Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

L.Y.T.C riconosce il generoso sostegno del New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant e della Medicine by Design Initiative dell'Università di Toronto, che riceve finanziamenti dal Canada First Research Excellence Fund (CFREF).

1. Preparazione del buffer
NOTA: la preparazione del tampone di purificazione delle proteine può avvenire in qualsiasi giorno; qui, è stato fatto prima di iniziare gli esperimenti.
<ol><li>Preparare un tampone di lisi/equilibrazione contenente 50 mM di tris (idrossimetil)amminometano (Tris), 300 mM di cloruro di sodio (NaCl), 5% di glicerolo e 5 mM di β-mercaptoetanolo (BME), pH 8. Aggiungere 1,5 mL di 1M Tris, 1,8 mL di 5M NaCl, 1,5 mL di glicerolo, 25,2 mL di acqua deionizzata (ddH...

<ol>
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Questo studio dimostra un approccio ispirato alla nanotecnologia del DNA per controllare l'attività della T7 RNA polimerasi accoppiando covalentemente un RNAP T7 ricombinante N-terminale con tag SNAP con un oligonucleotide funzionalizzato BG, che è stato successivamente utilizzato per programmare reazioni TMDSD. In base alla progettazione, lo SNAP-tag è stato posizionato al N-terminus della polimerasi, poiché il C-terminus del wild-type T7 RNAP è sepolto all'interno del nucleo della struttura proteica e stabilisce i...

Il calcolo del DNA utilizza un insieme di oligonucleotidi progettati come mezzo per il calcolo. Questi oligonucleotidi sono programmati con sequenze per assemblarsi dinamicamente secondo la logica specificata dall'utente e rispondere a specifici input di acido nucleico. Negli studi proof-of-concept, l'output del calcolo consiste tipicamente in un insieme di oligonucleotidi marcati fluorescentemente che possono essere rilevati tramite elettroforesi su gel o lettori di piastre di fluorescenza. Negli ultimi 30 anni sono stati dimostrati circuiti computazionali del DNA sempre più complessi, come varie cascate di logica digitale, reti di reazioni chimiche e reti neurali1,2,3. Per aiutare con la preparazione di questi circuiti del DNA, sono stati utilizzati modelli matematici per prevedere la funzionalità dei circuiti genici sintetici4,5e sono stati sviluppati strumenti computazionali per la progettazione di sequenze di DNA ortogonali6,7,8,9,10 . Rispetto ai computer a base di silicio, i vantaggi dei computer a DNA includono la loro capacità di interfacciarsi direttamente con le biomolecole, operare in soluzione in assenza di un alimentatore, nonché la loro compattezza e stabilità complessive. Con l'avvento del sequenziamento di nuova generazione, il costo della sintesi dei computer del DNA è diminuito negli ultimi due decenni a un ritmo più veloce della Legge11di Moore. Le applicazioni di tali computer basati sul DNA stanno ora iniziando ad emergere, come per la diagnosi delle malattie12,13, per alimentare la biofisica molecolare14e come piattaforme di archiviazione dei dati15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Figura 1: Meccanismo di spostamento del filamento di DNA mediato dalla morsa. Il punto d'appoggio, δ, è una sequenza libera e non legata su un duplex parziale. Quando un dominio complementare (δ*) viene introdotto su un secondo filamento, il dominio δ libero funge da punto d'appoggio per l'ibridazione, consentendo al resto del filamento (ɑ*) di spostare lentamente il suo concorrente attraverso una reazione reversibile di zipping/decompressione nota come migrazione del filamento. All'aumentare della lunghezza della δ, il ΔG per la reazione in avanti diminuisce e lo spostamento avviene più facilmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Ad oggi, la maggior parte dei computer del DNA utilizza un motivo ben consolidato nel campo della nanotecnologia dinamica del DNA noto come spostamento del filamento di DNA mediato dalla soglia (TMDSD, Figura 1)16. Questo motivo è costituito da un duplex di DNA parzialmente a doppio filamento (dsDNA) che mostra brevi sporgenze "toehold" (cioè da 7 a 10 nucleotidi (nt)). I filamenti di "input" dell'acido nucleico possono interagire con i duplex parziali attraverso il punto d'appoggio. Ciò porta allo spostamento di uno dei fili dal duplex parziale, e questo filamento liberato può quindi servire come input per i duplex parziali a valle. Pertanto, TMDSD consente la cascata del segnale e l'elaborazione delle informazioni. In linea di principio, i motivi TMDSD ortogonali possono operare indipendentemente in soluzione, consentendo l'elaborazione parallela delle informazioni. Ci sono state una serie di variazioni sulla reazione TMDSD, come lo scambio di filamenti di DNA mediato da trattenute (TMDSE)17,i punti di appoggio "senza perdite" con domini a doppia lunghezza18,i punti di riferimento non corrispondenti alla sequenza19e lo spostamento del filamento mediato da "handhold"20. Questi principi di progettazione innovativi consentono un'energetica e una dinamica TMDSD più finemente sintonizzate per migliorare le prestazioni di calcolo del DNA.
I circuiti genici sintetici, come i circuiti genici trascrizionali, sono anche in grado dicalcolare 21,22,23. Questi circuiti sono regolati da fattori di trascrizione proteica, che attivano o reprimono la trascrizione di un gene legandosi a specifici elementi regolatori del DNA. Rispetto ai circuiti basati sul DNA, i circuiti trascrizionali presentano diversi vantaggi. In primo luogo, la trascrizione enzimatica ha un tasso di turnover molto più elevato rispetto ai circuiti catalitici del DNA esistenti, generando così più copie di output per singola copia di input e fornendo un mezzo più efficiente di amplificazione del segnale. Inoltre, i circuiti trascrizionali possono produrre diverse molecole funzionali, come aptameri o RNA messaggero (mRNA) che codifica per proteine terapeutiche, come output di calcolo, che possono essere sfruttati per diverse applicazioni. Tuttavia, una delle principali limitazioni degli attuali circuiti trascrizionali è la loro mancanza di scalabilità. Questo perché esiste un insieme molto limitato di fattori di trascrizione ortogonali basati su proteine e la progettazione de novo di nuovi fattori di trascrizione proteica rimane tecnicamente impegnativa e dispendiosa in termini di tempo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Figura 2: Astrazione e meccanismo del complesso della polimerasi "tether" e "cage". (A e B) Un tether oligonucleotide è enzimaticamente etichettato in una polimerasi T7 attraverso la reazione SNAP-tag. Una gabbia costituita da un promotore T7 "finto" con una sporgenza del complemento di legame consente di ibridarsi al legame e bloccare l'attività trascrizionale. (C) Quando l'operatore (a*b*) è presente, si lega al punto d'appoggio sul legame oligonucleotidico (ab) e sposta la regione b* della gabbia, permettendo la trascrizione. Questa figura è stata modificata da Chou e Shih27. Abbreviazioni: RNAP = RNA polimerasi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo documento introduce un nuovo elemento costitutivo per il calcolo molecolare che combina le funzionalità dei circuiti trascrizionali con la scalabilità dei circuiti basati sul DNA. Questo blocco di costruzione è un T7 RNAP attaccato covalentemente con un legame di DNA a singolo filamento (Figura 2A). Per sintetizzare questo RNAP T7 legato al DNA, la polimerasi è stata fusa in un snap-tag24 N-terminale ed espressa in modo ricombinante in Escherichia coli. Lo SNAP-tag è stato quindi reagito con un oligonucleotide funzionalizzato con il substrato BG. Il tether oligonucleotidico consente il posizionamento di ospiti molecolari in prossimità della polimerasi tramite ibridazione del DNA. Uno di questi ospiti era un bloccante trascrizionale competitivo denominato "gabbia", che consiste in un "finto" duplex di DNA promotore T7 senza gene a valle (Figura 2B). Quando è legata all'RNAP tramite il suo legame oligonucleotidico, la gabbia blocca l'attività della polimerasi superando altri modelli di DNA per il legame RNAP, rendendo l'RNAP in uno stato "OFF" (Figura 2C).
Per attivare la polimerasi in uno stato "ON", sono stati progettati modelli di DNA T7 con domini "operatore" a singolo filamento a monte del promotore T7 del gene. Il dominio operatore (cioè il dominio a*b* Figura 2C) può essere progettato per spostare la gabbia dall'RNAP tramite TMDSD e posizionare l'RNAP prossimale al promotore T7 del gene, avviando così la trascrizione. In alternativa, sono stati progettati anche modelli di DNA in cui la sequenza dell'operatore era complementare ai filamenti ausiliari di acido nucleico che sono indicati come "fattori di trascrizione artificiale" (cioè filamenti TFA e TFB nella Figura 3A). Quando entrambi i filamenti vengono introdotti nella reazione, si assemblano nel sito dell'operatore, creando un nuovo dominio pseudo-contiguo a*b*. Questo dominio può quindi spostare la gabbia tramite TMDSD per avviare la trascrizione (Figura 3B). Questi fili possono essere forniti sia esogenamente che prodotti.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Figura 3: Programmazione selettiva dell'attività della polimerasi attraverso un attivatore a commutazione a tre componenti. (A) Quando i fattori di trascrizione (TFA e TFB) sono presenti, si legano al dominio operatore a monte del promotore, formando una pseudo sequenza a singolo filamento (a*b*) in grado di spostare la gabbia attraverso lo spostamento del DNA mediato dalla presa. (B) Questo dominio a*b* può spostare la gabbia tramite TMDSD per avviare la trascrizione. Questa figura è stata modificata da Chou e Shih27. Abbreviazioni: TF = fattore di trascrizione; RNAP = RNA polimerasi; TMDSD = spostamento del filamento di DNA mediato dalla punta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'uso di fattori di trascrizione basati su acidi nucleici per la regolazione trascrizionale in vitro consente l'implementazione scalabile di sofisticati comportamenti circuitali come la logica digitale, il feedback e la cascata del segnale. Ad esempio, si possono costruire cascate di gate logici progettando sequenze di acidi nucleici in modo tale che i trascritti di un gene a monte attivino un gene a valle. Un'applicazione che sfrutta il cascading e il multiplexing resi capaci da questa tecnologia proposta è lo sviluppo di circuiti di calcolo molecolare più sofisticati per la diagnostica portatile e l'elaborazione di dati molecolari. Inoltre, l'integrazione delle capacità di calcolo molecolare e di sintesi dell'RNA de novo può consentire nuove applicazioni. Ad esempio, un circuito molecolare può essere progettato per rilevare uno o una combinazione di RNA definiti dall'utente come input e output RNA terapeutici o mRNA che codificano peptidi funzionali o proteine per applicazioni mediche point-of-care.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

La nanotecnologia del DNA consente l'autoassemblaggio programmabile degli acidi nucleici in forme e dinamiche prescritte dall'utente per diverse applicazioni. Questo lavoro dimostra che i concetti della nanotecnologia del DNA possono essere utilizzati per programmare l'attività enzimatica della T7 RNA polimerasi derivata dai fagi (RNAP) e costruire reti di regolazione genica sintetica scalabili. In primo luogo, un RNAP T7 legato all'oligonucleotide viene ingegnerizzato tramite l'espressione di un RNAP con tag SNAP N-terminale e il successivo accoppiamento chimico del tag SNAP con un oligonucleotide modificato con benzilguanina (BG). Successivamente, lo spostamento del filamento di acido nucleico viene utilizzato per programmare la trascrizione della polimerasi su richiesta. Inoltre, gli assemblaggi di acidi nucleici ausiliari possono essere utilizzati come "fattori di trascrizione artificiale" per regolare le interazioni tra l'RNAP T7 programmato dal DNA con i suoi modelli di DNA. Questo meccanismo di regolazione della trascrizione in vitro può implementare una varietà di comportamenti circuitali come la logica digitale, il feedback, la cascata e il multiplexing. La componibilità di questa architettura di regolazione genica facilita l'astrazione, la standardizzazione e il ridimensionamento del design. Queste caratteristiche consentiranno la prototipazione rapida di dispositivi genetici in vitro per applicazioni quali il biorilevamento, il rilevamento di malattie e l'archiviazione dei dati.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Figura 5: Analisi SDS-PAGE dell'espressione di SNAP T7 RNAP e test di trascrizione in vitro. (A) Analisi di purificazione della proteina SNAP T7 RNAP, peso molecolare SNAP T7 RNAP: 119.4kDa. FT = flusso dalla colonna, W1 = frazioni di eluizione del tampone di lavaggio contenente impurità, E1-3 = frazioni di eluizione contenenti prodotto puri...

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DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

Descriviamo l'ingegneria di una nuova T7 RNA polimerasi legata al DNA per regolare le reazioni di trascrizione in vitro. Discutiamo i passaggi per la sintesi e la caratterizzazione proteica, convalidiamo la regolazione trascrizionale proof-of-concept e discutiamo le sue applicazioni nel calcolo molecolare, nella diagnostica e nell'elaborazione delle informazioni molecolari.

RNA polimerasi legata al DNA per la trascrizione in vitro programmabile e il calcolo molecolare

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Proponiamo un metodo per regolare l'attività della polimerasi utilizzando fattori di trascrizione dell'acido nucleico artificiale. Questa architettura di regolazione genica può servire come elemento costitutivo per i futuri dispositivi genetici in vitro. Legando un dominio di legame del DNA a una T7 RNA polimerasi, questa tecnica combina la scalabilità dei circuiti basati sul DNA con la funzionalità dei circuiti trascrizionali.Inizia facendo nove diluizioni di oligonucleotide BG a singolo filamento per un volume finale di 50 microlitri di acqua doppia distillata, da cinque a uno a uno a cinque rapporti, come indicato nella tabella. Preparare una miscela di reazione per ogni diluizione mescolando due microlitri di tampone SNAP con quattro microlitri di oligonucleotide BG e quattro microlitri di SNAP T7 RNAP. Preparare il controllo RNAP sostituendo l'oligonucleotide con acqua doppia distillata e il controllo del DNA sostituendo lo SNAP T7 RNAP con acqua doppia distillata.Impostare 11 reazioni aggiungendo due microlitri di ciascun campione a quattro microlitri di tampone SNAP e due microlitri di colorante a carico proteico per campione. Riscaldare le reazioni per 10 minuti a 70 gradi Celsius, prima di caricare due microlitri di ciascun campione su un gel proteico vitreo dal quattro al 12% per 35 minuti di elettroforesi su gel su ghiaccio a 200 volt. Alla fine della corsa, lavare il gel con tre scambi d'acqua su uno shaker per almeno 10 minuti per lavaggio, seguito da colorazione dell'acido nucleico con colorante al cianine per 15 minuti.Immagina il gel su un sistema di imaging del gel appropriato e colora di nuovo il gel con 20 millilitri di blu Coomassie. Dopo un'ora, demacchiare con acqua doppia distillata per almeno un'ora prima di visualizzare nuovamente il gel. Per la purificazione SNAP T7 legata agli oligonucleotidi, in primo luogo, preparare il tampone di eluizione mescolando 50 microlitri di una traccia molare, con 100 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari, con 850 microlitri di acqua doppia distillata.Quindi, posizionare una colonna di scambio ionico per campione in singoli tubi di centrifuga da due millilitri e lavare le colonne con tampone di purificazione mediante centrifugazione fino a quando tutto il tampone non è stato eluito da ciascuna colonna. Diluire ogni campione con tampone di purificazione a un rapporto tre a uno tampone di purificazione / campione e caricare 400 microlitri di campione in ogni colonna. Quando tutto il tampone è stato eluito come dimostrato, raccogliere ed etichettare il flusso per ciascun campione.Lavare le colonne tre volte con 400 microlitri di tampone di purificazione per lavaggio fino a quando tutto il tampone è stato eluito per lavaggio, raccogliendo ed etichettando il flusso attraverso come appropriato. Dopo l'ultimo lavaggio, raccogliere la proteina eluita aggiungendo 50 microlitri di tampone di eluizione al centro della colonna e centrifugando la colonna tre volte fino a quando tutti i 50 microlitri di tampone sono stati eluiti. Raccogliere ed etichettare l'eluto dopo ogni centrifugazione, raggruppando l'eluitore in un singolo tubo dopo l'ultima centrifugazione, lasciando un piccolo volume di ciascun eluito per l'analisi del gel.Misurare l'assorbanza delle aliquote elute rimanenti a 260 e 280 nanometri e aggiungere glicerolo ai campioni in un rapporto uno a uno per meno 20 gradi di conservazione fino al loro utilizzo. Utilizzare un'unità filtrante centrifica da 500 microlitri da 30 kilodalton per sostituire il buffer del prodotto elute totale con un buffer di stoccaggio 2x. E misurare l'assorbanza come dimostrato.Quindi aggiungere glicerolo al prodotto in un rapporto uno a uno per meno 20 gradi Celsius di conservazione. Per valutare gli eluiti da SDS-PAGE, eseguire i campioni in un'appropriata scala proteica su un gel vitreo dal quattro al 12% per 35 minuti a 200 volt, o fino a quando il fronte colorante migra verso l'estremità del gel. Per dimostrare l'attività di controllo su richiesta dell'RNAP legato, mescolare 2,4 microlitri di ciascun modello con cinque microlitri di tampone di ricottura 5x e 14,2 microlitri di acqua distillata doppia.Incubare il risultante un micromolare DNA CAGE a doppio filamento a 75 gradi Celsius per due minuti. E ricottura i ceppi sensoriali e anti-senso del promotore e del modello di DNA dell'aptamero verde malachite nello stesso modo indicato nella tabella. Alla fine delle incubazioni, aggiungere lo SNAP T7 RNAP legato alla CAGE a doppio filamento di DNA con un rapporto da uno a cinque molari a una concentrazione finale di 500 RNAP nanomolari.Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, posizionare il campione su ghiaccio e mescolare 2,5 microlitri di tampone di trascrizione in vitro 10x con un microlitro di 25 millimolari ribonucleoside trifosfato, un microlitro di un verde malachite millimolare, 2,5 microlitri della miscela RNAP CAGE, 2,5 microlitri ciascuno di un filamento di oligonucleotidi dei fattori di trascrizione micromolare A e B, e tre microlitri di un modello di aptamer verde malachite millimolare in 10 microlitri di acqua doppia distillata. In 15 microlitri di acqua doppia distillata, impostare una seconda reazione contenente 2,5 microlitri di 10x tampone di trascrizione in vitro, un microlitro di 25 millimolari ribonucleoside trifosfato miscela, un microlitro di un verde malachite millimolare, 2,5 microlitri della miscela RNAP CAGE e tre microlitri di un modello di aptamero verde malachite millimolare. Per impostare una reazione contenente solo tampone, mescolare 2,5 microlitri di 10x tampone di trascrizione in vitro, un microlitro di 25 millimolari ribonucleoside trifosfato mix, un microlitro di un millimolare di verde malachite e tre microlitri di un modello di aptamero verde malachite millimolare in 17,5 microlitri di acqua doppia distillata.Quando tutte le reazioni sono state preparate, trasferire ogni reazione su una piastra a 384 pozzetti e monitorare la trascrizione dell'aptamero verde malachite su un lettore di piastre a fluorescenza per due ore a 37 gradi Celsius a un'eccitazione di 610 nanometri e un'emissione di 655 nanometri. Alla fine della lettura, posizionare la piastra su ghiaccio ed eseguire il prodotto RNA da ciascun pozzetto in un gel poliacrilico denaturizzante al 12% TBE-urea in tampone TBE a 70 gradi Celsius a 280 volt per 20 minuti, o fino a quando il fronte colorante raggiunge la fine del gel. Quindi, colorare il gel con la colorazione di acido nucleico colorante cianina per 10 minuti su uno shaker orbitale, prima di eseguire l'imaging come dimostrato.Un'espressione e una purificazione di successo della proteina RNAP SNAP T7 ricombinante possono essere confermate utilizzando SDS-PAGE. Seguendo SDS-PAGE, l'attività enzimatica può essere convalidata mediante reazione di trascrizione in vitro. L'accoppiamento riuscito di oligonucleotidi funzionalizzati BG può essere verificato tramite IL 18% di TBE-urea PAGE denaturante.Rispetto all'oligonucleotide non modificato, l'aggiunta della porzione BG all'oligonucleotide aumenta il suo peso molecolare. Come osservato in questo gel di colorazione del colorante cianine rappresentativo per confermare la purificazione T7 RNAP legata al DNA dagli oligonucleotidi BG in eccesso, il flusso iniziale attraverso la frazione conteneva principalmente oligonucleotide BG in eccesso, così come una piccola porzione della polimerasi legata al DNA che non si legava alla resina a scambio cationico. Le frazioni di diluizione del pool contenevano solo la singola banda di oligo RNAP causata dal legame del colorante cianine al legame oligonucleotidico, con la corsia del prodotto concentrata verso l'alto che mostrava la stessa banda, ma più scura che significa una concentrazione di up-concentration di successo.Gli stessi modelli sono osservati dalla colorazione blu di Coomassie, con un piccolo spostamento di mobilità del gel osservato nel controllo RNAP non coniugato. Qui viene mostrato il segnale fluorescente prodotto alla fine della trascrizione in vitro in cinetica in tempo reale. In questa analisi, è stata osservata un'attivazione di 336 volte nel segnale di fluorescenza, dimostrando un robusto controllo dell'attività della polimerasi.Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di lavare accuratamente la SDS dal gel prima della colorazione dell'acido nucleico. Questo perché STS intrappola il colorante nel gel, con conseguente segnale di fondo elevato. L'applicazione del nostro metodo a un grande circuito genico con più cascate mostrerà la scalabilità e la componibilità del sistema di trascrizione tethered.Questa tecnica è attualmente utilizzata per sviluppare circuiti genici in grado di calcolare in stile rete neurale.

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