Name: dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

L.Y.T.C erkänner generöst stöd från New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant och University of Toronto's Medicine by Design Initiative, som får finansiering från Canada First Research Excellence Fund (CFREF).

1. Buffertberedning
OBS: Proteinreningsbuffertberedning kan ske vilken dag som helst; här gjordes det innan experimenten påbörjades.
<ol><li>Förbered lys-/jämviktsbuffert som innehåller 50 mM tris(hydroximetyl)aminometan (Tris), 300 mM natriumklorid (NaCl), 5% glycerol och 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Tillsätt 1,5 ml 1 M Tris, 1,8 ml 5M NaCl, 1,5 ml glycerol, 25,2 ml avjoniserat vatten (ddH2O) i ett 50 ml centrifugrör och tillsätt 10,5 μL av 14,2 M BME strax för...

<ol>
	<li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks.">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li><li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li><li>Chen, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA.">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li><li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+gene+networks.">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li><li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing:+advances+and+prospects.">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li><li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes.">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li><li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer.">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li><li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Mart&#237;nez-P&#233;rez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing:+A+multiobjective+evolutionary+approach.">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li><li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands:+enhanced+models,+scalability,+and+speed.">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li><li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+costs:+Data.">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li><li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics.">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA.">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li><li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage.">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).</li><li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DNA+to+power+nanostructures.">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li><li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA.">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li><li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems.">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li><li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement.">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).</li><li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -. B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handhold-mediated+strand+displacement:+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions.">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li><li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors.">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li><li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles.">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).</li><li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits.">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li><li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2.8+&#197;+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11.">2.8 &#197; crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. 301 (1), 117-128 (2000).</li><li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors.">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li><li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis.">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li><li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors.">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li><li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+elongation,+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase.">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li><li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase.">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li><li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sortase-tag+expressed+protein+ligation:+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step.">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li><li>Zhang, W. -. B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li></ol>

Denna studie visar en DNA-nanoteknik-inspirerad metod för att kontrollera aktiviteten hos T7 RNA polymeras genom att kovalent koppla en N-terminally SNAP-märkt rekombinant T7 RNAP med en BG-funktionaliserad oligonukleotid, som sedan användes för att programmera TMDSD reaktioner. Snap-taggen placerades av design vid polymerasens N-ändstation, eftersom C-ändstationen av vild-typ T7 RNAP är begravd i proteinstrukturkärnan och gör viktiga kontakter med DNA-mallen28. Tidigare försök att modi...

DNA-databehandling använder en uppsättning designade oligonukleotider som medium för beräkning. Dessa oligonukleotider programmeras med sekvenser för att dynamiskt montera enligt användarspecificerad logik och svara på specifika nukleinsyraingångar. I proof-of-concept studier består utdata av beräkningen vanligtvis av en uppsättning fluorescerande märkta oligonukleotider som kan detekteras via gelelektrofores eller fluorescensplatta läsare. Under de senaste 30 åren har alltmer komplexa DNA-beräkningskretsar demonstrerats, såsom olika digitala logikkaskader, kemiska reaktionsnätverk och neurala nätverk1,2,3. För att hjälpa till med beredningen av dessa DNA-kretsar har matematiska modeller använts för att förutsäga funktionaliteten hos syntetiska genkretsar4,5, och beräkningsverktyg har utvecklats för ortogonal DNA-sekvensdesign6,7,8,9,10 . Jämfört med kiselbaserade datorer inkluderar fördelarna med DNA-datorer deras förmåga att interagera direkt med biomolekyler, fungera i lösning i avsaknad av en strömförsörjning, liksom deras övergripande kompaktitet och stabilitet. Med tillkomsten av nästa generations sekvensering har kostnaden för att syntetisera DNA-datorer minskat under de senaste två decennierna i en takt snabbare än Moores lag11. Tillämpningar av sådana DNA-baserade datorer börjar nu dyka upp, till exempel för sjukdomsdiagnos12,13, för att driva molekylär biofysik14och som datalagringsplattformar15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Figur 1: Mekanism för tå-medierad DNA-strängförskjutning. Fästet, δ, är en fri, obunden sekvens på en partiell duplex. När en kompletterande domän (δ*) introduceras på en andra del, fungerar den fria δ domänen som ett tåfäste för hybridisering, vilket gör det möjligt för resten av strängen (ɑ*) att långsamt förskjuta sin konkurrent genom en zipping / unzipping reversibel reaktion som kallas strandmigrering. När längden på δ ökar minskar ΔG för den främre reaktionen och förskjutningen sker lättare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Hittills använder majoriteten av DNA-datorer ett väletablerat motiv inom området dynamisk DNA-nanoteknik som kallas tåmedierad DNA-strängförskjutning (TMDSD, figur 1)16. Detta motiv består av en delvis dubbelsträngad DNA-duplex (dsDNA) som visar korta "tågrepp" överhäng (dvs. 7- till 10 nukleotider (nt)). Nukleinsyra "ingångs" strängar kan interagera med de partiella duplexes genom tåfästet. Detta leder till förskjutning av en av strängarna från den partiella duplexen, och denna befriade sträng kan sedan fungera som inmatning för nedströms partiella duplex. Således möjliggör TMDSD signalkaskad och informationsbehandling. I princip kan ortogonala TMDSD-motiv fungera självständigt i lösning, vilket möjliggör parallell informationsbehandling. Det har förekommit ett antal variationer på TMDSD-reaktionen, såsom tå-medierad DNA-strängutbyte (TMDSE)17, "läckagefria" tågrepp med dubbellånga domäner18, sekvens-omaka tågrepp19och "handfäste"-medierad strandförskjutning20. Dessa innovativa designprinciper möjliggör mer finjusterade TMDSD-energier och dynamik för att förbättra DNA-datorprestanda.
Syntetiska genkretsar, såsom transkriptionsgenkretsar, kan också beräknas21,22,23. Dessa kretsar regleras av protein transkriptionsfaktorer, som aktiverar eller undertrycker transkription av en gen genom att binda till specifika regulatoriska DNA-element. Jämfört med DNA-baserade kretsar har transkriptionskretsar flera fördelar. För det första har enzymatisk transkription en mycket högre omsättningshastighet än befintliga katalytiska DNA-kretsar, vilket genererar fler kopior av utdata per enda kopia av indata och ger ett effektivare sätt att förstärka signalen. Dessutom kan transkriptionskretsar producera olika funktionella molekyler, såsom aptamerer eller budbärar-RNA-kodning (mRNA) kodning för terapeutiska proteiner, som beräkningsutgångar, som kan utnyttjas för olika tillämpningar. En stor begränsning av nuvarande transkriptionskretsar är dock deras brist på skalbarhet. Detta beror på att det finns en mycket begränsad uppsättning ortogonala proteinbaserade transkriptionsfaktorer, och de novo design av nya protein transkription faktorer förblir tekniskt utmanande och tidskrävande.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Figur 2: Abstraktion och mekanism för polymeraskomplexet "tjuder" och "bur". En bur som består av en "faux" T7 promotor med ett tjuder-komplement överhäng gör det möjligt att hybridisera till tjuder och blockera transkriptionsaktiviteten. c) När operatören (a*b*) är närvarande binder den till tåfästet på oligonukleotidtjudern (ab) och förskjuter b* -området i buret, vilket gör det möjligt att göra transkription. Denna siffra har ändrats från Chou och Shih27. Förkortningar: RNAP = RNA-polymeras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Detta dokument introducerar en ny byggsten för molekylär databehandling som kombinerar funktionerna i transkriptionskretsar med skalbarheten hos DNA-baserade kretsar. Denna byggsten är en T7 RNAP kovalent fäst med en endasträngad DNA-tjuder (figur 2A). För att syntetisera denna DNA-bundna T7 RNAP smältes polymeraset till en N-terminal SNAP-tagg24 och rekombinant uttryckt i Escherichia coli. SNAP-taggen reagerades sedan med en oligonukleotid som funktionaliserades med BG-substratet. Oligonukleotidtjudern gör det möjligt att placera molekylära gäster i närheten av polymeraset via DNA-hybridisering. En sådan gäst var en konkurrenskraftig transkriptionsblockerare kallad en "bur", som består av en "faux" T7-promotor DNA-duplex utan gen nedströms (figur 2B). När buret är bundet till RNAP via dess oligonukleotidtjuder, stannar det polymerasaktivitet genom att konkurrera ut andra DNA-mallar för RNAP-bindning, vilket gör RNAP i ett "OFF" -tillstånd (figur 2C).
För att aktivera polymeraset till ett "ON" tillstånd utformades T7 DNA-mallar med enkelsträngade "operatörsdomäner" uppströms T7-promotorn för genen. Operatordomänen (dvs. domän a *b* figur 2C) kan utformas för att förskjuta buret från RNAP via TMDSD och placera RNAP proximalt till genens T7-promotor och därmed initiera transkription. Alternativt utformades DNA-mallar där operatörssekvensen kompletterade hjälpkärnornas syrasträngar som kallas "artificiella transkriptionsfaktorer" (dvs. TFA- och TFB-strängar i figur 3A). När båda delarna introduceras i reaktionen monteras de på operatörsplatsen, vilket skapar en ny pseudokontrigant domän a *b*. Den här domänen kan sedan förskjuta buret via TMDSD för att initiera transkription (figur 3B). Dessa strängar kan levereras antingen exogent eller produceras.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Bild 3: Selektiv programmering av polymerasaktivitet genom en trekomponents switchaktivator. a) När transkriptionsfaktorerna (TFA och TFB) förekommer binder de till arrangörens operatörsdomän uppströms och bildar en pseudo enkelsträngad sekvens (a*b*) som kan förskjuta buren genom tåmedierad DNA-förskjutning. (B) Denna a * b * domän kan förskjuta buret via TMDSD för att initiera transkription. Denna siffra har ändrats från Chou och Shih27. Förkortningar: TF = transkriptionsfaktor; RNAP = RNA-polymeras; TMDSD = tå-medierad DNA-strängförskjutning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Användningen av nukleinsyrabaserade transkriptionsfaktorer för transkriptionell reglering in vitro möjliggör skalbar implementering av sofistikerade krets beteenden som digital logik, feedback och signal kaskad. Man kan till exempel bygga logiska grindkaskader genom att designa nukleinsyrasekvenser så att transkriptionerna från en uppströms gen aktiverar en nedströmsgen. En applikation som utnyttjar kaskad och multiplexering som möjliggörs av denna föreslagna teknik är utvecklingen av mer sofistikerade molekylära datorkretsar för bärbar diagnostik och molekylär databehandling. Dessutom kan integrering av molekylär databehandling och de novo RNA syntes kapacitet möjliggöra nya applikationer. Till exempel kan en molekylär krets utformas för att upptäcka en eller en kombination av användardefinierade RNAs som ingångar och utdata terapeutiska RNAs eller mRNAs kodning funktionella peptider eller proteiner för point-of-care medicinska tillämpningar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TWN510.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SD8135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD0435</td>
			<td>Tablets used to make 10 mM buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x in vitro transcription (IVT) buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Isopropyl &#946;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SRB1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide (19:1)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A00062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS protein sample loading buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mM dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x gel loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose B powder</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-GLA-NHS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S9151S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 competent E. coli</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye prestained protein ladder</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>PM007-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysogeny broth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2542-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2437-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;N&#39;-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS running buffer (20x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LSNP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (cage sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA 
			TTAATACGACTCACTATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT 
			CTCGCCAGTCGGGATCCTATA 
			GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT 
			TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (malachite green aptamer sense)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGATC 
			CCGACTGGCGAGAGCCAGGT 
			AACGAATGGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor A)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide (Transcription Factor B)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA 
			TGGAACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide with 3&#8217; Amine modification (tether)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC 
			TGA/3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce strong ion exchange spin columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom gene insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche mini quick DNA spin column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814419001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Low Range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>URE001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-tethered rna polymerase for programmable in vitro transcription and molecular computation

DNA-nanoteknik möjliggör programmerbar självmontering av nukleinsyror i användarförskrivna former och dynamik för olika tillämpningar. Detta arbete visar att begrepp från DNA-nanoteknik kan användas för att programmera den enzymatiska aktiviteten hos det fagerbaserade T7 RNA-polymeraset (RNAP) och bygga skalbara syntetiska genregleringsnätverk. För det första konstrueras en oligonukleotid-tjudrade T7 RNAP genom uttryck av en N-terminalt SNAP-märkt RNAP och efterföljande kemisk koppling av SNAP-taggen med en bensylguanin (BG)-modifierad oligonukleotid. Därefter används nukleinsyrasträngförskjutning för att programmera polymeras transkription på begäran. Dessutom kan hjälp nukleinsyraaggregat användas som "artificiella transkriptionsfaktorer" för att reglera interaktionerna mellan dna-programmerade T7 RNAP med dess DNA-mallar. Den här reglerings mekanismen för in vitro-transkription kan implementera en mängd olika krets beteenden som digital logik, feedback, kaskad och multiplexering. Composability av denna gen reglerande arkitektur underlättar design abstraktion, standardisering och skalning. Dessa funktioner kommer att möjliggöra snabb prototyping av in vitro genetiska enheter för applikationer som bioavkänning, sjukdomsdetektering och datalagring.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Figur 5: SDS-PAGE analys av SNAP T7 RNAP uttryck och in vitro transkription analys. (A) SNAP T7 RNAP protein rening analys, SNAP T7 RNAP molekylvikt: 119.4kDa. FT = genomströmning från kolonnen, W1 = elutionsfraktioner av tvättbuffert som innehåller föroreningar, E1-3 = elutionsfraktioner som innehåller renad produkt och DE = 10x utspä...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation at JoVE.com

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

Vi beskriver tekniken av en ny DNA-tjudrade T7 RNA polymeras för att reglera in vitro transkription reaktioner. Vi diskuterar stegen för proteinsyntes och karakterisering, validerar proof-of-concept transkriptionell reglering och diskuterar dess tillämpningar inom molekylär databehandling, diagnostik och molekylär informationsbehandling.

DNA-tjudrat RNA-polymeras för programmerbar in vitro-transkription och molekylär beräkning

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Vi föreslår en metod för att reglera polymeras verksamhet med hjälp av konstgjorda nukleinsyra transkription faktorer. Denna genreglerande arkitektur kan fungera som en byggsten för framtida in vitro genetiska enheter. Genom att binda en DNA-bindningsdomän till en T7 RNA-polymeras kombinerar denna teknik skalbarheten hos DNA-baserade kretsar, med funktionaliteten hos transkriptionskretsar.Börja med att göra nio utspädningar av enkelsträngad BG-oligonukleotid till en slutlig volym på 50 mikroliter dubbeldestillerat vatten, från fem till ett till ett till fem förhållanden, som anges i tabellen. Förbered en reaktionsblandning för varje utspädning genom att blanda två mikroliter SNAP-buffert med fyra mikroliter BG-oligonukleotid och fyra mikroliter SNAP T7 RNAP. Förbered RNAP-kontrollen genom att ersätta oligonukleotid med dubbeldestillerat vatten och DNA-kontrollen genom att ersätta SNAP T7 RNAP med dubbeldestillerat vatten.Ställ in 11 reaktioner genom att tillsätta två mikroliter av varje prov till fyra mikroliter SNAP-buffert och två mikroliter proteinbelastningsfärg per prov. Värm reaktionerna i 10 minuter vid 70 grader Celsius, innan du laddar två mikroliter av varje prov på en fyra till 12% glasaktig proteingel i 35 minuter gelelektrofores på is vid 200 volt. Tvätta gelén i slutet av körningen med tre vattenbyten på en shaker i minst 10 minuter per tvätt, följt av nukleinsyrafärgning med cyaninfärg i 15 minuter.Avbilda gelén på ett lämpligt gelavbildningssystem och färga gelén igen med 20 ml Coomassie blå. Efter en timme, avfläcka med dubbeldestillerat vatten i minst en timme innan du avbildar gelén igen. För oligonukleotidtjuderad SNAP T7-rening bereder du först elutionsbufferten genom att blanda 50 mikroliter av ett molarspår, med 100 mikroliter av fem molarnatriumklorid, med 850 mikroliter dubbeldestillerat vatten.Placera sedan en jonutbyteskolonn per prov i enskilda fem milliliter centrifugrör och tvätta kolonnerna med reningsbuffert genom centrifugering tills hela bufferten har eliserats från varje kolumn. Späd varje prov med reningsbuffert vid en tre till en reningsbuffert till provförhållande och lasta 400 mikroliter prov i varje kolumn. När hela bufferten har eluterats enligt vad som visats, samla in och märka flödet genom för varje prov.Tvätta kolonnerna tre gånger med 400 mikroliter reningsbuffert per tvätt tills all buffert har eluterats per tvätt, samla in och märka flödet genom vad som är lämpligt. Efter den sista tvätten samlar du upp det eluterade proteinet genom att tillsätta 50 mikroliter elutionsbuffert i mitten av kolonnen och centrifugera kolonnen tre gånger tills alla 50 mikroliter buffert har eluterats. Samla och märka elute efter varje centrifugering, slå samman eluten i ett enda rör efter den sista centrifugeringen, samtidigt som en liten volym av varje elute för gelanalys.Mät absorbansen av de återstående elute alikvoterna vid 260 och 280 nanometer och tillsätt glycerol till proverna med ett 1-till-1-förhållande för minus 20 graders lagring tills de används. Använd en 500 mikroliter 30 kilodalton centrifical filterenhet för att buffertutbyte den totala eluteprodukten med 2x lagringsbuffert. Och mäta absorbansen som visats.Lägg sedan till glycerol till produkten med ett 1-till-1-förhållande för minus 20 grader Celsius lagring. För att bedöma elutes av SDS-PAGE, kör proverna i en lämplig proteinstege på en fyra till 12% glaskroppsgel i 35 minuter vid 200 volt, eller tills färgfronten migrerar till gelens ände. För att demonstrera den tjudrade RNAP:s kontrollaktivitet på begäran, blanda 2,4 mikroliter av varje mall med fem mikroliter av 5x glödgningsbuffert och 14,2 mikroliter dubbeldestillerat vatten.Inkubera den resulterande en mikromolar dubbelsträngad DNA-BUR vid 75 grader Celsius i två minuter. Och glödga känslan och anti-sense stammar av promotorn och malakitgrön aptamer DNA mall på samma sätt som anges i tabellen. I slutet av inkubationerna, tillsätt den tjudrade SNAP T7 RNAP till den dubbelsträngade DNA-BUREN vid ett en till fem molarförhållande till en slutlig koncentration av 500 nanomolar RNAP.Efter 15 minuter vid rumstemperatur, placera provet på is och blanda 2,5 mikroliter av 10x in vitro transkriptionsbuffert med en mikroliter på 25 millimolar ribonukleosidetrifosfat, en mikroliter av en millimolar malakitgrön, 2,5 mikroliter av RNAP CAGE-blandningen, 2,5 mikroliter vardera av en mikromolar transkriptionsfaktor A och B oligoner. och tre mikroliter av en millimolär malakitgrön aptamermall i 10 mikroliter dubbeldestillerat vatten. I 15 mikroliter av dubbeldestillerat vatten, sätt upp en andra reaktion som innehåller 2,5 mikroliter av 10x in vitro transkriptionsbuffert, en mikroliter av 25 millimolar ribonukleoside trifosfatblandning, en mikroliter av en millimolar malachite grön, 2,5 mikroliter av RNAP CAGE-blandningen och tre mikroliter av en millimolar malachite grön aptamermall. För att skapa en reaktion som endast innehåller buffert, blanda 2,5 mikroliter av 10x in vitro-transkriptionsbuffert, en mikroliter av 25 millimolar ribonukleosidetrifosfatblandning, en mikroliter av en millimolär malakitgrön och tre mikroliter av en millimolar malakitgrön aptamermall i 17,5 mikroliter dubbeldestillerat vatten.När alla reaktioner har förberetts, överför varje reaktion till en 384-brunnsplatta och övervaka malakitgrön aptamer-transkription på en fluorescensplattaläsare i två timmar vid 37 grader Celsius vid en 610 nanometer excitation och en 655 nanometer utsläpp. I slutet av avläsningen, placera plattan på is och kör RNA-produkten från varje brunn i en denaturerande 12%TBE-urea polyakrylgel i 70 grader Celsius TBE-buffert vid 280 volt i 20 minuter, eller tills färgfronten når gelens ände. Färga sedan gelén med cyaninfärgning nukleinsyra fläck i 10 minuter på en orbital shaker, innan imaging som visats.Ett framgångsrikt uttryck och rening av det rekombinanta SNAP T7 RNAP-proteinet kan bekräftas med hjälp av SDS-PAGE. Efter SDS-PAGE kan den enzymatiska aktiviteten valideras genom in vitro-transkriptionsreaktion. Framgångsrik koppling av BG funktionaliserade oligonukleotider kan verifieras via 18%denaturering TBE-urea PAGE.Jämfört med den oförändrade oligonukleotid ökar tillsatsen av BG-moiety till oligonukleotid dess molekylvikt. Som observerats i denna representativa cyanin färgfläckgel för att bekräfta DNA-tjudrade T7 RNAP rening från överskott BG oligonukleotider, det första flödet genom fraktionen innehöll mestadels överskott BG oligonukleotid, liksom en liten del av DNA-bundna polymeras som inte binder till katjon utbytesharts. Poolutspädningsfraktionerna innehöll endast det enda bandet RNAP-oligo som orsakades av cyaninfärgämnet som binder till oligonukleotidtjudret, med den uppkoncentrerade produktfilen som uppvisar samma, men mörkare band som betecknar en framgångsrik uppkoncentration.Samma mönster observeras av Coomassie blå färgning, med en liten gel rörlighet skift observeras i den icke konjugerade RNAP kontroll. Här visas fluorescerande signal som produceras i slutet av in vitro-transkriptionen i realtidskinetik. I denna analys observerades en 336 faldig aktivering i fluorescenssignal, vilket visar en robust kontroll av polymerasaktivitet.När du försöker detta protokoll, kom ihåg att noggrant tvätta SDS från gelén innan nukleinsyrafärgning. Detta beror på att STS kommer att fånga färgämnet i gelén, vilket resulterar i hög bakgrundssignal. Att tillämpa vår metod på en stor genkrets med flera kaskader kommer att visa skalbarheten och kompositionabiliteten hos det tjudrade transkriptionssystemet.Denna teknik används för närvarande för att utveckla genkretsar som kan neurala nätverksstilberäkningar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Anpassning av en haptisk robot i en 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro-Montering av Semi-konstgjorda molekylär maskin och dess användning för detektion av DNA-skador

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Utveckling av Amelogenin-chitosan Hydrogel för<em&gt; In Vitro</em&gt; Emalj Återväxt med en Tät gränssnitt

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatisk analys för att mäta transkription Hämning av gallium (III) och H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation av katjoniska Nanoliposomes för effektiv leverans av In Vitro transkriberas budbärar-RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel Mikroarrayer för chemotaktisk och molekylär analys av human neutrophil svärma in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...