Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

L.Y.T.C reconoce el generoso apoyo de New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), la Beca discovery del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Iniciativa de Medicina por Diseño de la Universidad de Toronto, que recibe fondos del Fondo de Excelencia en Investigación de Canadá First (CFREF).

1. Preparación del búfer
NOTA: La preparación del tampón de purificación de proteínas puede ocurrir en cualquier día; aquí, se hizo antes de comenzar los experimentos.
<ol><li>Preparar tampón de lisis/equilibrio que contenga 50 mM de tris(hidroximetil)aminometano (Tris), 300 mM de cloruro de sodio (NaCl), 5% de glicerol y 5 mM de β-mercaptoetanol (BME), pH 8. Agregue 1.5 mL de 1M Tris, 1.8 mL de 5M NaCl, 1.5 mL de glicerol, 25.2 mL de agua desionizada (ddH2O) en un tubo ...

<ol>
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Este estudio demuestra un enfoque inspirado en la nanotecnología del ADN para controlar la actividad de la ARN polimerasa T7 mediante el acoplamiento covalente de un RNAP T7 recombinante marcado con SNAP N-terminal con un oligonucleótido funcionalizado de BG, que posteriormente se utilizó para programar reacciones TMDSD. Por diseño, la etiqueta SNAP se colocó en el extremo N de la polimerasa, ya que el extremo C del ARNP T7 de tipo salvaje está enterrado dentro del núcleo de la estructura de la proteína y hace co...

La computación del ADN utiliza un conjunto de oligonucleótidos diseñados como medio para el cálculo. Estos oligonucleótidos están programados con secuencias para ensamblarse dinámicamente de acuerdo con la lógica especificada por el usuario y responder a entradas específicas de ácido nucleico. En los estudios de prueba de concepto, la salida del cálculo generalmente consiste en un conjunto de oligonucleótidos marcados fluorescentemente que se pueden detectar a través de electroforesis en gel o lectores de placas de fluorescencia. En los últimos 30 años, se han demostrado circuitos computacionales de ADN cada vez más complejos, como varias cascadas de lógica digital, redes de reacción química y redes neuronales1,2,3. Para ayudar con la preparación de estos circuitos de ADN, se han utilizado modelos matemáticos para predecir la funcionalidad de los circuitos genéticos sintéticos4,5,y se han desarrollado herramientas computacionales para el diseño de secuencias de ADN ortogonales6,7,8,9,10 . En comparación con las computadoras basadas en silicio, las ventajas de las computadoras de ADN incluyen su capacidad para interactuar directamente con biomoléculas, operar en solución en ausencia de una fuente de alimentación, así como su compacidad y estabilidad generales. Con el advenimiento de la secuenciación de próxima generación, el costo de sintetizar computadoras de ADN ha estado disminuyendo durante las últimas dos décadas a un ritmo más rápido que la Ley11de Moore. Las aplicaciones de tales computadoras basadas en ADN ahora están comenzando a surgir, como para el diagnóstico de enfermedades12,13, para alimentar la biofísica molecular14y como plataformas de almacenamiento de datos15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Figura 1: Mecanismo de desplazamiento de la cadena de ADN mediada por el dedo del pie. El punto de apoyo, δ, es una secuencia libre y sin encuadernar en un dúplex parcial. Cuando se introduce un dominio complementario (δ*) en una segunda hebra, el dominio de δ libre sirve como punto de apoyo para la hibridación, permitiendo que el resto de la hebra (ɑ*) desplace lentamente a su competidor a través de una reacción reversible de compresión / descompresión conocida como migración de hebras. A medida que aumenta la duración de δ, el ΔG para la reacción hacia adelante disminuye y el desplazamiento ocurre más fácilmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Hasta la fecha, la mayoría de las computadoras de ADN utilizan un motivo bien establecido en el campo de la nanotecnología dinámica del ADN conocido como desplazamiento de cadenas de ADN mediadas por dedo del pie (TMDSD, Figura 1)16. Este motivo consiste en un dúplex de ADN parcialmente de doble cadena (dsDNA) que muestra voladizos cortos de "puntera" (es decir, de 7 a 10 nucleótidos (nt)). Las hebras de "entrada" de ácido nucleico pueden interactuar con los dúplex parciales a través del punto de apoyo. Esto conduce al desplazamiento de una de las hebras del dúplex parcial, y esta hebra liberada puede servir como entrada para los dúplex parciales aguas abajo. Por lo tanto, TMDSD permite la señal en cascada y el procesamiento de información. En principio, los motivos ortogonales TMDSD pueden operar de forma independiente en solución, lo que permite el procesamiento paralelo de la información. Ha habido una serie de variaciones en la reacción de TMDSD, como el intercambio de hebras de ADN mediado por el punto de apoyo (TMDSE)17,los puntos de apoyo "sin fugas" con dominios de doble longitud18,los puntos de apoyo no coincidentes con la secuencia19y el desplazamiento de la hebra mediado por el "asidero"20. Estos principios de diseño innovadores permiten una energía y dinámica TMDSD más ajustadas para mejorar el rendimiento de la computación de ADN.
Los circuitos genéticos sintéticos, como los circuitos de genes transcripcionales, también son capaces de calcular21,22,23. Estos circuitos están regulados por factores de transcripción de proteínas, que activan o reprimen la transcripción de un gen uniéndose a elementos reguladores específicos del ADN. En comparación con los circuitos basados en ADN, los circuitos transcripcionales tienen varias ventajas. En primer lugar, la transcripción enzimática tiene una tasa de rotación mucho mayor que los circuitos de ADN catalítico existentes, generando así más copias de salida por copia única de entrada y proporcionando un medio más eficiente de amplificación de la señal. Además, los circuitos transcripcionales pueden producir diferentes moléculas funcionales, como aptámeros o ARN mensajero (ARNm) que codifican para proteínas terapéuticas, como resultados de cálculo, que pueden explotarse para diferentes aplicaciones. Sin embargo, una limitación importante de los circuitos transcripcionales actuales es su falta de escalabilidad. Esto se debe a que hay un conjunto muy limitado de factores de transcripción ortogonales basados en proteínas, y el diseño de novo de nuevos factores de transcripción de proteínas sigue siendo técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Figura 2: Abstracción y mecanismo del complejo polimerasa "tether" y "cage". (A y B) Una correa de oligonucleótidos se marca enzimáticamente a una polimerasa T7 a través de la reacción SNAP-tag. Una jaula que consiste en un promotor T7 "falso" con un voladizo de complemento de amarre le permite hibridarse con la correa y bloquear la actividad transcripcional. (C) Cuando el operador (a*b*) está presente, se une al punto de apoyo de la correa del oligonucleótido (ab) y desplaza la región b* de la jaula, permitiendo que se produzca la transcripción. Esta figura ha sido modificada de Chou y Shih27. Abreviaturas: RNAP = ARN polimerasa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Este artículo presenta un nuevo bloque de construcción para la computación molecular que combina las funcionalidades de los circuitos transcripcionales con la escalabilidad de los circuitos basados en ADN. Este bloque de construcción es un RNAP T7 unido covalentemente con una correa de ADN de cadena simple(Figura 2A). Para sintetizar este ARNP T7 atado al ADN, la polimerasa se fusionó con un SNAP-tag24 N-terminal y se expresó recombinantemente en Escherichia coli. La etiqueta SNAP se reaccionó con un oligonucleótido funcionalizado con el sustrato BG. La correa de oligonucleótidos permite el posicionamiento de los huéspedes moleculares en estrecha proximidad a la polimerasa a través de la hibridación del ADN. Uno de esos invitados fue un bloqueador transcripcional competitivo conocido como "jaula", que consiste en un dúplex de ADN promotor T7 "falso" sin gen aguasabajo (Figura 2B). Cuando se une al RNAP a través de su correa de oligonucleótidos, la jaula detiene la actividad de la polimerasa al superar a otras plantillas de ADN para la unión al RNAP, lo que hace que el RNAP esté en un estado "OFF"(Figura 2C).
Para activar la polimerasa a un estado "ON", se diseñaron plantillas de ADN T7 con dominios "operador" monocatenarios aguas arriba del promotor T7 del gen. El dominio operador (es decir, dominio a*b* Figura 2C)puede diseñarse para desplazar la jaula del RNAP a través de TMDSD y posicionar el RNAP proximal al promotor T7 del gen, iniciando así la transcripción. Alternativamente, también se diseñaron plantillas de ADN donde la secuencia del operador era complementaria a las hebras auxiliares de ácido nucleico que se conocen como "factores de transcripción artificiales" (es decir, hebras TFA y TFB en la Figura 3A). Cuando ambas hebras se introducen en la reacción, se ensamblarán en el sitio del operador, creando un nuevo dominio pseudo-contiguo a*b*. Este dominio puede desplazar la jaula a través de TMDSD para iniciar la transcripción(Figura 3B). Estas hebras pueden ser suministradas exógenamente o producidas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Figura 3: Programación selectiva de la actividad de la polimerasa a través de un activador de interruptor de tres componentes. (A) Cuando los factores de transcripción (TFA y TFB)están presentes, se unen al dominio del operador aguas arriba del promotor, formando una secuencia pseudo de cadena simple (a*b*) capaz de desplazar la jaula a través del desplazamiento del ADN mediado por el punto de apoyo. (B) Este dominio a*b* puede desplazar la jaula a través de TMDSD para iniciar la transcripción. Esta figura ha sido modificada de Chou y Shih27. Abreviaturas: TF = factor de transcripción; RNAP = ARN polimerasa; TMDSD = desplazamiento de la cadena de ADN mediada por el dedo del pie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El uso de factores de transcripción basados en ácidos nucleicos para la regulación transcripcional in vitro permite la implementación escalable de comportamientos de circuitos sofisticados como la lógica digital, la retroalimentación y la señal en cascada. Por ejemplo, se pueden construir cascadas de puertas lógicas diseñando secuencias de ácidos nucleicos de tal manera que las transcripciones de un gen aguas arriba activen un gen aguas abajo. Una aplicación que explota la cascada y la multiplexación que esta tecnología propuesta hace capaces es el desarrollo de circuitos de computación molecular más sofisticados para diagnósticos portátiles y procesamiento de datos moleculares. Además, la integración de la computación molecular y las capacidades de síntesis de ARN de novo puede permitir nuevas aplicaciones. Por ejemplo, se puede diseñar un circuito molecular para detectar uno o una combinación de ARN definidos por el usuario como ARN terapéuticos de entrada y salida o ARNm que codifican péptidos o proteínas funcionales para aplicaciones médicas en el punto de atención.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

La nanotecnología del ADN permite el autoensamblaje programable de ácidos nucleicos en formas y dinámicas prescritas por el usuario para diversas aplicaciones. Este trabajo demuestra que los conceptos de la nanotecnología del ADN se pueden utilizar para programar la actividad enzimática de la ARN polimerasa T7 derivada de fagos (RNAP) y construir redes reguladoras de genes sintéticos escalables. En primer lugar, un RNAP T7 atado a oligonucleótidos se diseña a través de la expresión de un RNAP marcado con SNAP N-terminal y el posterior acoplamiento químico de la etiqueta SNAP con un oligonucleótido modificado con bencilguanina (BG). A continuación, el desplazamiento de la hebra de ácido nucleico se utiliza para programar la transcripción de la polimerasa bajo demanda. Además, los conjuntos auxiliares de ácidos nucleicos se pueden utilizar como "factores de transcripción artificiales" para regular las interacciones entre el RNAP T7 programado por ADN con sus plantillas de ADN. Este mecanismo regulador de la transcripción in vitro puede implementar una variedad de comportamientos de circuitos como la lógica digital, la retroalimentación, la cascada y la multiplexación. La componibilidad de esta arquitectura reguladora de genes facilita la abstracción, estandarización y escalado del diseño. Estas características permitirán la creación rápida de prototipos de dispositivos genéticos in vitro para aplicaciones como la biodetección, la detección de enfermedades y el almacenamiento de datos.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Figura 5:Análisis SDS-PAGE de la expresión de SNAP T7 RNAP y ensayo de transcripción in vitro. (A) Análisis de purificación de proteínas SNAP T7 RNAP, snap T7 RNAP peso molecular: 119.4kDa. FT = flujo a través de la columna, W1 = fracciones de elución del tampón de lavado que contiene impurezas, E1-3 = fracciones de elución que cont...

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DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

Describimos la ingeniería de una nueva ARN polimerasa T7 atada al ADN para regular las reacciones de transcripción in vitro. Discutimos los pasos para la síntesis y caracterización de proteínas, validamos la regulación transcripcional de prueba de concepto y discutimos sus aplicaciones en computación molecular, diagnóstico y procesamiento de información molecular.

ARN polimerasa atado al ADN para transcripción in vitro programable y computación molecular

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Proponemos un método para regular la actividad de la polimerasa utilizando factores artificiales de transcripción de ácidos nucleicos. Esta arquitectura reguladora de genes puede servir como un bloque de construcción para futuros dispositivos genéticos in vitro. Al unir un dominio de unión al ADN a una ARN polimerasa T7, esta técnica combina la escalabilidad de los circuitos basados en el ADN, con la funcionalidad de los circuitos transcripcionales.Comience por hacer nueve diluciones de oligonucleótido BG monocatenario a un volumen final de 50 microlitros de agua destilada doble, de cinco a una a una a cinco proporciones, como se indica en la tabla. Prepare una mezcla de reacción para cada dilución mezclando dos microlitros de tampón SNAP con cuatro microlitros de oligonucleótido BG y cuatro microlitros de SNAP T7 RNAP. Prepare el control de RNAP reemplazando el oligonucleótido con agua destilada doble, y el control de ADN reemplazando el SNAP T7 RNAP con agua destilada doble.Configure 11 reacciones agregando dos microlitros de cada muestra a cuatro microlitros de tampón SNAP y dos microlitros de colorante de carga de proteínas por muestra. Calentar las reacciones durante 10 minutos a 70 grados centígrados, antes de cargar dos microlitros de cada muestra en un gel de proteína vítrea de cuatro a 12% durante 35 minutos de electroforesis en gel en hielo a 200 voltios. Al final de la carrera, lave el gel con tres intercambios de agua en un agitador durante al menos 10 minutos por lavado, seguido de tinción de ácido nucleico con tinte de cianina durante 15 minutos.Tome una imagen del gel en un sistema de imágenes de gel apropiado y vuelva a manchar el gel con 20 mililitros de azul Coomassie. Después de una hora, desmanche con agua destilada doble durante al menos una hora antes de volver a tomar imágenes del gel. Para la purificación SNAP T7 atada a oligonucleótidos, primero, prepare el tampón de elución mezclando 50 microlitros de un trazo molar, con 100 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares, con 850 microlitros de agua destilada doble.A continuación, coloque una columna de intercambio iónico por muestra en tubos centrífugos individuales de dos mililitros, y lave las columnas con tampón de purificación por centrifugación hasta que todo el tampón haya sido eluido de cada columna. Diluya cada muestra con tampón de purificación en una relación de tampón de purificación a muestra de tres a uno, y cargue 400 microlitros de muestra en cada columna. Cuando todo el tampón haya sido eluido como se ha demostrado, recolecte y etiquete el flujo para cada muestra.Lave las columnas tres veces con 400 microlitros de tampón de purificación por lavado hasta que todo el tampón haya sido eluido por lavado, recogiendo y etiquetando el flujo a través según corresponda. Después del último lavado, recoja la proteína eluida agregando 50 microlitros de tampón de elución en el centro de la columna y centrifugando la columna tres veces hasta que se hayan eluido los 50 microlitros de tampón. Recoger y etiquetar el eluido después de cada centrifugación, agrupando el elu en un solo tubo después de la última centrifugación, dejando un pequeño volumen de cada eluto para el análisis en gel.Mida la absorbancia de las alícuotas elutas restantes a 260 y 280 nanómetros, y agregue glicerol a las muestras en una proporción de uno a uno para menos 20 grados de almacenamiento hasta su uso. Utilice una unidad de filtro centrifical de 500 microlitros y 30 kilodalton para intercambiar en búfer el producto eluido total con un búfer de almacenamiento 2x. Y medir la absorbancia como se demuestra.Luego agregue glicerol al producto en una proporción de uno a uno para un almacenamiento de menos 20 grados centígrados. Para evaluar los elutos por SDS-PAGE, ejecute las muestras en una escalera de proteínas apropiada en un gel vítreo de cuatro a 12% durante 35 minutos a 200 voltios, o hasta que el frente del tinte migre al final del gel. Para demostrar la actividad de control bajo demanda del RNAP atado, mezcle 2,4 microlitros de cada plantilla con cinco microlitros de tampón de recocido 5x y 14,2 microlitros de agua destilada doble.Incubar el resultado de un micromolar de doble cadena DNA CAGE a 75 grados Centígrados durante dos minutos. Y anneal el sentido y las cepas anti-sentido del promotor y la plantilla de ADN del aptámero verde de malaquita de la misma manera que se indica en la tabla. Al final de las incubaciones, agregue el SNAP T7 RNAP atado al ARN CAGE de doble cadena en una proporción de uno a cinco molares a una concentración final de 500 RNAP nanomolar.Después de 15 minutos a temperatura ambiente, coloque la muestra sobre hielo y mezcle 2,5 microlitros de tampón de transcripción in vitro 10x con un microlitro de 25 milimolares ribonucleósidos trifosfato, un microlitro de un milimolar verde de malaquita, 2,5 microlitros de la mezcla RNAP CAGE, 2,5 microlitros cada uno de las hebras de oligonucleótidos de los factores de transcripción micromolares A y B, y tres microlitros de una plantilla de aptámero verde de malaquita milimolar en 10 microlitros de agua destilada doble. En 15 microlitros de agua destilada doble, configure una segunda reacción que contenga 2,5 microlitros de tampón de transcripción in vitro 10x, un microlitro de mezcla de trifosfato de ribonucleósido milimolar, un microlitro de un verde de malaquita milimolar, 2,5 microlitros de la mezcla RNAP CAGE y tres microlitros de una plantilla de aptámero verde de malaquita milimolar. Para configurar una reacción que contenga solo tampón, mezcle 2,5 microlitros de tampón de transcripción in vitro 10x, un microlitro de mezcla de trifosfato de ribonucleósido milimolar, un microlitro de un verde de malaquita milimolar y tres microlitros de una plantilla de aptámero verde de malaquita milimolar en 17,5 microlitros de agua destilada doble.Cuando se hayan preparado todas las reacciones, transfiera cada reacción a una placa de 384 pocillos y monitoree la transcripción del aptámero verde de malaquita en un lector de placas de fluorescencia durante dos horas a 37 grados Celsius a una excitación de 610 nanómetros y una emisión de 655 nanómetros. Al final de la lectura, coloque la placa sobre hielo y ejecute el producto de ARN de cada pozo en un gel poliacrílico desnaturalizante de 12% de TBE-urea en tampón de TBE de 70 grados Celsius a 280 voltios durante 20 minutos, o hasta que el frente del tinte llegue al final del gel. Luego, manche el gel con tinción de ácido nucleico colorante cianina durante 10 minutos en un agitador orbitario, antes de obtener imágenes como se ha demostrado.Una expresión y purificación exitosa de la proteína SNAP T7 RNAP recombinante se puede confirmar utilizando SDS-PAGE. Siguiendo SDS-PAGE, la actividad enzimática puede ser validada por reacción de transcripción in vitro. El acoplamiento exitoso de oligonucleótidos funcionalizados BG se puede verificar a través de TBE-urea PAGE de desnaturalización del 18%.En comparación con el oligonucleótido no modificado, la adición de la fracción BG al oligonucleótido aumenta su peso molecular. Como se observa en este gel representativo de tinción de colorante de cianina para confirmar la purificación de RNAP T7 atado al ADN del exceso de oligonucleótidos BG, el flujo inicial a través de la fracción contenía principalmente un exceso de oligonucleótido BG, así como una pequeña porción de la polimerasa atada al ADN que no se unió a la resina de intercambio catiónico. Las fracciones de dilución de la piscina contenían solo la banda única de oligo RNAP causada por la unión del colorante de cianina a la correa de oligonucleótidos, con el carril del producto concentrado hacia arriba exhibiendo la misma banda, pero más oscura, lo que significa una concentración ascendente exitosa.Los mismos patrones se observan por tinción azul de Coomassie, con un pequeño cambio de movilidad del gel observado en el control de RNAP no conjugado. Aquí, se muestra la señal fluorescente producida al final de la transcripción in vitro en cinética en tiempo real. En este análisis, se observó una activación de 336 veces en la señal de fluorescencia, demostrando un control robusto de la actividad de la polimerasa.Al intentar este protocolo, recuerde lavar bien el SDS del gel antes de la tinción de ácido nucleico. Esto se debe a que STS atrapará el tinte en el gel, lo que resultará en una alta señal de fondo. La aplicación de nuestro método a un gran circuito genético con múltiples cascadas mostrará la escalabilidad y componibilidad del sistema de transcripción atado.Esta técnica se está utilizando actualmente para desarrollar circuitos genéticos capaces de computación de estilo de red neuronal.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

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