millimolair malachietgroen aptaamerensjabloon. Om een reactie op te zetten die alleen buffer bevat, mengt u 2,5 microliter 10x in vitro transcriptiebuffer, één microliter 25 millimolar ribonucleoside trifosfaatmengsel, één microliter van één millimolabar malachietgroen en drie microliter van één millimolachietgroen aptameersjabloon in 17,5 microliter dubbel gedestilleerd water.Wanneer alle reacties zijn voorbereid, breng je elke reactie over naar een 384-well-plaat en controleer je de malachietgroene aptamertranscriptie op een fluorescentieplaatlezer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius bij een excitatie van 610 nanometer en een emissie van 655 nanometer. Plaats aan het einde van de meting de plaat op ijs en laat het RNA-product uit elke put in een denaturerende 12% TBE-ureum polyacrylgel in 70 graden Celsius TBE-buffer op 280 volt gedurende 20 minuten, of totdat de kleurstofvoorzijde het einde van de gel bereikt. Kleur vervolgens de gel met cyaninekleurstof nucleïnezuurvlek gedurende 10 minuten op een orbitale shaker, voordat beeldvorming zoals aangetoond.Een succesvolle expressie en zuivering van het recombinante SNAP T7 RNAP-eiwit kan worden bevestigd met SDS-PAGE. Na SDS-PAGE kan de enzymatische activiteit worden gevalideerd door een in vitro transcriptiereactie. Succesvolle koppeling van BG gefunctionaliseerde oligonucleotiden kan worden geverifieerd via 18% denaturering TBE-ureum PAGE.Vergeleken met het ongewijzigde oligonucleotide verhoogt de toevoeging van het BG-deel aan het oligonucleotide het molecuulgewicht. Zoals waargenomen in deze representatieve cyaninekleurstofkleuringsgel om DNA-gebonden T7 RNAP-zuivering van overtollige BG-oligonucleotiden te bevestigen, bevatte de initiële stroom doorfractie meestal overtollig BG-oligonucleotide, evenals een klein deel van het DNA-gebonden polymerase dat niet aan de kationenuitwisselingshars bond. De poolverdunningsfracties bevatten alleen de enkele band van RNAP oligo veroorzaakt door de cyaninekleurstofbinding aan de oligonucleotide tether, waarbij de up-concentrated product lane dezelfde, maar donkerdere band vertoonde die een succesvolle up-concentratie aangeeft.Dezelfde patronen worden waargenomen door Coomassie blue staining, met een kleine gelmobiliteitsverschuiving waargenomen in de niet-geconjugeerde RNAP-controle. Hier wordt een fluorescerend signaal getoond dat aan het einde van de in vitro transcriptie in real-time kinetiek wordt geproduceerd. In deze analyse werd een 336-voudige activering in fluorescentiesignaal waargenomen, wat een robuuste controle van polymeraseactiviteit aantoont.Wanneer u dit protocol probeert, vergeet dan niet om SDS grondig van de gel te wassen voordat u nucleïnezuurkleuring maakt. Dit komt omdat STS de kleurstof in de gel zal vangen, wat resulteert in een hoog achtergrondsignaal. Het toepassen van onze methode op een groot gencircuit met meerdere cascades zal de schaalbaarheid en composability van het tethered transcriptiesysteem aantonen.Deze techniek wordt momenteel gebruikt om gencircuits te ontwikkelen die in staat zijn tot berekening in neurale netwerkstijl.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Aanpassing van een haptische robot in een 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Vergadering van Semi-kunstmatige moleculaire machine en het gebruik ervan voor de detectie van DNA-schade

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Ontwikkeling van Amelogenine-chitosan Hydrogel voor<em&gt; In Vitro</em&gt; Emaille Hergroei met een dichte Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatische test te meten transcriptie Remming van gallium (III) en H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Met behulp van synthetische biologie levende cellen Engineer die interface met programmeerbare Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimalisatie van een Multiplex RNA gebaseerde expressie-Assay met behulp van borst kanker archiefmateriaal

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...