Name: organoid-derived epithelial monolayer: a clinically relevant in vitro model for intestinal barrier function
Uploaded: 2021-07-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function at JoVE.com

この研究は 、Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland(LSH-TKI )の官民パートナーシップ(PPP)手当によって支援されており、プロジェクト番号LSHM16021オルガノイドは、Hubrecht Organoid Technology(HUB)への毒物学モデリングのための新しいツールとして、HUBは疾患モデリングおよび毒物学部門に内部資金を供給しています。我々は、Sabine Middendorp(小児胃腸科、Wilhelmina Children's Hospital、UMC、Utrecht)およびHugo R. de JongeおよびMarcel J.C. Bijvelds(消化器科および肝臓科、エラスムスMC、ロッテルダム)の研究室が、膜挿入物に単層を設置するための初期技術サポートを提供してくれたことに感謝します。

1. 培養用試薬の調製
注: バイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行し、細胞培養の操作に関する標準ガイドラインに従ってください。紫外線は、バイオセーフティキャビネットを起動する前に10分間使用されます。使用前および使用後、バイオセーフティキャビネットの表面を70%エタノールに濡らしたティッシュペーパーで洗浄する。細胞外マトリックス(ECM)?...

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	<li>Haegebarth, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling,+lgr5,+and+stem+cells+in+the+intestine+and+skin.">Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. 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F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5++intestinal+stem+cells+and+their+progeny.">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids:+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients.">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+surrogate+Wnts+support+organoid+growth+and+deconvolute+Frizzled+pleiotropy+in+vivo.">Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Blume, L. -. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability.">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).</li><li>Lea, T., Verhoeckx, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cell+line.">Caco-2 cell line.</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 103-111 (2015).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li></ol>

このプロトコールは、腸管オルガノイドの一般的な操作および維持、ならびにこれらのオルガノイドに由来する上皮単層の調製および可能な適用を記載する。今日まで、単層は、十二指腸、回腸、および正常および以前におよび活発に炎症を起こした腸組織に由来する結腸オルガノイドの異なる領域から首尾よく調製されてきた(未発表データ)。患者由来のオルガノイド単層の適用は、疾患?...

腸上皮は、腸の管腔内容物と下層組織との間の物理的障壁として作用する。この障壁は、タイトジャンクションによって接続された主に吸収性腸細胞の単一の上皮層を含み、隣接する細胞間の強力な細胞間接続を確立する。これらの細胞は、腸の頂端(管腔)側と側底側を分離する分極上皮ライニングを形成し、同時に消化された栄養素および代謝産物の傍細胞輸送を調節する。腸細胞に加えて、ゴブレット、パネス、および腸内分泌細胞などの他の重要な上皮細胞も、それぞれ粘液、抗菌ペプチド、およびホルモンを産生することによって腸の恒常性に寄与する。腸上皮は、ロイシンに富む反復含有Gタンパク質共役型受容体5陽性(LGR5+)幹細胞を腸陰窩の底部で分裂させることによって絶えず補充され、上方に移動して他の細胞型に分化するトランジット増幅(TA)細胞を産生する1。食物アレルゲン、薬効化合物、微生物病原体への曝露などの遺伝的および環境的要因による腸上皮恒常性の破壊は、腸のバリア機能の破壊につながる。これらの状態は、炎症性腸疾患(IBD)、セリアック病、および薬物誘発性GI毒性を含むいくつかの腸疾患を引き起こす2。
腸上皮に関する研究は、膜挿入物、臓器オンチップシステム、ウッシングチャンバー、腸リングなどのいくつかのin vitroプラットフォームシステムを使用して行われます。これらのプラットフォームは、形質転換細胞株または一次組織をモデルとして使用して、膜の頂端側および側底側の両方にアクセスする分極上皮単層を確立するのに適している。結腸直腸(アデノ)癌細胞株Caco-2、T84、HT-29などの形質転換細胞株は、分極腸腸細胞または粘液産生細胞にある程度分化することができるが、いくつかの細胞型が欠落しており、様々な受容体およびトランスポーターが異常に発現しているため、in vivo上皮を代表するものではない3.さらに、細胞株は単一のドナーに由来するため、患者間の不均一性を表すものではなく、複雑さと生理学的関連性の低下に苦しんでいます。Ussingチャンバーおよび腸管輪として使用される一次組織は、in vivo状況をより代表的ですが、それらの限られた可用性、短期的な生存率、および拡張性の欠如により、ハイスループット(HT)研究の媒体としては不適切です。
オルガノイドは、腸、腎臓、肝臓、膵臓、肺などの異なる器官から確立されたインビトロ上皮培養物である。それらは、長期的で安定した拡張性ならびに遺伝的および表現型の安定性を有することが証明されており、したがって、外部刺激に対する忠実な応答を有する元の器官の上皮の代表的な生物学的ミニチュアである4,5,6,7,8,9。オルガノイドは、切除または生検された正常、罹患、炎症、または癌組織のいずれかから効率的に確立され、不均一な患者特異的応答を表す10、11、12、13、14、15、16。本稿では、オルガノイド培養物由来の腸上皮単層を確立する方法を実証する。単層は、小腸ならびに結腸および直腸オルガノイド培養物から首尾よく確立されている。このモデルは、上皮細胞の薬物への輸送と透過性、ならびに上皮に対するそれらの毒物学的効果を研究する機会を作り出す。さらに、このモデルにより、免疫細胞および細菌との共培養が腸上皮との相互作用を研究することができる17、18、19。さらに、このモデルは、患者固有の方法で治療に対する応答を研究し、上皮バリアに焦点を当てた治療の次の波を探すためのスクリーニング努力を開始するために使用することができる。このようなアプローチは、クリニックに拡張され、パーソナライズされた治療への道を開くことができます。
このプロトコールにおける上皮単層はヒト正常腸管オルガノイドから調製されるが、このプロトコルは他のオルガノイドモデルに適用され、最適化され得る。上皮オルガノイド単層は、幹細胞増殖を支持するためにWntを含有する腸管オルガノイド増殖培地中で培養され、腸管陰窩細胞組成物を表す。腸オルガノイドは、Wnt、Notch、および上皮成長因子(EGF)経路を調節することによって、腸細胞、パネス、ゴブレット、および腸内分泌細胞などの異なる腸上皮脂肪を有するように富化することができる。ここで、膨張培地中で単層が樹立された後、それらは、先に説明したように、より分化した腸上皮細胞に向かって駆動される20、21、22、23、24、25。スクリーニング目的のために、目的の化合物、その標的細胞、および実験条件の作用様式に応じて、単層を選択した細胞組成物に向かって駆動して、関連する機能的読み出しを有する化合物の効果を測定することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>10644795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250, 300, and 20 &#181;L low-retention filter-tips</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>732-1432 / 732-1434 / 732-2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351156</td>
			<td rowspan="2">Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well HTS Transwell plates (Table 1)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3378</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate with Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>PluriSelect</td>
			<td>43-50040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black plate transparent bottom</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well fast thermal cycling plates</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well HTS Fluoroblok Transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well HTS Transwell plates (Table 1)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well transparent culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microscope (light / optical microscope)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated H2O</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>750024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>E22013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 meter with STX electrode</td>
			<td>WTI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Volac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Rspo3</td>
			<td>Bio-Techne Ltd</td>
			<td>3500-RS/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-105-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 primary antibody</td>
			<td>Sanbio</td>
			<td>BSH-7302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K400111-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kova International Glasstic Slide with Counting grids</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>10298483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4358293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 8-Cap Strips</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120 086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (1000, 200, and 20 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-15334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 secondary antibody</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRKS/DPVR-HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (200 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS Wnt</td>
			<td>U-Protein Express</td>
			<td>N001-0.5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide ALPI1/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>GGAGTTATCCTGCTCCCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide ALPI1/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide LGR5/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>ACACGTACCCACAGAAGCTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide LGR5/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>GGAATGCAGGCCACTGAAAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide MUC2/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide MUC2/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide TBP/Forward</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>ACGCCGAATATAATCCCAAGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide TBP/Reverse</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive covers</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Fisher Emergo</td>
			<td>A25776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ANT-PM-2</td>
			<td>antimicrobial formulation for primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>Q32852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir for multichannel pipet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe</td>
			<td>WTI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>87023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor (Pipet-Aid)</td>
			<td>Drummond</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript 1st strand system for RT-PCR</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>11904018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Spark 10M plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td>
			<td>Life Technologies Europe BV</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>AbMole</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organoid-derived epithelial monolayer: a clinically relevant in vitro model for intestinal barrier function

過去には、腸上皮モデル系は形質転換細胞株および初代組織に限定されていた。これらのモデル系は、前者が元の組織生理学を忠実に表していないため、固有の限界があり、後者の利用可能性は限られている。したがって、それらの適用は基礎的および医薬品開発研究を妨げる。成体幹細胞ベースのオルガノイド(以下、オルガノイドと呼ぶ)は、それらが由来する正常または罹患した上皮組織のミニチュアである。それらは、異なる胃腸(GI)管領域から非常に効率的に確立することができ、長期的な拡張性を有し、インビトロでの治療に対する組織および患者特異的応答をシミュレートすることができる。ここでは、腸管オルガノイド由来上皮単層の確立が、上皮バリアの完全性、透過性および輸送、抗菌タンパク質分泌、ならびに組織学を測定する方法とともに実証されている。さらに、腸管オルガノイド由来単層は、増殖する幹およびトランジット増幅細胞、ならびに重要な分化上皮細胞で富化することができる。したがって、それらは、標的細胞およびそれらの作用機序に対する化合物の効果を研究するために調整することができるモデル系を表す。オルガノイド培養は、いったん確立されると、細胞株よりも技術的に要求が厳しいですが、生体内上皮の複雑さと患者間の不均一性を真に表すため、医薬品開発の後期段階での失敗を減らすことができます。

図1Aは、それらをクライオビアルから解凍した後の腸管オルガノイドの代表的な明視野画像を示す。最適な回収率を確保するためには、オルガノイドを高密度で解凍することが重要です。オルガノイドは、約10μLのECMドーム内の24ウェルまたは6ウェルプレートに播種される(図1B)。ほとんどの正常な腸オルガノイドは嚢胞性形態を有する。解凍プロ?...

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Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

オルガノイド由来の単層は、患者の腸上皮バリア機能を再現し、各患者の機能障害を増強することを目的とした治療法の効果を試験して、パーソナライズされた治療戦略を特定することを可能にする。オルガノイド単層は、損傷が起こる側である上皮の頂端側へのアクセスを提供し、3D構造として成長するオルガノイドにおいて正常でアクセス可能である。すべてのオルガノイドは異なるため、闘争です。タイトな単層を形成するには、増殖期にオルガノイドを使用し、迅速に消化して2〜4個の細胞のクラスターを形成する。すべてのモデルについて細胞播種を滴定する。手順のデモンストレーションは、HUBのシニアリサーチアソシエイトであるWies Van Dooremalenによって行われます。膜挿入物を細胞外マトリックスまたはECMでコーティングすることから始める。バイオセーフティキャビネットで作業し、メンブレンインサートを支持プレートに入れます。ECM 40Xを氷冷DPBS中でカルシウムおよびマグネシウムで希釈し、次いで、希釈ECMの150マイクロリットルを各インサートの頂端区画にピペットする。プレートを摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートする。播種用の細胞を準備するには、細胞解離試薬のアリコートを摂氏37度の水浴中で予備温める。6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルの試薬を使用する。オルガノイドを含む培養プレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移す。テキスト原稿に記載されているようにオルガノイドを処理しますが、複数のチューブを1つのチューブにプールしないでください。オルガノイドを回収した後、基礎培地またはBMを12ミリリットルに加え、85倍Gで遠心分離し、上清を吸引する。オルガノイドを含むチューブを最大12ミリリットルのDPBSで満たし、次に10ミリリットルのピペットを使用してピペットを10回上下させます。Gを85回で8°Cで5分間遠心分離し、オルガノイドペレットを乱すことなく上清を吸引する。予め加温した細胞解離試薬をオルガノイドに加え、それらを再懸濁し、次いで、チューブを37°Cの水浴中で斜めまたは水平に5分間インキュベートする。インキュベーション後、5ミリリットルの滅菌プラスチックピペットまたはP1000ピペットを用いてピペットを10回上下させる。顕微鏡下でオルガノイド懸濁液をチェックして、単一細胞と2〜4個の細胞からなるいくつかの細胞凝集塊の混合物が形成されたかどうかを確認する。ROCK阻害剤を細胞懸濁液に最大12ミリリットルのBMを添加することによって細胞解離を止める。細胞を遠心分離し、次いで細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。同じオルガノイド培養物を複数のチューブで処理する場合は、細胞ペレットをプールしてから、12ミリリットルのBMに再懸濁してください。BMで予め濡れた40マイクロメートルのストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、フロースルーを50ミリリットルの円錐形チューブに収穫し、次いでストレーナーを10ミリリットルのBMで洗浄し、フロースルーを同じチューブに収穫する。緊張した細胞懸濁液を2つの新しい15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離を繰り返す。細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、出発物質として使用した完全培養プレートあたり10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した4ミリリットルのIEMに細胞を再懸濁する。少量の細胞懸濁液をトリパンブルーと1対1の比率で混合してカウントし、細胞をカウントし、生細胞の総数を計算し、個々のセルを小さな凝集塊でカウントします。IEMの6ミリリットル当たり10~10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した6番目の生細胞を含む細胞懸濁液を調製する。細胞を播種するには、ECMコーティングされたインサートからDPBSを慎重に吸引し、プレートを水平に保ちます。各側底区画にROCK阻害剤を添加したIEMのピペット800マイクロリットルと、頂端区画内のECMコーティング膜上に調製した細胞懸濁液150マイクロリットルを滴下する。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。細胞が膜上に沈降したら、経上皮電気抵抗またはTEERを毎日測定し、顕微鏡を使用して膜挿入物を画像化する。単層をリフレッシュするには、膜インサートを含むプレートの側底区画から培地を除去し、次いで、頂端区画から培地を注意深く吸引する。150マイクロリットルの新鮮なIEMを各頂端コンパートメントに滴下し、800マイクロリットルの新鮮なIEMを各側方コンパートメントに加える。手動TEERメーターを使用する場合は、電極を70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネット内で空気乾燥させてから、電極をBMを含むチューブに入れます。電極を手動TEERメーターに接続し、オーム単位で測定する機能スイッチを回し、電源スイッチをオンにします。短い電極をインサートの頂端室に配置し、長い電極を単分子層に触れることなく側方区画に配置します。ブランクウェルの抵抗を測定し、次に残りのサンプルで抵抗を測定します。異なる条件のサンプル間で電極をBMで洗浄する。終了したら、デミ水と70%エタノールで電極をきれいにしてから、風乾させます。このプロトコールは、腸管オルガノイドを採取し、上皮細胞の単層を調製するために使用された。IEMで8日間培養した単層をここに示す。単層を腸球分化培地またはEDMに曝露すると構造が観察され、一方、単層を併用培地またはCDMに曝露すると、より滑らかな構造を示す。単層形成は、TEERを測定することによって定量的に続いた。完全にコンフルエントな単分子膜は、約100オームセンチメートル平方のTEER値を有し、これはいずれかの分化培地に曝露されたときに増加した。全ての培地条件において単層は、ルシファーイエローに対するより低い見かけの透過性を示した。IEMで培養した回腸単層によるリゾチーム分泌は、EDMまたはCDMでコンフルエントになるまでおよびさらに4日間、IEMで培養した単層よりも高かった。IEM、IEMおよびそれに続くEDM、またはIEMおよびそれに続くCDMで培養された単層は、H&E、Ki67、MUC2、およびAlcian Blue染色で観察された形態に違いを示す。分化すると、増殖性細胞は減少し、杯細胞および腸球マーカー遺伝子発現は、LGR5、MUC2、およびアルカリホスファターゼ遺伝子発現によって示されるようにIEM条件下で観察されたものと比較して増加した。単層を調製する場合、それらを消化した後にオルガノイドのアノイキスを防止することが重要です。さらに、細胞内のECMはトランスウェル膜上に均等に分布すべきである。オルガノイド由来の単分子膜は、患者固有の方法で異なる蛍光基質を使用して分子輸送を評価することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

3Dで栽培ネイティブ腸とのCaco-2細胞において上皮輸送タンパク質の機能および発現を研究するための方法

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

腸の部分的な閉塞のマウス モデル

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

抗生物質処理された蚊による細菌性経口摂食アッセイ

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

電離放射線照射による腸管上皮再生

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...