Name: an economical and versatile high-throughput protein purification system using a multi-column plate adapter
Uploaded: 2021-05-21T13:00:00
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本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所（IDeA）以P20GM103451的资助和利物浦大学的内部研究补助金支持的研究。

1. 否认尼-NTA色谱
<ol><li>准备缓冲区 注：有关所有缓冲器的详细信息，请参阅表 1。<ol>
<li>组成 500 毫升的 0.5 M NaOH，确保先添加 Milli-Q 水，然后在烧嘴在搅拌器上时缓慢添加 NaOH。使用 0.22 μm 过滤器进行筛选。</li>
		<li>使用 0.22 μm 过滤器准备 100 mL 的 0.1 M 镍硫酸盐和过滤器。</li>
		<li>使用 0.22 μm 过滤器准备 50 mL 的 2 M 伊米达佐尔和过滤器。</li>
		<li>准备和 0.22 μm 过滤器 1.5 L 的 <s...

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Automated+Mid-Scale+Parallel+Protein+Purification+System+for+Antibody+Purification+and+Affinity+Chromatography.">Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography.</a> Protein Expression and Purification. , 128 (2016).</li><li>Renaud, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+in+Drug+Discovery:+Impact,+Challenges+and+Opportunities.+Nature+Reviews.">Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews.</a> Drug Discovery. 15 (10), (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Protein+Purification+and+Quality+Assessment+for+Crystallization.">High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization.</a> Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).</li><li>Pan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Metal+Affinity+NCTR+25+Tag+as+a+Better+Alternative+to+the+His-tag+for+the+Expression+of+Recombinant+Fused+Proteins.">A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins.</a> Protein Expression and Purification. , 164 (2019).</li><li>Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+HaloTag+Technology+to+Expression+and+Purification+of+Cannabinoid+Receptor+CB2.">Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2.</a> Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).</li><li>Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+the+Purification+of+Recombinant+Tagged+Proteins.">Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins.</a> Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).</li><li>Gaberc-Porekar, V., Menart, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography.">Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).</li><li>Anderson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Process+of+Structure-Based+Drug+Design.">The Process of Structure-Based Drug Design.</a> Chemistry &amp; Biology. 10 (9), (2003).</li><li>Cummin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High-Throughput+Purification+Method+for+Hit+Identification+in+Protein+Screening.">A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening.</a> Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).</li><li>Dominguez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Column+Plate+Adapter+Provides+an+Economical+and+Versatile+High-Throughput+Protein+Purification+System.">A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System.</a> Protein Expression and Purification. , 152 (2018).</li><li>Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+and+Classification+of+Native+Proteins+From+E.+Coli+Commonly+Co-Purified+by+Immobilised+Metal+Affinity+Chromatography.">Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).</li><li>Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Chromatography+for+Antibody+Purification.">Affinity Chromatography for Antibody Purification.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).</li><li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Biology+and+Drug+Discovery+for+Protein-Protein+Interactions.">Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).</li><li>Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. 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该方法是稳健和简单的使用相对缺乏经验的蛋白质生物化学家，但也有一些考虑要记住。
小心过度填充收集板
48 井收集板本身每口井仅容纳 5 mL，而每口 96 井仅持有 2 mL。在添加缓冲区并在列中运行样品时，需要牢记这一点，因为存在油井过多的风险。特别是，在将较大的样品转移到色谱柱进行净化时，需要小心谨慎。在超标超标的情况下?...

蛋白质纯化技术，以达到毫克的纯化蛋白质的数量是必不可少的，他们的特征和分析，特别是生物物理方法，如NMR。蛋白质纯化也是其他研究领域的核心，如药物发现过程和蛋白质-蛋白质相互作用研究：然而，实现如此数量的纯蛋白质可以成为这些技术的瓶颈1，2，3。蛋白质纯化的主要方法是色谱法，它包括各种依靠蛋白质的个体特征及其标签的方法。在亲和色谱中，蛋白质有一个额外的蛋白质或肽图案，作为一个标签，对色谱树脂4上的某一基质有亲和力。最常见的亲和力方法是使用他标记的蛋白质固定金属亲和力色谱 （IMAC），而另一种流行的方法是离子交换色谱，根据蛋白质的电荷分离蛋白质。对于最高的纯度，亲和色谱和离子交换的组合经常一起使用，通常需要昂贵的实验室设备来获得高通量。
功能蛋白质组学时代的发展正在推动对高通量技术的需求，以纯化不是单一的蛋白质进行特定分析，而是同时大量蛋白质进行综合分析和基因组广泛研究。固定金属亲和色谱 （IMAC） 是高通量蛋白质纯化6、7最广泛使用的方法之一，但其自动化系统对于较小的实验室8来说成本高昂且负担不起。目前可用的更经济实惠的基于板材的替代品采用无障碍实验室设备，如真空。虽然这些方法成功地提高了净化速度，但它只能在较小的规模上实现高通量纯化，只能在微克范围内产生蛋白质。这些限制意味着，在生物物理技术9之前，不能使用预包装的96井过滤板（例如，来自Ge医疗保健公司现在拥有Cytiva）。重力色谱是最经济高效的净化方法：但是，设置多个列不方便，并且可能容易出现多种蛋白质的错误。
多柱板适配器 （MCPA） 已开发和证明成功和方便地运行平行亲和色谱列一次净化他的标签酵母 SH3 域10.MCPA 提供一种经济高效的高通量净化方法，不依赖于昂贵的仪器仪表。其灵活的设计可以通过重力或真空歧管下的多个亲和力色谱柱有效纯化毫克蛋白质。此外，树脂类型、体积和其他参数可用于每个列进行调整，以便更快地优化。这项研究表明，MCPA 的离子交换色谱可用于 MCPA 与亲和力色谱相结合，以提高 Abp1 SH3 域的纯化。此外，使用这些方法可以并行分离多达 24 种不同的蛋白质。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL/ well collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201240-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL/ well collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201238-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well long drip plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>200919-100</td>
			<td>Come with 0.25 um filters which are to be removed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate seal/mat</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201158-100</td>
			<td>Should be peirceable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His60 Ni Superflow Resin</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>635660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP anion exchange column</td>
			<td>GE Healthcare (Cytiva)</td>
			<td>17115301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lvis plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with FLUOstar Omega plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male leur plugs</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45503-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>575650-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201244-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Repeater Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2226020</td>
			<td>With 5 mL and 50 mL syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUSAFE vacuum</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>158 320</td>
			<td>The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an economical and versatile high-throughput protein purification system using a multi-column plate adapter

蛋白质纯化是蛋白质结构和功能研究的必要条件，通常与生物物理技术相结合使用。它也是开发新疗法的关键组成部分。功能蛋白质组学的不断发展时代正在推动对高通量蛋白质纯化的需求，并改进了技术来促进这一需求。据推测，多柱板适配器（MCPA）可以将不同脂质的多个色谱柱与多井板对接，进行平行净化。这种方法提供了一种经济且多才多艺的蛋白质纯化方法，可在重力或真空下使用，与自动化系统的速度相媲美。MCPA可以用来通过一种经济实惠且省时的方法回收蛋白质的毫克产量，用于后续的定型和分析。MCPA 已用于 SH3 域的高吞吐量亲和力纯化。离子交换也通过MCPA证明净化蛋白质后Ni-NTA亲和色谱，表明该系统如何可以适应其他纯化类型。由于其设置具有多个列，参数的单独自定义可以在同一纯化中进行，目前基于板的方法无法实现。

例如，MCPA通过Ni-NTA（图2A）成功地在变性条件下净化了14个AbpSH3突变体。可以看到一种小污染物~25 kDa，但蛋白质基本上仍然是纯的。这种污染物被认为是YodA，一种常见的共同纯化蛋白，发现于大肠杆菌11。图 2B显示了 11 个不同的 SH3 域在原生条件下的净化。在致变条件下看到的小污染物在原生条件下被去除。这表明 MCPA ?...

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An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

多柱板适配器允许色谱柱与多井收集板接口，用于平行亲和力或离子交换纯化，提供经济的高通量蛋白质纯化方法。它可以通过负担得起的仪器在重力或真空下产生毫克蛋白质。

使用多柱板适配器的经济性和多功能性高通量蛋白质净化系统

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

使用多柱板适配器的经济性和多功能性高通量蛋白质纯化系统。嗨，蛋白质纯化是研究蛋白质结构和功能的必要条件。它通常与生物物理技术相结合使用。这在需要高通量蛋白质生产的功能蛋白质组学时代尤为重要。我们假设多柱板适配器 MCPA 可以将不同脂质的多个色谱柱与多井板对接，进行平行纯化。有了这个适配器，我们开发了一种经济实用的蛋白质纯化方法，可以在重力或真空条件下以自动化系统的速度使用。在这里，我们展示这种方法的镍亲和力色谱和离子交换色谱。将穿刺的密封垫放在长滴盘上，然后将所需的柱数插入密封垫的孔中，从而组装 MCPA。将打开的收集板放在歧管底部，并与歧管顶部关闭。连接管子，并将组装的 MCPA 与柱子放在顶部。将 1.2 万的镍-NTA 溶液放入柱中。在管道输送时，确保珠子保持完全混合。打开泵，将 20% 乙醇通过柱子运行，并进入下面的收集板。液体通过后关闭泵。将收集板的内容放入废品箱中。在所有列中添加三个 EDTA 缓冲器的树脂卷。打开泵并运行液体通过。现在用三个树脂卷0.5摩尔氢氧化钠缓冲器清洗柱子。用四个树脂卷100毫升硫酸镍清洗柱子，然后用10个树脂量的Mili-Q水洗净柱子。如果柱子运行速度较慢，请用注射器柱塞将液体推入。将收集板的内容倒入废品箱中。然后用四个 10 毫升的伊米达佐尔洗缓冲器清洗柱子两次，然后清空收集板。如果正在净化多个样品，则用 48 井板替换开放收集板。关闭真空后，将解体加载到柱中。使用薄塑料搅拌器轻轻混合珠子和柱子中的 lysates，以最大限度地结合。打开泵并运行液体通过。如果柱子被阻塞，请将赖素树脂混合物转移到带新过滤器的柱子上。冻结收集板以包含您的流经。替换为打开的收集板，然后用 9 个树脂卷 10 毫升的 imidazole 洗涤缓冲器清洗柱子。重复此步骤四到五次。为了避免溢出，定期清空废盘。用 96 井板替换打开的收集板，确保 A1 位于左上角。将一个树脂体积的脱硝洗脱缓冲器放入柱中。将液体通过并检查收集板，以确保井之间没有污染。对于下一个稀释，重复以前的步骤，并收集在一个新的收集板。以每个精英的50微升的引用为纯度和浓度分析。接下来，用两毫升20%乙醇清洗柱子。在柱子上再加入两密耳的20%乙醇，使用新鲜的薄塑料搅拌器将乙醇中的珠子混合，然后转移到50万米管中，在4摄氏度下储存。将 MCPA 组装在真空歧管中，并在所有柱子中配有打开的收集板和注射器柱塞。从前排取出所有注射器柱塞。从五毫升注射器柱塞中取出橡胶垫片，然后刺穿中间的一个孔。然后将打开的柱子底部推入被刺穿的橡胶垫片。重复这些步骤并插入列的前排。确保 Q 血糖珠完全混合。蓝色移液器尖端从底部切开两厘米，将 Q sepharose 珠子的 800 微升管道插入开柱中。一旦珠子落到柱子底部，打开真空泵，足以运行20%乙醇通过。用两毫升的10毫升三叶草洗两次柱子。在 Tris 缓冲器运行之前关闭泵以防止树脂干燥。径流可以丢弃，代之以 48 井收集板。将所有样品转移到第一排的 Q Sepharose 柱中，使用薄塑料搅拌器将样品和珠子混合约两分钟，然后打开真空泵。存储或冻结您的流经，以供以后分析。使用打开的收集板，用两密耳的 10 毫升三叶草洗两次柱子。用 96 井板替换开放式收集板。第一个排可以在第一行或第二行中收集。要在第二行中清除，从这些位置取出注射器柱塞。将 Q Sepharose 列移动到这些位置，然后将注射器柱塞放入第一行的开放柱中。将第一批盐浓度的一毫升输送到 Q 塞法罗斯柱中。打开泵并收集洗排。要收集下一个洗脱，从下一个位置取下注射器柱塞，将 Q Sepharose 柱移到这些位置，然后替换先前位置的柱塞。重复这些步骤，用于稀释每个连续的盐浓度。确保每四个插图使用一个新的收集板，并且每个板都经过标记和存储。用打开的收集板，用两毫升的四摩尔氯化钠，10毫升三叶草清洗柱子。派特两密耳的20%乙醇，并运行通过，直到它就在珠子上方，然后密封柱存储。例如，MCPA 已经通过镍 NTA 在变性条件下成功纯化了 14 个 AbpSH3 突变体。在25千达顿时可以看到一种小污染物，尽管这种蛋白质基本上仍然是纯的。在致残条件下看到的小污染物在原生条件下被去除。当 11 个不同的 SH3 域被纯化时，就会显示这一点。这表明 MCPA 可用于比较净化条件。AbpSH3 可以通过从利萨酸盐中分离出大多数污染物。相当纯的AbpSH3蛋白的良好产量通过各种高分子量污染物被回收。使用与 MCPA 的离子交换对镍-NTA 后样品进行净化，成功清除了这些高重量污染物。虽然仍有轻微的污染，但这些分数基本上仍然是纯的，并且使用NMR和热化学变性检测产生了良好的生物物理数据。总之，我们的结果表明，我们的假设是正确的，MCPA可以成功地纯化毫克数量的蛋白质使用不同的色谱技术。MCPA 系统可在同一运行范围内以多种方式配置，以优化净化条件。设置简单、便宜且易于培训缺乏经验的用户，尤其是在不定期纯化蛋白质的实验室中。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

方法确定HCN1和TRIP8b之间蛋白 - 蛋白相互作用的小分子抑制剂

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

科研

生物化学

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

A蛋白制备方法在蛋白质与核余子交互使用LC-MS / MS分析的高通量鉴定

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

高通量, 用定量斑点杂交分析法绝对测定组织层中选定蛋白质的含量 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

利用多功能生化方法鉴定新型 ck2 激酶基材

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA序列识别利用高通量原酶分析的DNAPrimase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

使用光子芯片的高通量总内反射荧光和直接随机光学重建显微镜

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

用于重组G蛋白偶联受体高通量筛选的“双加法”钙荧光测定

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

小细胞外囊泡高通量分离纯化的流式细胞术分选参数优化

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

通过微透析 实现 高通量蛋白质结晶

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...