Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

L.Y.T.C anerkjenner sjenerøs støtte fra New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant, og University of Toronto's Medicine by Design Initiative, som mottar støtte fra Canada First Research Excellence Fund (CFREF).

1. Klargjøring av buffer
MERK: Proteinrensing bufferpreparat kan oppstå på hvilken som helst dag; her ble det gjort før du begynte eksperimentene.
<ol><li>Klargjør lysis/likevektsbuffer som inneholder 50 mM tris (hydroksymetyl)aminometan (Tris), 300 mM natriumklorid (NaCl), 5% glyserol og 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Tilsett 1,5 ml 1M Tris, 1,8 ml 5M NaCl, 1,5 ml glyserol, 25,2 ml deionisert vann (ddH2O) i et 50 ml sentrifugerør, og tilsett 10,5 μL 14,2 M BME like f...

<ol>
	<li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks.">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li><li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li><li>Chen, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA.">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li><li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+gene+networks.">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li><li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing:+advances+and+prospects.">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li><li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes.">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li><li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer.">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li><li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Mart&#237;nez-P&#233;rez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing:+A+multiobjective+evolutionary+approach.">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li><li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands:+enhanced+models,+scalability,+and+speed.">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li><li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+costs:+Data.">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li><li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics.">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA.">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li><li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage.">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).</li><li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DNA+to+power+nanostructures.">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li><li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA.">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li><li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems.">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li><li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement.">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).</li><li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -. B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handhold-mediated+strand+displacement:+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions.">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li><li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors.">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li><li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles.">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).</li><li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits.">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li><li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.8+&#197;+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11.">2.8 &#197; crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. 301 (1), 117-128 (2000).</li><li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors.">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li><li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis.">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li><li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors.">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li><li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+elongation,+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase.">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li><li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li><li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortase-tag+expressed+protein+ligation:+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step.">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li><li>Zhang, W. -. B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li></ol>

Denne studien demonstrerer en DNA nanoteknologi-inspirert tilnærming for å kontrollere aktiviteten til T7 RNA-polymerase ved å kovalent koble en N-terminalt SNAP-merket rekombinant T7 RNAP med en BG-funksjonalisert oligonukleotid, som senere ble brukt til å programmere TMDSD-reaksjoner. Ved design ble SNAP-taggen plassert ved polymerasens N-terminus, da C-terminus av wild-type T7 RNAP er begravet i proteinstrukturkjernen og gjør viktige kontakter med DNA-malen28. Tidligere forsøk på å modi...

DNA-databehandling bruker et sett med designet oligonukleotider som medium for beregning. Disse oligonukleotidene er programmert med sekvenser for dynamisk montering i henhold til brukerspesifikk logikk og reagerer på spesifikke nukleinsyreinnganger. I konseptgodkjenningsstudier består utgangen av beregningen vanligvis av et sett fluorescerende merket oligonukleotider som kan oppdages via gelelektroforese eller fluorescensplatelesere. I løpet av de siste 30 årene har stadig mer komplekse DNA-beregningskretser blitt demonstrert, for eksempel ulike digitale logikkkaskader, kjemiske reaksjonsnettverk og nevrale nettverk1,2,3. For å hjelpe til med utarbeidelsen av disse DNA-kretsene, har matematiske modeller blitt brukt til å forutsi funksjonaliteten til syntetiske genkretser4,5og beregningsverktøy er utviklet for ortogonal DNA-sekvensdesign6,7,8,9,10 . Sammenlignet med silisiumbaserte datamaskiner inkluderer fordelene med DNA-datamaskiner deres evne til å kommunisere direkte med biomolekyler, operere i løsning i fravær av strømforsyning, samt deres generelle kompaktitet og stabilitet. Med ankomsten av neste generasjons sekvensering har kostnadene ved å syntetisere DNA-datamaskiner gått ned de siste to tiårene med en hastighet raskere enn Moores lov11. Anvendelser av slike DNA-baserte datamaskiner begynner nå å dukke opp, for eksempel for sykdomsdiagnose12,13, for å drive molekylær biofysikk14, og som datalagringsplattformer15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Figur 1: Mekanisme for tåholdmediert DNA-strengforskyvning. Tåholdet, δ, er en gratis, ubundet sekvens på en delvis dupleks. Når et komplementært domene (δ*) innføres på en annen tråd, fungerer det frie δ-domenet som et tåhold for hybridisering, slik at resten av tråden (ɑ*) sakte kan fortrenge konkurrenten gjennom en zipping / unzipping reversibel reaksjon kjent som strandmigrasjon. Etter hvert som lengden på δ øker, reduseres ΔG for fremoverreaksjonen, og forskyvning skjer lettere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Til dags dato bruker flertallet av DNA-datamaskiner et veletablert motiv innen dynamisk DNA nanoteknologi kjent som tåholdmediert DNA-strandforskyvning (TMDSD, figur 1)16. Dette motivet består av en delvis dobbeltstrenget DNA (dsDNA) dupleks som viser korte "tåhold" overheng (dvs. 7- til 10 nukleotider (nt)). Nukleinsyre "input" tråder kan samhandle med de delvise dupleksene gjennom tåholdet. Dette fører til forskyvning av en av trådene fra den delvise dupleksen, og denne frigjorte strengen kan deretter tjene som inngang for nedstrøms delvise duplekser. Dermed muliggjør TMDSD signalkaskade og informasjonsbehandling. I prinsippet kan ortogonale TMDSD-motiver operere uavhengig i løsning, noe som muliggjør parallell informasjonsbehandling. Det har vært en rekke variasjoner på TMDSD-reaksjonen, for eksempel tåholdmediert DNA-strandutveksling (TMDSE)17, "lekkasjeløse" tåhold med dobbeltlange domener18, sekvens-mismatched tåhold19, og "handhold"-mediert strandforskyvning20. Disse innovative designprinsippene gir mer finjustert TMDSD-energi og dynamikk for å forbedre YTELSEN til DNA-databehandling.
Syntetiske genkretser, som transkripsjonelle genkretser, er også i stand til beregning21,22,23. Disse kretsene er regulert av proteintranskripsjonsfaktorer, som aktiverer eller undertrykker transkripsjon av et gen ved å binde seg til spesifikke regulatoriske DNA-elementer. Sammenlignet med DNA-baserte kretser har transkripsjonskretser flere fordeler. For det første har enzymatisk transkripsjon en mye høyere omsetningshastighet enn eksisterende katalytiske DNA-kretser, og genererer dermed flere kopier av utdata per enkelt kopi av inngang og gir et mer effektivt middel for signalforsterkning. I tillegg kan transkripsjonskretser produsere forskjellige funksjonelle molekyler, for eksempel aptamers eller messenger RNA (mRNA) koding for terapeutiske proteiner, som beregningsutganger, som kan utnyttes til forskjellige applikasjoner. Imidlertid er en stor begrensning av nåværende transkripsjonskretser deres mangel på skalerbarhet. Dette er fordi det er et svært begrenset sett med ortogonale proteinbaserte transkripsjonsfaktorer, og de novo-design av nye proteintranskripsjonsfaktorer forblir teknisk utfordrende og tidkrevende.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Figur 2: Abstraksjon og mekanisme for polymerasekomplekset "tether" og "cage". (A og B) En oligonukleotidetets tether er enzymatisk merket til en T7-polymerase gjennom SNAP-tag-reaksjonen. Et bur bestående av en "faux" T7-promotor med et tether-komplementoverheng gjør det mulig å hybridisere til tether og blokkere transkripsjonsaktivitet. (C) Når operatoren (a*b*) er til stede, binder den seg til tåholdet på oligonukleotidets tether (ab) og fortrenger b* -regionen i buret, slik at transkripsjon kan forekomme. Denne figuren er endret fra Chou og Shih27. Forkortelser: RNAP = RNA polymerase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Dette dokumentet introduserer en ny byggestein for molekylær databehandling som kombinerer funksjonaliteten til transkripsjonskretser med skalerbarheten til DNA-baserte kretser. Denne byggesteinen er en T7 RNAP som er kovalent festet med en enkeltstrenget DNA-tether (figur 2A). For å syntetisere denne DNA-tethered T7 RNAP, ble polymerasen smeltet sammen til en N-terminal SNAP-tag24 og rekombinant uttrykt i Escherichia coli. SNAP-taggen ble deretter reagert med et oligonukleotid funksjonalisert med BG-substratet. Oligonukleotid-tetheren tillater posisjonering av molekylære gjester i nærheten av polymerasen via DNA-hybridisering. En slik gjest var en konkurransedyktig transkripsjonsblokkering referert til som et "bur", som består av en "faux" T7 promotør DNA-dupleks uten gen nedstrøms (Figur 2B). Når det bindes til RNAP via sin oligonukleotid-tether, stopper buret polymeraseaktivitet ved å utkonkurrere andre DNA-maler for RNAP-binding, noe som gjør RNAP i en "OFF" -tilstand (Figur 2C).
For å aktivere polymerasen til en "ON" tilstand, ble T7 DNA-maler med enkeltstrengede "operatør" domener oppstrøms for T7-promotoren av genet designet. Operatørdomenet (dvs. domene a*b* figur 2C) kan utformes for å fortrenge merden fra RNAP via TMDSD og plassere RNAP-proksimalt til T7-promotoren av genet, og dermed initiere transkripsjon. Alternativt ble DNA-maler også designet der operatørsekvensen var komplementær til hjelpekjernesyrestrenger som kalles "kunstige transkripsjonsfaktorer" (dvs. TFA- og TFB-tråder i figur 3A). Når begge trådene introduseres i reaksjonen, samles de på operatørstedet og oppretter et nytt pseudo-sammenhengende domene a*b*. Dette domenet kan deretter fortrenge merden via TMDSD for å starte transkripsjon (Figur 3B). Disse trådene kan leveres enten eksogent eller produseres.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Figur 3: Selektiv programmering av polymeraseaktivitet gjennom en tre-komponent bryteraktivator. (A) Når transkripsjonsfaktorene (TFA og TFB) er til stede, binder de seg til operatørdomenet oppstrøms for promotoren, og danner en pseudo-enkeltstrenget sekvens ( a *b *) som er i stand til å fortrenge buret gjennom tåhold mediert DNA-forskyvning. (B) Dette a * b * domenet kan fortrenge buret via TMDSD for å starte transkripsjon. Denne figuren er endret fra Chou og Shih27. Forkortelser: TF = transkripsjonsfaktor; RNAP = RNA polymerase; TMDSD = tåholdmediert DNA-strengforskyvning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Bruken av nukleinsyrebaserte transkripsjonsfaktorer for in vitro transkripsjonsregulering tillater skalerbar implementering av sofistikert kretsatferd som digital logikk, tilbakemelding og signalkaskade. For eksempel kan man bygge logikk gate kaskader ved å designe nukleinsyre sekvenser slik at transkripsjoner fra et oppstrøms gen aktiverer et nedstrøms gen. Et program som utnytter kaskade- og multipleksing gjort i stand til denne foreslåtte teknologien er utviklingen av mer sofistikerte molekylære databehandlingskretser for bærbar diagnostikk og molekylær databehandling. I tillegg kan integrering av molekylær databehandling og de novo RNA-syntesefunksjoner muliggjøre nye applikasjoner. For eksempel kan en molekylær krets utformes for å oppdage en eller en kombinasjon av brukerdefinerte RNAer som innganger og utgangsterapeutiske RNAer eller mRNAer som koder funksjonelle peptider eller proteiner for medisinske applikasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

DNA nanoteknologi muliggjør programmerbar selvmontering av nukleinsyrer i brukerforeskrevne former og dynamikk for ulike bruksområder. Dette arbeidet viser at begreper fra DNA nanoteknologi kan brukes til å programmere den enzymatiske aktiviteten til phage-avledede T7 RNA-polymerase (RNAP) og bygge skalerbare syntetiske genregulatoriske nettverk. For det første er en oligonukleotid-tethered T7 RNAP konstruert via uttrykk for en N-terminalt SNAP-merket RNAP og påfølgende kjemisk kobling av SNAP-taggen med en benzylguanin (BG)-modifisert oligonukleotid. Deretter brukes nukleinsyrestrengforskyvning til å programmere polymerasetranskripsjon på forespørsel. I tillegg kan hjelpekjernesyreenheter brukes som "kunstige transkripsjonsfaktorer" for å regulere interaksjonene mellom den DNA-programmerte T7 RNAP med sine DNA-maler. Denne in vitro-transkripsjonsregulatoriske mekanismen kan implementere en rekke kretsoppførseler som digital logikk, tilbakemelding, kaskade og multipleksing. Komponerbarheten av denne genregulatoriske arkitekturen letter designabstraksjon, standardisering og skalering. Disse funksjonene vil muliggjøre rask prototyping av in vitro genetiske enheter for applikasjoner som bio-sensing, sykdomsdeteksjon og datalagring.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Figur 5: SDS-PAGE analyse av SNAP T7 RNAP-uttrykk og in vitro transkripsjonsanalyse. (A) SNAP T7 RNAP proteinrensingsanalyse, SNAP T7 RNAP molekylvekt: 119.4kDa. FT = gjennomstrømning fra kolonnen, W1 = elutionfraksjoner av vaskebuffer som inneholder urenheter, E1-3 = elutionfraksjoner som inneholder renset produkt, og DE = 10x fortynnet tot...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

Vi beskriver teknikk av en ny DNA-bundet T7 RNA-polymerase for å regulere in vitro transkripsjonsreaksjoner. Vi diskuterer trinnene for proteinsyntese og karakterisering, validerer konseptgodkjenningsregulering og diskuterer dens anvendelser innen molekylær databehandling, diagnostikk og molekylær informasjonsbehandling.

DNA-tethered RNA polymerase for programmerbar in vitro transkripsjon og molekylær beregning

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Vi foreslår en metode for regulering av polymeraseaktivitet ved hjelp av kunstige nukleinsyretranskripsjonsfaktorer. Denne genreguleringsarkitekturen kan fungere som en byggestein for fremtidige in vitro genetiske enheter. Ved å knytte et DNA-bindingsdomene til en T7 RNA-polymerase, kombinerer denne teknikken skalerbarheten til DNA-baserte kretser, med funksjonaliteten til transkripsjonskretser.Begynn med å lage ni fortynninger av enkeltstrenget BG oligonukleotid til et sluttvolum på 50 mikroliter dobbelt destillert vann, fra fem til en til en til fem forhold, som angitt i tabellen. Forbered en reaksjonsblanding for hver fortynning ved å blande to mikroliter SNAP-buffer med fire mikroliter BG oligonukleotid og fire mikroliter SNAP T7 RNAP. Forbered RNAP-kontrollen ved å erstatte oligonukleotidet med dobbelt destillert vann, og DNA-kontrollen ved å erstatte SNAP T7 RNAP med dobbelt destillert vann.Sett opp 11 reaksjoner ved å legge til to mikroliter av hver prøve til fire mikroliter SNAP-buffer, og to mikroliter proteinbelastningsfargestoff per prøve. Varm opp reaksjonene i 10 minutter ved 70 grader Celsius, før du laster to mikroliter av hver prøve på en fire til 12% glasslegemet proteingel i 35 minutter med gelelektroforese på is ved 200 volt. På slutten av løpet, vask gelen med tre vannutvekslinger på en shaker i minst 10 minutter per vask, etterfulgt av nukleinsyrefarging med cyaninfargestoff i 15 minutter.Bilde gelen på et passende gelavbildningssystem, og flekk gelen igjen med 20 milliliter Coomassie blå. Etter en time, de-flekk med dobbelt destillert vann i minst en time før du forestiller gelen igjen. For oligonukleotid-tethered SNAP T7 rensing, først, forberede elution buffer ved å blande 50 mikroliter av en molar spor, med 100 mikroliter av fem molar natriumklorid, med 850 mikroliter dobbelt destillert vann.Deretter plasserer du en ionbyttekolonne per prøve i individuelle to milliliter sentrifugerør, og vasker kolonnene med rensebuffer ved sentrifugering til all bufferen er løsnet fra hver kolonne. Fortynn hver prøve med rensebuffer ved et forhold mellom tre og én rensingsbuffer og prøve, og last inn 400 mikroliter prøve i hver kolonne. Når hele bufferen er hentet som demonstrert, samler du inn og merker gjennomstrømningen for hver prøve.Vask kolonnene tre ganger med 400 mikroliter rensebuffer per vask til all bufferen er eluted per vask, samle og merke gjennomstrømningen etter behov. Etter den siste vasken samler du det eluterte proteinet ved å tilsette 50 mikroliter elutionbuffer i midten av kolonnen, og sentrifugerer kolonnen tre ganger til alle 50 mikroliter buffer har blitt unngått. Samle og merk elutten etter hver sentrifugering, samle elutt i et enkelt rør etter siste sentrifugering, mens du etterlater et lite volum av hver elute for gelanalyse.Mål absorbansen av de resterende elute aliquots ved 260 og 280 nanometer, og legg glyserol til prøvene med et en-til-en-forhold for minus 20 grader lagring til bruk. Bruk en 500 mikroliter 30 kilodalton centrifical filterenhet til å buffer bytte ut det totale eluteproduktet med 2x lagringsbuffer. Og måle absorbansen som demonstrert.Tilsett deretter glyserol til produktet med et en-til-en-forhold for minus 20 grader Celsius-lagring. For å vurdere elutes av SDS-PAGE, kjør prøvene i en passende protein stige på en fire til 12% glasslegemet gel i 35 minutter ved 200 volt, eller til fargefronten migrerer til enden av gelen. For å demonstrere behovsbetinget kontrollaktivitet for den tethered RNAP, bland 2,4 mikroliter av hver mal med fem mikroliter 5x glødebuffer og 14,2 mikroliter dobbelt destillert vann.Inkuber den resulterende mikromolaren dobbeltstrenget DNA CAGE ved 75 grader Celsius i to minutter. Og anneal sans og anti-sans stammer av promotoren og malakitt grønn aptamer DNA mal på samme måte som angitt i tabellen. På slutten av inkubasjonene, legg den tethered SNAP T7 RNAP til det dobbeltstrengede DNA CAGE med et en til fem molarforhold til en endelig konsentrasjon på 500 nanomolar RNAP.Etter 15 minutter ved romtemperatur, plasser prøven på is, og bland 2,5 mikroliter 10x in vitro transkripsjonsbuffer med en mikroliter på 25 millimolar ribonucleoside triphosphate, en mikroliter av en millimolar malakittgrønn, 2,5 mikroliter av RNAP CAGE-blandingen, 2,5 mikroliter hver av en mikromotranskripsjonsfaktorer A og B oligoclenuotides strandides, og tre mikroliter av en millimolar malakittgrønn aptamermal i 10 mikroliter dobbelt destillert vann. I 15 mikroliter dobbelt destillert vann, sette opp en annen reaksjon som inneholder 2,5 mikroliter 10x in vitro transkripsjon buffer, en mikroliter av 25 millimolar ribonucleoside triphosphate blanding, en mikroliter av en millimolar malakitt grønn, 2,5 mikroliter av RNAP CAGE blanding, og tre mikroliter av en millimo malalarchite grønn aptamer mal. For å sette opp en reaksjon som bare inneholder buffer, bland 2,5 mikroliter 10x in vitro transkripsjonsbuffer, en mikroliter med 25 millimolar ribonucleoside triphosphate mix, en mikroliter av en millimolar malakittgrønn og tre mikroliter av en millimolar malakittgrønn aptamermal i 17,5 mikroliter dobbelt destillert vann.Når alle reaksjonene er forberedt, overfør hver reaksjon på en 384-brønnsplate, og overvåk den malakittgrønne aptamertranskripsjonen på en fluorescensplateleser i to timer ved 37 grader Celsius ved en 610 nanometereksitasjon, og et 655 nanometerutslipp. På slutten av avlesningen legger du platen på is, og kjører RNA-produktet fra hver brønn i en denaturerende 12% TBE-urea polyakrylgel i 70 grader Celsius TBE buffer ved 280 volt i 20 minutter, eller til fargefronten når slutten av gelen. Deretter flekker gelen med cyaninfarget nukleinsyreflekk i 10 minutter på en orbital shaker, før bildebehandling som demonstrert.Et vellykket uttrykk og rensing av det rekombinante SNAP T7 RNAP-proteinet kan bekreftes ved hjelp av SDS-PAGE. Etter SDS-PAGE kan den enzymatiske aktiviteten valideres ved in vitro transkripsjonsreaksjon. Vellykket kobling av BG-funksjonaliserte oligonukleotider kan verifiseres via 18% denaturing TBE-urea PAGE.Sammenlignet med det umodifiserte oligonukleotidet øker tilsetningen av BG-moiety til oligonukleotidet sin molekylvekt. Som observert i denne representative cyaninfargeflekkegelen for å bekrefte DNA-bundet T7 RNAP-rensing fra overflødige BG-oligonukleotider, inneholdt den første strømmen gjennom brøkdel for det meste overflødig BG-oligonukleotid, samt en liten del av den DNA-tethered polymerase som ikke binder seg til kationutvekslingsharpiksen. Bassengfortynning fraksjoner inneholdt bare det ene båndet av RNAP oligo forårsaket av cyanin fargestoff binding til oligonukleotid tether, med den up-konsentrerte produktbanen viser det samme, men mørkere bånd som indikerer en vellykket up-konsentrasjon.De samme mønstrene observeres av Coomassie blå farging, med et lite gelmobilitetsskift observert i den ikke-konjugede RNAP-kontrollen. Her vises fluorescerende signal produsert på slutten av in vitro-transkripsjonen i sanntid kinetikk. I denne analysen ble det observert en 336 ganger aktivering i fluorescenssignal, som viser en robust kontroll av polymeraseaktivitet.Når du prøver denne protokollen, må du huske å vaske SDS grundig av gelen før nukleinsyrefarging. Dette er fordi STS vil fange fargestoffet i gelen, noe som resulterer i høyt bakgrunnssignal. Å bruke vår metode på en stor genkrets med flere kaskader vil vise skalerbarheten og komponerbarheten til det tethered transkripsjonssystemet.Denne teknikken brukes for tiden til å utvikle genkretser som er i stand til nevral nettverksstilberegning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Montering av Semi-kunstig Molecular Machine og dens bruk for påvisning av DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Utvikling av Amelogenin-kitosan Hydrogel for<em&gt; In Vitro</em&gt; Emalje Gjengroing med en Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatisk Assay å måle transkripsjon Hemming av Gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Bruke Syntetisk biologi Ingeniør levende celler som grensesnitt med Programmerbare Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimalisering av en Multiplex RNA-baserte uttrykk analysen bruker bryst kreft arkivmateriale

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...