Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

L.Y.T.C признает щедрую поддержку со стороны Фонда исследований «Новые рубежи в исследованиях» (NFRF-E), Гранта Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) Discovery Grant и Инициативы «Медицина по дизайну» Университета Торонто, которая получает финансирование от Канадского фонда первого научного совершенства (CFREF).

1. Подготовка буфера
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка белка буферным препаратом может происходить в любой день; здесь это было сделано до начала экспериментов.
<ol><li>Приготовьте буфер лизиса/равновесия, содержащий 50 мМ трис (гидроксиметил)аминометан (Tris), 300 мМ хлорида натрия (NaCl), 5% гли?...

<ol>
	<li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks.">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li><li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li><li>Chen, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA.">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li><li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+gene+networks.">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li><li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing:+advances+and+prospects.">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li><li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes.">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li><li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer.">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li><li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Mart&#237;nez-P&#233;rez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing:+A+multiobjective+evolutionary+approach.">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li><li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands:+enhanced+models,+scalability,+and+speed.">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li><li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+costs:+Data.">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li><li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics.">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA.">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li><li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage.">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).</li><li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DNA+to+power+nanostructures.">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li><li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA.">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li><li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems.">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li><li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement.">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).</li><li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -. B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handhold-mediated+strand+displacement:+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions.">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li><li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors.">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li><li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles.">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).</li><li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits.">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li><li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.8+&#197;+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11.">2.8 &#197; crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. 301 (1), 117-128 (2000).</li><li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors.">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li><li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis.">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li><li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors.">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li><li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+elongation,+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase.">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li><li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li><li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortase-tag+expressed+protein+ligation:+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step.">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li><li>Zhang, W. -. B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li></ol>

Это исследование демонстрирует основанный на нанотехнологиях подход к контролю активности РНК-полимеразы Т7 путем ковалентного соединения N-терминально помеченного SNAP рекомбинантного Т7-РНКП с BG-функционализированным олигонуклеотидом, который впоследствии использовался для програ?...

ДНК-вычисления используют набор разработанных олигонуклеотидов в качестве среды для вычислений. Эти олигонуклеотиды запрограммированы последовательностями для динамической сборки в соответствии с заданной пользователем логикой и реагируют на конкретные входы нуклеиновых кислот. В экспериментальных исследованиях результат вычислений обычно состоит из набора флуоресцентно меченых олигонуклеотидов, которые могут быть обнаружены с помощью гелевого электрофореза или флуоресцентных пластинчатых считывателей. За последние 30 лет были продемонстрированы все более сложные вычислительные схемы ДНК, такие как различные цифровые логические каскады, сети химических реакций и нейронные сети1,2,3. Чтобы помочь в подготовке этих схем ДНК, математические модели были использованы для прогнозирования функциональности синтетических генных схем4,5,а вычислительные инструменты были разработаны для проектирования ортогональных последовательностей ДНК6,7,8,9,10 . По сравнению с компьютерами на основе кремния, к преимуществам ДНК-компьютеров можно отнести их способность напрямую взаимодействовать с биомолекулами, работать в растворе при отсутствии источника питания, а также их общую компактность и стабильность. С появлением секвенирования следующего поколения стоимость синтеза ДНК-компьютеров снижалась в течение последних двух десятилетий быстрее, чем закон Мура11. В настоящее время начинают появляться приложения таких компьютеров на основе ДНК, такие как для диагностики заболеваний12,13,для питания молекулярной биофизики14и в качестве платформ хранения данных15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Рисунок 1:Механизм смещения нитей ДНК, опосредованных носком. Toehold, δ, представляет собой свободную, несвязанную последовательность на частичном дуплексе. Когда комплементарный домен (δ*) вводится на второй нити, свободный δ домен служит опорой для гибридизации, позволяя остальной части нити (ɑ*) медленно вытеснять своего конкурента через молниеносную / расстегивающую обратимую реакцию, известную как миграция нитей. По мере увеличения длины δ ΔG для прямой реакции уменьшается, и смещение происходит более легко. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
На сегодняшний день большинство ДНК-компьютеров используют хорошо зарекомендовавший себя мотив в области динамической нанотехнологии ДНК, известный как смещение цепей ДНК(TMDSD, рисунок 1)16. Этот мотив состоит из частично двухцепочечного дуплекса ДНК (dsDNA), отображающего короткие свесы «toehold» (т.е. от 7 до 10 нуклеотидов (nt)). «Входные» нити нуклеиновых кислот могут взаимодействовать с частичными дуплексами через носок. Это приводит к смещению одной из нитей из частичного дуплекса, и эта освобожденная нить может затем служить входом для нисходящих частичных дуплексов. Таким образом, TMDSD обеспечивает каскадирование сигналов и обработку информации. В принципе, ортогональные мотивы TMDSD могут работать независимо в решении, обеспечивая параллельную обработку информации. Существует ряд вариаций реакции TMDSD, таких как опосредованный носком ниточный обмен (TMDSE)17,«непротекающие» пальцы ног с двойными длинными доменами18,несоответствующие последовательности носок19и «ручное» опосредованное смещение нитей20. Эти инновационные принципы проектирования позволяют более точно настроить энергетику и динамику TMDSD для повышения производительности днк-вычислений.
Синтетические генные схемы, такие как транскрипционные генные цепи, также способны вычислять21,22,23. Эти схемы регулируются факторами транскрипции белка, которые активируют или подавляют транскрипцию гена путем связывания со специфическими регуляторными элементами ДНК. По сравнению со схемами на основе ДНК, транскрипционные схемы имеют несколько преимуществ. Во-первых, ферментативная транскрипция имеет гораздо более высокую скорость оборота, чем существующие каталитические схемы ДНК, тем самым генерируя больше копий выходного сигнала на одну копию входа и обеспечивая более эффективные средства усиления сигнала. Кроме того, транскрипционные схемы могут производить различные функциональные молекулы, такие как аптамеры или матричная РНК (мРНК), кодирующая терапевтические белки, в качестве вычислительных выходов, которые могут быть использованы для различных применений. Однако основным ограничением современных транскрипционных схем является отсутствие у них масштабируемости. Это связано с тем, что существует очень ограниченный набор ортогональных факторов транскрипции на основе белка, и разработка de novo новых факторов транскрипции белка остается технически сложной и трудоемкой.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Рисунок 2:Абстракция и механизм полимеразного комплекса «трос» и «клетка». ( А иВ ) Олигонуклеотидный трос ферментативно мечуется на полимеразу Т7 посредством реакции SNAP-метки. Клетка, состоящая из «искусственного» промотора Т7 с навесом троса-комплемента, позволяет ему гибридизоваться с тросом и блокировать транскрипционную активность. (C) Когда оператор (a*b*) присутствует, он связывается с пальцем ноги на олигонуклеотидном тросе(ab)и смещает область b* клетки, позволяя происходить транскрипции. Эта цифра была изменена с Чжоу и Ши27. Сокращения: RNAP = РНК-полимераза. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
В этой статье представлен новый строительный блок для молекулярных вычислений, который сочетает в себе функциональные возможности транскрипционных схем с масштабируемостью схем на основе ДНК. Этот строительный блок представляет собой Ковалентный Т7-РНК, присоединенный одноцепочечным тросом ДНК(рисунок 2А). Чтобы синтезировать этот ПРИВЯЗАННЫЙ к ДНК T7 RNAP, полимеразу сплавляли с N-концевой SNAP-меткой24 и рекомбинантно экспрессировали в кишечной палочке. Затем SNAP-метку реагировали с олигонуклеотидом, функционализированным с субстратом BG. Олигонуклеотидный трос позволяет позиционировать молекулярные гости в непосредственной близости от полимеразы посредством гибридизации ДНК. Одним из таких гостей был конкурентный блокатор транскрипции, называемый «клеткой», который состоит из «искусственного» дуплекса ДНК промотора T7 без гена вниз по течению(рисунок 2B). При связывании с RNAP через его олигонуклеотидный трос клетка останавливает активность полимеразы, превосходя другие шаблоны ДНК для связывания RNAP, приводя RNAP в состояние «OFF»(рисунок 2C).
Чтобы активировать полимеразу до состояния «ON», были разработаны шаблоны ДНК Т7 с одноцепочечными «операторными» доменами выше промотора Т7 гена. Операторный домен (т.е. домен a*b* Рисунок 2C)может быть спроектирован так, чтобы вытеснить клетку из РНКП через TMDSD и позиционировать РНКП проксимально к промотору Т7 гена, тем самым инициируя транскрипцию. Альтернативно, шаблоны ДНК также были разработаны, где операторная последовательность была комплементарна вспомогательным нитям нуклеиновых кислот, которые называются «факторами искусственной транскрипции» (т.е. нитями TFA и TFB на рисунке 3A). Когда обе нити будут введены в реакцию, они будут собираться на операторской площадке, создавая новый псевдосмежный домен a*b*. Затем этот домен может вытеснить клетку через TMDSD для инициирования транскрипции(рисунок 3B). Эти пряди могут поставляться либо экзогенно, либо производиться.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Рисунок 3:Селективное программирование активности полимеразы с помощью трехкомпонентного переключателя активатора. (A)Когда факторы транскрипции (TFA и TFB)присутствуют, они связываются с операторным доменом перед промотором, образуя псевдо-одноцепочечную последовательность(a*b*),способную вытеснять клетку через опосредованное смещение ДНК. (B) Этот домен a*b* может смещать клетку через TMDSD, чтобы инициировать транскрипцию. Эта цифра была изменена с Чжоу и Ши27. Сокращения: TF = транскрипционный фактор; RNAP = РНК-полимераза; TMDSD = смещение нитей ДНК, опосредованное носком. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Использование факторов транскрипции на основе нуклеиновых кислот для транскрипционной регуляции in vitro позволяет масштабируемую реализацию сложных поведений схем, таких как цифровая логика, обратная связь и каскадирование сигналов. Например, можно построить каскады логических ворот, спроектировав последовательности нуклеиновых кислот таким образом, чтобы транскрипты из гена вверх по течению активировали ген нисходящего потока. Одним из приложений, использующих каскадирование и мультиплексирование, которые стали возможными с помощью этой предлагаемой технологии, является разработка более сложных молекулярных вычислительных схем для портативной диагностики и обработки молекулярных данных. Кроме того, интеграция возможностей молекулярных вычислений и синтеза РНК de novo может обеспечить новые приложения. Например, молекулярная схема может быть спроектирована для обнаружения одной или комбинации определяемых пользователем РНК в качестве входных и выходных терапевтических РНК или мРНК, кодирующих функциональные пептиды или белки для медицинских применений в местах оказания медицинской помощи.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

Нанотехнология ДНК позволяет программируемую самосборку нуклеиновых кислот в предписанные пользователем формы и динамику для различных применений. Эта работа демонстрирует, что концепции из нанотехнологий ДНК могут быть использованы для программирования ферментативной активности фаговой РНК-полимеразы T7 (RNAP) и построения масштабируемых синтетических регуляторных сетей генов. Во-первых, Олигонуклеотид-привязанный T7 RNAP спроектирован путем экспрессии N-терминально помеченного SNAP RNAP и последующей химической связи SNAP-метки с бензилгуанином (BG)-модифицированным олигонуклеотидом. Затем смещение нитей нуклеиновых кислот используется для программирования транскрипции полимеразы по требованию. Кроме того, вспомогательные сборки нуклеиновых кислот могут использоваться в качестве «искусственных факторов транскрипции» для регулирования взаимодействия между запрограммированным ДНК РНКП Т7 с его шаблонами ДНК. Этот регуляторный механизм транскрипции in vitro может реализовывать различные варианты поведения схем, такие как цифровая логика, обратная связь, каскадирование и мультиплексирование. Компонуемость этой генной регуляторной архитектуры облегчает абстракцию, стандартизацию и масштабирование дизайна. Эти функции позволят быстро создавать прототипы генетических устройств in vitro для таких применений, как биозондирование, обнаружение заболеваний и хранение данных.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Рисунок 5:SDS-PAGE анализ экспрессии SNAP T7 RNAP и анализа транскрипции in vitro. (A) Анализ очистки белка SNAP T7 RNAP, молекулярная масса SNAP T7 RNAP: 119,4 кДа. FT = протекание из колонны, W1 = фракции элюирования про?...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

Мы описываем разработку новой ДНК-привязанной РНК-полимеразы Т7 для регулирования реакций транскрипции in vitro. Мы обсуждаем этапы синтеза и характеристик белка, проверяем доказательство концепции транскрипционной регуляции и обсуждаем ее приложения в молекулярных вычислениях, диагностике и обработке молекулярной информации.

ДНК-привязанная РНК-полимераза для программируемой транскрипции in vitro и молекулярных вычислений

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Предложен способ регулирования активности полимеразы с использованием искусственных факторов транскрипции нуклеиновых кислот. Эта генная регуляторная архитектура может служить строительным блоком для будущих генетических устройств in vitro. Привязывая днк-связывающий домен к РНК-полимеразе Т7, этот метод сочетает в себе масштабируемость схем на основе ДНК с функциональностью транскрипционных цепей.Начните с внесения девяти разведений одноцепочечного олигонуклеотида BG в конечный объем 50 микролитров двойной дистиллированной воды, от пяти до одного к одному-пяти соотношениям, как указано в таблице. Готовят по одной реакционной смеси для каждого разбавления, смешивая два микролитра буфера SNAP с четырьмя микролитрами олигонуклеотида BG и четырьмя микролитрами SNAP T7 RNAP. Подготовьте контроль RNAP, заменив олигонуклеотид двойной дистиллированной водой, и контроль ДНК, заменив SNAP T7 RNAP двойной дистиллированной водой.Настройте 11 реакций, добавив два микролитра каждого образца к четырем микролитрам буфера SNAP и два микролитра красителя с загрузкой белка на образец. Нагрейте реакции в течение 10 минут при 70 градусах Цельсия, прежде чем загрузить два микролитра каждого образца на протеиновый гель от четырех до 12% стекловидного тела в течение 35 минут гелевого электрофореза на льду при 200 вольтах. В конце прогона промыть гель тремя водообменами на шейкере не менее 10 минут за одну стирку с последующим окрашиванием нуклеиновой кислотой цианиновым красителем в течение 15 минут.Нанесите изображение геля на соответствующую систему визуализации геля и снова окрасьте гель 20 миллилитрами синего coomassie. Через один час очистите от пятна двойной дистиллированной водой в течение по крайней мере одного часа, прежде чем снова визуализировать гель. Для олигонуклеотидной очистки SNAP T7, во-первых, приготовьте буфер элюирования, смешивая 50 микролитров одного молярного следа, со 100 микролитрами пяти моляров хлорида натрия, с 850 микролитрами двойной дистиллированной воды.Затем поместите одну ионообменную колонну на образец в отдельные две миллилитровые центрифужные трубки и промывайте колонны с буфером очистки центрифугированием до тех пор, пока весь буфер не будет элюирован из каждой колонны. Разбавьте каждый образец буфером очистки при соотношении три к одному буферу очистки к образцу и загрузите 400 микролитров образца в каждую колонку. Когда весь буфер будет элюирован, как показано, соберите и пометьте поток для каждого образца.Промывайте колонны три раза 400 микролитрами буфера очистки на одну промывку до тех пор, пока весь буфер не будет элюирован за одну промывку, собирая и маркируя поток по мере необходимости. После последней промывки соберите элюированный белок, добавив 50 микролитров буфера элюирования в центр колонны и центрифугируя колонку три раза, пока все 50 микролитров буфера не будут элюированы. Соберите и пометьте элют после каждой центрифугирования, объединяя элют в одну трубку после последней центрифугирования, оставляя небольшой объем каждого элюта для анализа геля.Измерьте поглощение оставшихся элюдных аликвот на 260 и 280 нанометрах и добавьте глицерин в образцы в соотношении один к одному для хранения минус 20 градусов до их использования. Используйте 500 микролитровый центрификатор 30 килодалтон для буферного обмена общего элюированного продукта с 2-кратным буфером хранения. И измерьте поглощение, как показано.Затем добавьте глицерин в продукт в соотношении один к одному для хранения при температуре минус 20 градусов цельсия. Чтобы оценить элюирование с помощью SDS-PAGE, запустите образцы в соответствующей белковой лестнице на четырех-12% стекловидном геле в течение 35 минут при 200 вольтах или до тех пор, пока передняя часть красителя не мигрирует к концу геля. Чтобы продемонстрировать контрольную активность привязанного RNAP по требованию, смешайте 2,4 микролитра каждого шаблона с пятью микролитрами 5-кратного буфера отжига и 14,2 микролитрами двойной дистиллированной воды.Инкубируйте полученный один микромолярный двухцепочечный ДНК CAGE при 75 градусах Цельсия в течение двух минут. И отжигьте смысловые и античувственные штаммы ДНК промотора и малахитового зеленого аптамера таким же образом, как указано в таблице. В конце инкубации добавьте привязанный SNAP T7 RNAP к двухцепочечной КЛЕТКЕ ДНК в соотношении от одного до пяти моляров к конечной концентрации 500 наномолярных РНКП.Через 15 минут при комнатной температуре поместите образец на лед и смешайте 2,5 микролитра 10x буфера транскрипции in vitro с одним микролитром 25 миллимолярного рибонуклеозидтрифосфата, одним микролитром одного миллимолярного малахитового зеленого цвета, 2,5 микролитрами смеси RNAP CAGE, 2,5 микролитрами каждого из одних микромолярных факторов транскрипции A и B олигонуклеотидов, и три микролитра одного миллимолярного малахитового зеленого аптамера в 10 микролитрах двойной дистиллированной воды. В 15 микролитрах двойной дистиллированной воды создали вторую реакцию, содержащую 2,5 микролитра 10x буфера транскрипции in vitro, один микролитр 25-миллимолярной рибонуклеозидтрифосфатной смеси, один микролитр одного миллимолярного малахитового зеленого цвета, 2,5 микролитра смеси RNAP CAGE и три микролитра одного шаблона миллимолярного малахитового зеленого аптамера. Чтобы создать реакцию, содержащую только буфер, смешайте 2,5 микролитра 10x буфера транскрипции in vitro, один микролитр 25-миллимолярной рибонуклеозидтрифосфатной смеси, один микролитр одного миллимолярного малахитового зеленого и три микролитра одного миллимолярного малахитового зеленого аптамера в 17,5 микролитрах двойной дистиллированной воды.Когда все реакции будут подготовлены, перенесите каждую реакцию на 384-луночную пластину и контролируйте транскрипцию малахитового зеленого аптамера на считывателе флуоресцентных пластин в течение двух часов при 37 градусах Цельсия при возбуждении 610 нанометров и излучении 655 нанометров. В конце показаний поместите пластину на лед и запустите РНК-продукт из каждой лунки в денатурирующем 12%-TBE-мочевинном полиакриловом геле в буфере TBE 70 градусов Цельсия при 280 вольтах в течение 20 минут или до тех пор, пока передняя часть красителя не достигнет конца геля. Затем окрасьте гель окрашиванием нуклеиновой кислоты цианинового красителя в течение 10 минут на орбитальном шейкере, перед визуализацией, как показано.Успешная экспрессия и очистка рекомбинантного белка SNAP T7 RNAP может быть подтверждена с помощью SDS-PAGE. Следуя SDS-PAGE, ферментативная активность может быть подтверждена реакцией транскрипции in vitro. Успешное соединение функционализированных олигонуклеотидов BG может быть проверено с помощью 18% денатурирующего TBE-мочевины PAGE.По сравнению с немодифицированным олигонуклеотидом, добавление фрагмента BG к олигонуклеотиду увеличивает его молекулярную массу. Как наблюдалось в этом репрезентативном геле для окрашивания цианинового красителя для подтверждения днк-привязанной очистки T7 RNAP от избыточных олигонуклеотидов BG, начальный поток через фракцию содержал в основном избыток Олигонуклеотида BG, а также небольшую часть ДНК-привязанной полимеразы, которая не связывалась с катионообменной смолой. Фракции разбавления пула содержали только одну полосу олиго RNAP, вызванную связыванием цианинового красителя с олигонуклеотидным тросом, причем полоса повышенной концентрации продукта демонстрировала ту же, но более темную полосу, означающую успешную повышенную концентрацию.Те же закономерности наблюдаются при синем окрашивании Кумасси, с небольшим сдвигом подвижности геля, наблюдаемым в контроле неконъюгированной РНКП. Здесь показан флуоресцентный сигнал, производимый в конце транскрипции in vitro в кинетике реального времени. В этом анализе наблюдалась 336-кратная активация флуоресцентного сигнала, демонстрирующая надежный контроль активности полимеразы.При попытке этого протокола не забудьте тщательно смыть SDS с геля перед окрашиванием нуклеиновыми кислотами. Это связано с тем, что STS будет задерживать краситель в геле, что приводит к высокому фоновому сигналу. Применение нашего метода к большой генной цепи с несколькими каскадами покажет масштабируемость и компонуемость привязанной системы транскрипции.Этот метод в настоящее время используется для разработки генных схем, способных к вычислениям в стиле нейронной сети.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Адаптация Haptic Робот в 3Т МРТ

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

В пробирке Ассамблеи Semi-искусственные молекулярные машины и его использование для обнаружения повреждений ДНК

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Инкапсуляция Бесклеточные транскрипции и трансляции в машинный Пузырьки, для построения клеточных Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Развитие амелогенина-хитозана гидрогеля для<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Эмаль Восстановление с плотной интерфейса

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

<em&gt; In Vitro</em&gt; Ферментативный анализ для измерения транскрипции ингибирование галлия (III) и H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-трис (пентафторфенил) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Использование синтетической биологии инженеру живых клеток, которые взаимодействуют с программируемыми материалов

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Оптимизация мультиплекс на базе РНК выражение Assay, с использованием архивных материалов рака молочной железы

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...