Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

L.Y.T.C מכיר בתמיכה נדיבה מהחזיתות החדשות בקרן המחקר-חקר (NFRF-E), מענק דיסקברי של המועצה למדעי הטבע והנדסה של קנדה (NSERC) ואוניברסיטת טורונטו לרפואה על ידי יוזמת עיצוב, המקבלת מימון מהקרן למצוינות במחקר הראשון בקנדה (CFREF).

1. הכנת מאגר
הערה: הכנת מאגר טיהור חלבון יכולה להתרחש בכל יום; כאן, זה נעשה לפני תחילת הניסויים.
<ol><li>הכן מאגר תמוגה/שיווי משקל המכיל 50 מ"מ טריס (הידרוקסימתיל)אמינומטן (טריס), 300 מ"מ נתרן כלורי (NaCl), 5% גליצריל ו-5 מ"מ β-מרצפטואתנול (BME), pH 8. הוסף 1.5 מ"ל של 1M טריס, 1.8 מ"ל של 5M NaCl, 1.5 מ"ל של גל?...

<ol>
	<li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks.">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li><li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li><li>Chen, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA.">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li><li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+gene+networks.">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li><li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing:+advances+and+prospects.">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li><li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes.">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li><li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer.">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li><li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Mart&#237;nez-P&#233;rez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing:+A+multiobjective+evolutionary+approach.">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li><li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands:+enhanced+models,+scalability,+and+speed.">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li><li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+costs:+Data.">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li><li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics.">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA.">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li><li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage.">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).</li><li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DNA+to+power+nanostructures.">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li><li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA.">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li><li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems.">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li><li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement.">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).</li><li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -. B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handhold-mediated+strand+displacement:+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions.">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li><li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors.">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li><li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles.">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).</li><li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits.">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li><li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.8+&#197;+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11.">2.8 &#197; crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. 301 (1), 117-128 (2000).</li><li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors.">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li><li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis.">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li><li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors.">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li><li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+elongation,+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase.">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li><li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li><li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortase-tag+expressed+protein+ligation:+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step.">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li><li>Zhang, W. -. B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li></ol>

מחקר זה מדגים גישה בהשראת ננוטכנולוגיה DNA כדי לשלוט על הפעילות של T7 RNA פולימראז על ידי צימוד covalently SNAP רקומביננט T7 RNAP עם אוליגונוקלאוטיד פונקציונלי BG, אשר שימש לאחר מכן לתכנת תגובות TMDSD. על ידי עיצוב, SNAP-תג היה ממוקם ב N-terminus של פולימראז, כמו C-terminus של סוג בר T7 RNAP קבור בתוך הליבה מבנה החלבון ועושה...

מחשוב דנ"א משתמש בערכה של אוליגונוקלאוטידים מעוצבים כמדיום לחישוב. אוליגונוקלאוטידים אלה מתוכנתים עם רצפים להרכבה דינמית על פי לוגיקה שצוינה על-ידי המשתמש ולהגיב לכניסות ספציפיות של חומצת גרעין. במחקרי הוכחת הרעיון, הפלט של החישוב מורכב בדרך כלל מסט של אוליגונוקלאוטידים שכותרתם פלואורסצנטית שניתן לזהות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל או קוראי לוחות פלואורסצנטיות. במהלך 30 השנים האחרונות, מעגלים חישוביים DNA מורכבים יותר ויותר הודגמו, כגון מפלי לוגיקה דיגיטלית שונים, רשתותתגובהכימית, ורשתות עצביות 1,2,3. כדי לסייע בהכנת מעגלי DNA אלה, מודלים מתמטיים שימשו לחיזוי הפונקציונליות של מעגלי גנים סינתטיים4,5, וכלים חישוביים פותחו עבור עיצוב רצף DNA אורתוגונל6,7,8,9,10 . בהשוואה למחשבים מבוססי סיליקון, היתרונות של מחשבי DNA כוללים את יכולתם להתממשק ישירות עם ביומולקולים, לפעול בפתרון בהיעדר ספק כוח, כמו גם את הקומפקטיות והיציבות הכוללות שלהם. עם הופעתו של רצף הדור הבא, העלות של סינתזה של מחשבי DNA כבר יורדת בשני העשורים האחרונים בקצב מהר יותר מאשר חוק מור11. יישומים של מחשבים מבוססי DNA כאלה מתחילים כעת לצוץ, כגון לאבחון מחלות12,13, להפעלת ביופיסיקה מולקולרית14, וכפלטפורמות אחסון נתונים15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> איור 1:מנגנון של תזוזת גדיל DNA בתיווך דריסת רגל. דריסת הבוהן, δ, היא רצף חופשי ולא מאוגד על דופלקס חלקי. כאשר תחום משלים (δ*) מוצג על גדיל שני, הדומיין δ החופשי משמש דריסת רגל להכלאה, ומאפשר לשאר הגדיל (ɑ*) לעקור לאט את המתחרה שלו באמצעות תגובה הפיכה רוכסת / בלתי מתפשרת המכונה העברת גדילים. ככל שאורך δ גדל, ה- ΔG לתגובה הקדמית פוחת, והעקירה מתרחשת ביתר קלות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עד כה, רוב מחשבי הדנ"א משתמשים במוטיב מבוסס היטב בתחום הננוטכנולוגיה הדינמית של הדנ"א המכונה עקירת גדיל DNA בתיווך בוהן (TMDSD, איור 1)16. מוטיב זה מורכב דופלקס DNA כפול תקוע חלקית (dsDNA) המציגים overhangs קצרים "דריסת רגל" (כלומר, 7- עד 10 נוקלאוטידים (nt)). גדילי "קלט" חומצת גרעין יכולים לקיים אינטראקציה עם הדופלקסים החלקיים דרך דריסת המכהן. זה מוביל לעקירתו של אחד הגדילים מהדופלקס החלקי, והגדיל המשוחרר הזה יכול לשמש כקלט לדופלקסים חלקיים במורד הזרם. לכן, TMDSD מאפשרת סילוק את אותות ועיבוד מידע. באופן עקרוני, מוטיבים אורתוגונליים של TMDSD יכולים לפעול באופן עצמאי בפתרון, ומאפשרים עיבוד מידע מקביל. היו מספר וריאציות על תגובת TMDSD, כגון החלפת גדיל DNA בתיווך דריסת רגל (TMDSE)17, דריסות "ללא דליפות" עם תחומים ארוכים כפולים18, דריסות רצף לא תואמות19, ו "אחיזת יד", עקירת גדילים בתיווך20. עקרונות עיצוב חדשניים אלה מאפשרים אנרגטיות ודינמיקה של TMDSD מכוונות יותר לשיפור ביצועי מחשוב ה- DNA.
מעגלי גנים סינתטיים, כגון מעגלי גנים תמלול, מסוגלים גם לחשב21,22,23. מעגלים אלה מוסדרים על ידי גורמי שעתוק חלבונים, המפעילים או מדחיקים שעתוק של גן על ידי קשירה לאלמנטים ספציפיים של DNA רגולטורי. בהשוואה למעגלים מבוססי דנ"א, למעגלי התמלול יש מספר יתרונות. ראשית, לתעתיק אנזימטי יש שיעור תחלופה גבוה בהרבה ממעגלי ה- DNA הקטליטיים הקיימים, ובכך יוצר יותר עותקים של פלט לכל עותק יחיד של קלט ומספק אמצעי יעיל יותר להגברת אותות. בנוסף, מעגלי שעתוק יכולים לייצר מולקולות פונקציונליות שונות, כגון aptamers או קידוד RNA שליח (mRNA) עבור חלבונים טיפוליים, כמו יציאות חישוב, אשר ניתן לנצל עבור יישומים שונים. עם זאת, מגבלה מרכזית של מעגלי התמלול הנוכחיים היא חוסר המדרגיות שלהם. הסיבה לכך היא שיש קבוצה מוגבלת מאוד של גורמי שעתוק מבוססי חלבון אורתוגונל, ועיצוב דה נובו של גורמי שעתוק חלבונים חדשים נשאר מאתגר מבחינה טכנית וגוזל זמן רב.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> איור 2: הפשטה ומנגנון של קומפלקס פולימראז "לקשור" ו"כלוב". (A ו- B) קשירה אוליגונוקלאוטיד מסומנת באופן אנזימטי לפולימראז T7 באמצעות תגובת SNAP-tag. כלוב המורכב ממקדם T7 "מזויף" עם תוחם משלים קשירה מאפשר לו להתיידד לקשירה ולחסום פעילות שעתוק. (C)כאשר המפעיל (a*b*) קיים, הוא נקשר לאיכות הבוהן על הרצועה אוליגונוקלאוטיד (ab) ומזיז את אזור b * של הכלוב, ומאפשר שעתוק להתרחש. נתון זה שונה מצ'ו ושי27. קיצורים: RNAP = RNA פולימראז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מאמר זה מציג אבן בניין חדשנית למחשוב מולקולרי המשלבת את הפונקציות של מעגלי שעתוק עם מדרגיות של מעגלים מבוססי DNA. אבן בניין זו היא T7 RNAP המחוברת באופן קוולנטי עם רצועת DNA חד-גדילית(איור 2A). כדי לסנתז את ה-T7 RNAP הזה, הפולימראז הותך לתגSNAP-24 של N-terminal והתבטא מחדש באשריצ'יה קולי. תג SNAP הגיב אז עם אוליגונוקלאוטיד פונקציונלי עם מצע BG. הרצועה אוליגונוקלאוטיד מאפשרת מיקום של אורחים מולקולריים בסמיכות לפולימראז באמצעות הכלאת DNA. אורח אחד כזה היה חוסם תמלול תחרותי המכונה "כלוב", המורכב ודופלקס DNA "מזויף" של מקדם T7 ללא גנים במורד הזרם(איור 2B). כאשר הוא מאוגד לרנ"פ באמצעות קשירת האוליגונוקלאוטיד שלו, הכלוב מעכב פעילות פולימראז על ידי אי-התאמה של תבניות DNA אחרות עבור כריכת RNAP, ועיבוד ה-RNAP במצב "כבוי"(איור 2C).
כדי להפעיל את הפולימראז למצב "ON", תוכננו תבניות DNA T7 עם תחומי "אופרטור" חד-גדיליים במעלה הזרם של מקדם T7 של הגן. תחום המפעיל (כלומר, תחום a*b* איור 2C) יכול להיות מתוכנן לעקור את הכלוב מה- RNAP באמצעות TMDSD ולמקם את ה- RNAP הקרוב למקדם T7 של הגן, ובכך ליזום שעתוק. לחלופין, תבניות DNA תוכננו גם כאשר רצף המפעיל היה משלים לגדילי חומצת גרעין עזר המכונים "גורמי שעתוק מלאכותיים" (כלומר, גדילי TFA ו- TFB באיור 3A). כאשר שני גדילים מוצגים לתוך התגובה, הם יתאספו באתר המפעיל, יצירת תחום פסאודו-רציף חדש a *b*. תחום זה יכול לאחר מכן לעקור את הכלוב באמצעות TMDSD כדי ליזום תמלול (איור 3B). גדילים אלה יכולים להיות מסופקים או אקסוגני או מיוצר.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> איור 3: תכנות סלקטיבי של פעילות פולימראז באמצעות מפעיל מתג בעל שלושה רכיבים. (A)כאשר קיימים גורמי התמלול (TFA ו- TFB), הם נקשרים לתחום המפעיל במעלה הזרם של המקדם, ויוצרים רצף פסאודו חד-גדילי (a*b*) המסוגל לעקור את הכלוב באמצעות תזוזת דנ"א מתווכת. (B)תחום a*b* זה יכול לעקור את הכלוב באמצעות TMDSD כדי ליזום תמלול. נתון זה שונה מצ'ו ושי27. קיצורים: TF = גורם שעתוק; RNAP = RNA פולימראז; TMDSD = תזוזת גדיל DNA בתיווך דריסת רגל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
השימוש בגורמי שעתוק מבוססי חומצת גרעין עבור ויסות תמלול במבחנה מאפשר יישום מדרגי של התנהגויות מעגל מתוחכמות כגון לוגיקה דיגיטלית, משוב, ומדדי אותות. לדוגמה, ניתן לבנות מפלי שער לוגיים על ידי תכנון רצפי חומצות גרעין כך שהתעתיקים מגן במעלה הזרם מפעילים גן במורד הזרם. יישום אחד המנצל את המדורגים והמכפילים המסוגלים בטכנולוגיה מוצעת זו הוא פיתוח מעגלי מחשוב מולקולריים מתוחכמים יותר לאבחון נייד ועיבוד נתונים מולקולריים. בנוסף, שילוב יכולות המחשוב המולקולרי וסינתזת דה נובו RNA יכול לאפשר יישומים חדשים. לדוגמה, ניתן לתכנן מעגל מולקולרי כדי לזהות אחד או שילוב של RNAs המוגדרים על-ידי המשתמש כתשומות ופלט של RNAs טיפוליים או mRNAs המקודדים פפטידים פונקציונליים או חלבונים עבור יישומים רפואיים נקודתיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

ננוטכנולוגיה של DNA מאפשרת הרכבה עצמית ניתנת לתכנות של חומצות גרעין לצורות ודינמיקה שנקבעו על ידי המשתמש עבור יישומים מגוונים. עבודה זו מדגימה כי מושגים מננוטכנולוגיה DNA ניתן להשתמש כדי לתכנת את הפעילות אנזימטית של פולימראז T7 RNA נגזר phage (RNAP) ולבנות רשתות רגולטוריות גנים סינתטיים מדרגיים. ראשית, T7 RNAP הקשור לאוליגונוקלאוטיד מתוכנן באמצעות ביטוי של RNAP מתויג N-סופני SNAP וצימוד כימי לאחר מכן של תג SNAP עם אוליגונוקלאוטיד בנצילגואנין (BG). לאחר מכן, עקירת גדיל חומצת גרעין משמשת לתכנות שעתוק פולימראז לפי דרישה. בנוסף, מכלולי חומצת גרעין עזר יכולים לשמש "גורמי שעתוק מלאכותיים" כדי לווסת את האינטראקציות בין RNAP T7 מתוכנת DNA עם תבניות ה- DNA שלה. מנגנון רגולציה זה של תמלול במבחנה יכול ליישם מגוון התנהגויות מעגלים כגון לוגיקה דיגיטלית, משוב, מדורג ומולטיפלקסינג. המורכבות של ארכיטקטורה רגולטורית זו של הגנים מאפשרת הפשטה, סטנדרטיזציה ושינוי קנה מידה של עיצוב. תכונות אלה יאפשרו יצירת סוג של מכשירים גנטיים במבחנה עבור יישומים כגון חישה ביולוגית, זיהוי מחלות ואחסון נתונים.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> איור 5: ניתוח SDS-PAGE של ביטוי SNAP T7 RNAP ובבדיית תמלול במבחנה. (A)SNAP T7 RNAP ניתוח טיהור חלבון, SNAP T7 RNAP משקל מולקולרי: 119.4kDa. FT = זרימה דרך מהעמודה, W1 = שברי אלוטציה של מאגר כביסה המכיל זיהומים, E1-3 = שברי אלו?...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

אנו מתארים את ההנדסה של פולימראז T7 RNA חדשני הקשור לדנ"א כדי לווסת את תגובות התמלול במבחנה. אנו דנים בצעדים לסינתזה ואפיון חלבונים, מאמתים רגולציה של תמלול הוכחת הרעיון, ודנים ביישומיה במחשוב מולקולרי, אבחון ועיבוד מידע מולקולרי.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

אנו מציעים שיטה לוויסות פעילות פולימראז באמצעות גורמי שעתוק חומצת גרעין מלאכותית. ארכיטקטורה רגולטורית גנים זו יכולה לשמש אבן בניין למכשירים גנטיים במבחנה בעתיד. על ידי קשירת תחום כריכת DNA לפולימראז T7 RNA, טכניקה זו משלבת את המדרגיות של מעגלים מבוססי DNA, עם הפונקציונליות של מעגלי שעתוק.התחל על ידי ביצוע תשעה דילול של oligonucleotide BG נטוש יחיד לנפח סופי של 50 microliters של מים מזוקקים כפולים, מחמש לאחד עד חמישה יחסים, כפי שצוין בטבלה. הכן תערובת תגובה אחת עבור כל דילול על ידי ערבוב שני microliters של חיץ SNAP עם ארבעה microliters של BG אוליגונוקלאוטיד, וארבעה microliters של SNAP T7 RNAP. הכן את בקרת הרנ"א על ידי החלפת האוליגונוקלאוטיד במים מזוקקים כפולים, ובקרת ה- DNA על ידי החלפת SNAP T7 RNAP במים מזוקקים כפולים.הגדר 11 תגובות על-ידי הוספת שני מיקרוליטרים של כל דגימה לארבעה מיקרוליטרים של חיץ SNAP, ושני מיקרוליטרים של צבע טעינת חלבונים לכל דגימה. מחממים את התגובות במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס, לפני טעינת שני microliters של כל מדגם על ג'ל חלבון זגוך ארבעה עד 12% במשך 35 דקות של אלקטרופורזה ג'ל על קרח ב 200 וולט. בסוף הריצה, לשטוף את הג'ל עם שלושה חילופי מים על שייקר לפחות 10 דקות לכל לשטוף, ואחריו חומצת גרעין מכתים עם צבע ציאנין במשך 15 דקות.דמיין את הג'ל במערכת הדמיית ג'ל מתאימה, והכתים שוב את הג'ל עם 20 מיליליטר של כחול קומאסי. לאחר שעה, דה כתם עם מים מזוקקים כפולים לפחות שעה אחת לפני הדמיה הג'ל שוב. לטיהור SNAP T7 הקשור לאוליגונוקלאוטיד, ראשית, הכינו חיץ חצץ אלוטציה על ידי ערבוב 50 מיקרוליטרים של עקבות טוחנת אחת, עם 100 מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי טוחן, עם 850 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים.לאחר מכן, מקם עמודת חילופי יונים אחת לכל דגימה לצינורות צנטריפוגה בודדים של שני מיליליטר, ושטוף את העמודים עם מאגר טיהור על ידי צנטריפוגה עד שכל המאגר נפרץ מכל עמודה. לדלל כל דגימה עם מאגר טיהור במאגר טיהור של שלושה לאחד ליחס מדגם, ולטעון 400 מיקרוליטרים של מדגם לכל עמודה. כאשר כל המאגר נפרץ כפי שהודגם, לאסוף ולתייג את הזרימה דרך עבור כל מדגם.לשטוף את העמודים שלוש פעמים עם 400 microliters של חוצץ טיהור לכל לשטוף עד כל המאגר כבר eluted לכל לשטוף, איסוף ותיוג הזרימה דרך לפי הצורך. לאחר הכביסה האחרונה, לאסוף את החלבון eluted על ידי הוספת 50 microliters של חוצץ elution למרכז העמודה, ו centrifuging את העמודה שלוש פעמים עד כל 50 microliters של חוצץ כבר eluted. לאסוף ולתייג את חמקן לאחר כל צנטריפוגה, לאגד את חמקן לתוך צינור יחיד לאחר centrifugation האחרון, תוך השארת נפח קטן של כל לחמוק לניתוח ג'ל.למדוד את הספיגה של aliquots האלוט הנותרים ב 260 ו 280 ננומטר, ולהוסיף גליצריל לדגימות ביחס של אחד לאחד עבור מינוס 20 מעלות אחסון עד השימוש בהם. השתמש ביחידת מסנן צנטרילית 500 מיקרוליטר 30 קילודלטון כדי לאגור את המוצר האלוט הכולל עם מאגר אחסון 2x. ולמדוד את הספיגה כפי שהודגם.לאחר מכן להוסיף גליסול למוצר ביחס של אחד לאחד עבור מינוס 20 מעלות צלזיוס אחסון. כדי להעריך את האלוטות על ידי SDS-PAGE, הפעל את הדגימות בסולם חלבונים מתאים על ג'ל זגמי 4 עד 12% למשך 35 דקות ב 200 וולט, או עד שחזית הצבע נודדת לסוף הג'ל. כדי להדגים את פעילות הבקרה לפי דרישה של הרנ"פ קשור, מערבבים 2.4 מיקרוליטרים של כל תבנית עם חמישה מיקרוליטרים של חישול פי 5, ו-14.2 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים.לדגור על כלוב DNA כפול תקוע מיקרומולרי אחד ב 75 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. ותבנית ה-DNA של האפטאמר הירוק של האמר המקדם והמלצ'יט באותו אופן כמו המצוין בטבלה. בסוף הדגירה, הוסף את SNAP T7 RNAP קשור לכלוב ה- DNA התקוע הכפול ביחס טוחנת אחת עד חמש לריכוז סופי של RNAP ננומולרי 500.לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הדגימה על קרח, ומערבבים 2.5 מיקרוליטרים של 10x במאגר תמלול במבחנה עם מיקרוליטר אחד של 25 מילימולרי ריבונוקלאוזיד טריפוספט, מיקרוליטר אחד של ירוק מלאכיט מילימולרי אחד, 2.5 מיקרוליטרים של תערובת כלוב RNAP, 2.5 מיקרוליטרים כל אחד מגורמי שעתוק מיקרומולרי אחד A ו- B oligonucleotides גדילים, ושלושה מיקרוליטרים של תבנית אפטאמר ירוקה מילימילילית אחת ב-10 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים. ב 15 microliters של מים מזוקקים כפולים, להגדיר תגובה שנייה המכילה 2.5 microliters של 10x במאגר תמלול במבחנה, microliter אחד של 25 מילימילימטרים ריבונוקלאוזיד טריפוספט, מיקרוליטר אחד של מילימטר אחד ירוק מלכיט, 2.5 microliters של תערובת כלוב RNAP, ושלושה microliters של תבנית aptamer ירוק malachite מילימולר. כדי להגדיר תגובה המכילה חוצץ בלבד, לערבב 2.5 microliters של 10x במאגר תמלול במבחנה, מיקרוליטר אחד של תערובת טריפוספט ריבונוקלאוזיד 25 מילימולר, מיקרוליטר אחד של ירוק מלאכיט מילימטרי אחד, ושלושה מיקרוליטרים של תבנית aptamer ירוק מלאכיט מילימילימטר אחד ב 17.5 microliters של מים מזוקקים כפולים.כאשר כל התגובות הוכנו, העבר כל תגובה ללוח 384 באר, ונטר את תמלול האפטאמר הירוק המלכי על קורא לוחות פלואורסצנטי במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס ב 610 ננומטר עירור, ופליטת 655 ננומטר. בסוף הקריאה, מניחים את הצלחת על קרח, ומפעילים את מוצר ה-RNA מכל באר בג'ל פוליאקרילי 12%TBE-אוריאה ב-70 מעלות צלזיוס TBE חוצץ ב-280 וולט למשך 20 דקות, או עד שחזית הצבע מגיעה לסוף הג'ל. לאחר מכן, להכתים את הג'ל עם כתם חומצת גרעין צבע ציאנין במשך 10 דקות על שייקר מסלולית, לפני הדמיה כפי שהודגם.ביטוי מוצלח וטיהור של חלבון SNAP T7 RNAP רקומביננטי ניתן לאשר באמצעות SDS-PAGE. לאחר SDS-PAGE, הפעילות אנזימטית יכולה להיות מאומתת על ידי תגובת תמלול במבחנה. צימוד מוצלח של אוליגונוקלאוטידים פונקציונליים BG ניתן לאמת באמצעות 18%denaturing TBE-urea PAGE.בהשוואה לאוליגונוקלאוטיד שלא שודר, התוספת של ה- BG moiety לאוליגונוקלאוטיד מגדילה את משקלו המולקולרי. כפי שנצפה זה ג'ל כתם ציאנין מייצג כדי לאשר טיהור T7 RNAP קשור DNA מעודף BG אוליגונוקלאוטידים, הזרימה הראשונית דרך שבר הכיל בעיקר עודף BG אוליגונוקלאוטיד, כמו גם חלק קטן של פולימראז הקשור ל- DNA כי לא נקשר שרף חילופי cation. שברי דילול הבריכה הכילו רק את הרצועה היחידה של אוליגו RNAP הנגרמת על ידי צבע ציאנין המחייב את חבל האוליגונוקלאוטיד, כאשר נתיב המוצר המרוכז מציג את אותו הדבר, אך רצועת כהה יותר המסמלת ריכוז גבוה מוצלח.אותם דפוסים נצפים על ידי כתמים כחולים Coomassie, עם שינוי ניידות ג'ל קטן נצפתה בקרת RNAP לא מצומד. כאן, אות פלואורסצנטי המיוצר בסוף תמלול במבחנה בקינטיקה בזמן אמת מוצגים. בניתוח זה נצפתה הפעלה של פי 336 באות פלואורסצנטיות, המדגימה שליטה חזקה בפעילות הפולימראז.בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לשטוף ביסודיות SDS את הג'ל לפני כתמי חומצת גרעין. הסיבה לכך היא STS יהיה ללכוד את הצבע בג'ל, וכתוצאה מכך אות רקע גבוה. החלת השיטה שלנו על מעגל גנים גדול עם מפלים מרובים תראה את המדרגיות ואת קומפוזיציה של מערכת שעתוק קשור.טכניקה זו משמשת כיום לפיתוח מעגלי גנים המסוגלים לחישוב בסגנון רשת עצבית.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

ההסתגלות של רובוט לתחושה ב fMRI 3T

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

פיתוח של Hydrogel Amelogenin-chitosan עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; אמייל לצמיחה מחודשת עם ממשק צפוף

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...