Name: an economical and versatile high-throughput protein purification system using a multi-column plate adapter
Uploaded: 2021-05-21T13:00:00
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इस प्रकाशन में सूचित शोध को अनुदान संख्या P20GM103451 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (IDeA) द्वारा समर्थित किया गया था और लिवरपूल विश्वविद्यालय से एक आंतरिक अनुसंधान अनुदान ।

1. नी-एनटीए क्रोमेटोग्राफी को डेनटुरिंग
<ol><li>बफर तैयार करना नोट: सभी बफ़र्स के विवरण के लिए तालिका 1 देखें।<ol>
<li>0.5 एम NaOH के 500 एमएल बनाओ, पहले मिल्ली-क्यू पानी जोड़ने के लिए सुनिश्चित कर रही है और फिर ना?...

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Automated+Mid-Scale+Parallel+Protein+Purification+System+for+Antibody+Purification+and+Affinity+Chromatography.">Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography.</a> Protein Expression and Purification. , 128 (2016).</li><li>Renaud, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+in+Drug+Discovery:+Impact,+Challenges+and+Opportunities.+Nature+Reviews.">Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews.</a> Drug Discovery. 15 (10), (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Protein+Purification+and+Quality+Assessment+for+Crystallization.">High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization.</a> Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).</li><li>Pan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Metal+Affinity+NCTR+25+Tag+as+a+Better+Alternative+to+the+His-tag+for+the+Expression+of+Recombinant+Fused+Proteins.">A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins.</a> Protein Expression and Purification. , 164 (2019).</li><li>Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+HaloTag+Technology+to+Expression+and+Purification+of+Cannabinoid+Receptor+CB2.">Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2.</a> Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).</li><li>Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+the+Purification+of+Recombinant+Tagged+Proteins.">Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins.</a> Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).</li><li>Gaberc-Porekar, V., Menart, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography.">Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).</li><li>Anderson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Process+of+Structure-Based+Drug+Design.">The Process of Structure-Based Drug Design.</a> Chemistry &amp; Biology. 10 (9), (2003).</li><li>Cummin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High-Throughput+Purification+Method+for+Hit+Identification+in+Protein+Screening.">A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening.</a> Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).</li><li>Dominguez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Column+Plate+Adapter+Provides+an+Economical+and+Versatile+High-Throughput+Protein+Purification+System.">A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System.</a> Protein Expression and Purification. , 152 (2018).</li><li>Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+and+Classification+of+Native+Proteins+From+E.+Coli+Commonly+Co-Purified+by+Immobilised+Metal+Affinity+Chromatography.">Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).</li><li>Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Chromatography+for+Antibody+Purification.">Affinity Chromatography for Antibody Purification.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).</li><li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Biology+and+Drug+Discovery+for+Protein-Protein+Interactions.">Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).</li><li>Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Structural+Genomics:+the+First+Quindecennial.">The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).</li></ol>

विधि अपेक्षाकृत अनुभवहीन प्रोटीन बायोकेमिस्टों के लिए उपयोग करने के लिए मजबूत और सरल है, हालांकि ध्यान में रखने के लिए कुछ विचार हैं।
ओवरफिलिंग कलेक्शन प्लेट्स के बारे में सावधानी
<...

शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रोटीन शुद्धिकरण तकनीक उनके लक्षण वर्णन और विश्लेषण के लिए जरूरी हैं, विशेष रूप से एनएमआर जैसे जैव भौतिक तरीकों के लिए। प्रोटीन शुद्धिकरण भी अध्ययन के अन्य क्षेत्रों में केंद्रीय है जैसे दवा खोज प्रक्रियाएं और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययन; हालांकि, शुद्ध प्रोटीन की इतनी मात्रा को प्राप्त करना इन तकनीकों के लिए एक अड़चन बन सकता है1,2,3. प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए प्रमुख विधि क्रोमेटोग्राफी है, जिसमें विभिन्न प्रकार के तरीके शामिल हैं जो प्रोटीन की व्यक्तिगत विशेषताओं और उनके टैग पर भरोसा करते हैं। एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी में, प्रोटीन में एक अतिरिक्त प्रोटीन या पेप्टाइड आकृति होती है जो एक टैग के रूप में काम करती है जिसमें क्रोमेटोग्राफी राल4पर एक निश्चित सब्सट्रेट के लिए एक लगाव है। सबसे आम आत्मीयता विधि स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) है जो उसके टैग वाले प्रोटीन का उपयोग करके है, जबकि एक अन्य लोकप्रिय विधि आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी है जो उनके आवेश के आधार पर प्रोटीन को अलग करती है। उच्चतम शुद्धता के लिए, आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी और आयन एक्सचेंज का एक संयोजन अक्सर एक साथ उपयोग किया जाता है, आमतौर पर उच्च-थ्रूपुट के लिए महंगे प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है।
कार्यात्मक प्रोटेओमिक्स का विकसित युग विशिष्ट विश्लेषण के लिए एकवचन प्रोटीन को शुद्ध नहीं करने के लिए उच्च थ्रूपुट तकनीकों की मांग को भड़का रहा है, लेकिन व्यापक विश्लेषण और जीनोम व्यापक अध्ययन के लिए एक साथ बड़ी संख्या में प्रोटीन5। स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) उच्च थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है6,7 अभी तक इसकी स्वचालित प्रणालियां छोटी प्रयोगशालाओं के लिए महंगी और सस्ती हैं8। अधिक किफायती प्लेट आधारित विकल्प जो वर्तमान में उपलब्ध हैं, सुलभ प्रयोगशाला-आधारित उपकरणों के उपयोग को नियोजित करते हैं, जैसे कि वैक्यूम। हालांकि ये विधियां शुद्धिकरण की गति में सुधार करने में सफल हैं, लेकिन यह केवल छोटे पैमाने पर उच्च थ्रूपुट शुद्धि प्राप्त कर सकती है, केवल माइक्रोग्राम रेंज में प्रोटीन पैदा कर सकती है। इन सीमाओं का मतलब है कि पूर्व पैक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेटें (उदाहरण के लिए, जीई हेल्थकेयर से अब Cytiva के स्वामित्व में) जैव भौतिक तकनीकों से पहले इस्तेमाल नहीं किया जा सकताहै 9. गुरुत्वाकर्षण क्रोमेटोग्राफी शुद्धि की सबसे अधिक लागत-कुशल विधि है; हालांकि, कई स्तंभों की स्थापना असुविधाजनक है और कई प्रोटीन के लिए त्रुटि के लिए प्रवण हो सकता है ।
एक बहु स्तंभ प्लेट एडाप्टर (MCPA) विकसित किया गया है और सफलतापूर्वक और आसानी से समानांतर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी कॉलम चलाने के लिए एक बार में अपने टैग खमीर SH3 डोमेन10शुद्ध करने के लिए साबित कर दिया गया है । एमसीपीए एक लागत कुशल उच्च-थ्रूपुट शुद्धिकरण विधि प्रदान करता है जो महंगे इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर नहीं करता है। इसका लचीला डिजाइन गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम के तहत कई आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी कॉलम द्वारा प्रोटीन के मिलीग्राम को प्रभावी ढंग से शुद्ध कर सकता है। इसके अलावा, तेजी से अनुकूलन के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत कॉलम के लिए राल प्रकार, मात्रा और अन्य मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है। यह अध्ययन दर्शाता है कि एमसीपीए द्वारा आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी का उपयोग एबीपी 1 एसएच 3 डोमेन के शुद्धिकरण को बढ़ाने के लिए एमसीपीए द्वारा आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी के साथ किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों का उपयोग करके समानांतर रूप से 24 विभिन्न प्रोटीन को अलग किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL/ well collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201240-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL/ well collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201238-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well long drip plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>200919-100</td>
			<td>Come with 0.25 um filters which are to be removed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate seal/mat</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201158-100</td>
			<td>Should be peirceable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His60 Ni Superflow Resin</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>635660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP anion exchange column</td>
			<td>GE Healthcare (Cytiva)</td>
			<td>17115301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lvis plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with FLUOstar Omega plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male leur plugs</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45503-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>575650-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201244-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Repeater Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2226020</td>
			<td>With 5 mL and 50 mL syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUSAFE vacuum</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>158 320</td>
			<td>The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an economical and versatile high-throughput protein purification system using a multi-column plate adapter

प्रोटीन शुद्धिकरण प्रोटीन संरचना और कार्य के अध्ययन के लिए जरूरी है और आमतौर पर जैव भौतिक तकनीकों के संयोजन में प्रयोग किया जाता है। यह भी नए चिकित्सा विज्ञान के विकास में एक महत्वपूर्ण घटक है । कार्यात्मक प्रोटेओमिक्स का विकसित युग इस सुविधा के लिए उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण और बेहतर तकनीकों की मांग को भड़का रहा है। यह परिकल्पना की गई थी कि एक मल्टी कॉलम प्लेट एडाप्टर (एमसीपीए) समानांतर शुद्धिकरण के लिए बहु-अच्छी प्लेटों के साथ विभिन्न रेजिन के कई क्रोमेटोग्राफी कॉलम को इंटरफेस कर सकता है। यह विधि प्रोटीन शुद्धिकरण की एक किफायती और बहुमुखी विधि प्रदान करती है जिसका उपयोग गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम के तहत किया जा सकता है, जो स्वचालित प्रणाली की गति को प्रतिद्वंद्विता करता है। MCPA बाद के लक्षण वर्णन और विश्लेषण के लिए एक सस्ती और समय कुशल विधि द्वारा प्रोटीन की मिलीग्राम पैदावार को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एमसीपीए का उपयोग SH3 डोमेन के उच्च थ्रूपुट आत्मीयता शुद्धि के लिए किया गया है। आयन एक्सचेंज भी MCPA के माध्यम से प्रोटीन पोस्ट नी-एनटीए आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्ध करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, यह दर्शाता है कि कैसे इस प्रणाली को अंय शुद्धिकरण प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । कई स्तंभों के साथ इसके सेटअप के कारण, मापदंडों का व्यक्तिगत अनुकूलन एक ही शुद्धि में किया जा सकता है, जो वर्तमान प्लेट-आधारित तरीकों से अप्राप्य नहीं है।

एक उदाहरण के रूप में, एमसीपीए ने नी-एनटीए(चित्रा 2A)के माध्यम से 14 AbpSH3 म्यूटेंट को सफलतापूर्वक शुद्ध किया है। एक छोटा सा संदूषक ~ 25 केडीए देखा जा सकता है, हालांकि प्रोटीन अभी भी काफी हद तक शुद्ध है?...

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An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

एक बहु-कॉलम प्लेट एडाप्टर क्रोमेटोग्राफी कॉलम को समानांतर आत्मीयता या आयन विनिमय शुद्धिकरण के लिए बहु-अच्छी संग्रह प्लेटों के साथ इंटरफेस करने की अनुमति देता है जो किफायती उच्च थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण विधि प्रदान करता है। इसका उपयोग गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम उपज मिलीग्राम मात्रा में किफायती इंस्ट्रूमेंटेशन के माध्यम से किया जा सकता है।

मल्टी-कॉलम प्लेट एडाप्टर का उपयोग करके एक किफायती और बहुमुखी उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रणाली

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

एक बहु स्तंभ प्लेट एडाप्टर का उपयोग करके एक किफायती और बहुमुखी उच्च थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रणाली। हाय, प्रोटीन शुद्धि प्रोटीन संरचना और कार्य के अध्ययन के लिए जरूरी है। और यह आमतौर पर जैव भौतिक तकनीकों के संयोजन में प्रयोग किया जाता है।यह कार्यात्मक प्रोटेओमिक्स के युग में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जिसके लिए उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन उत्पादन की आवश्यकता होती है। हमने परिकल्पना की है कि एक बहु-स्तंभ प्लेट एडाप्टर, एमसीपीए, समानांतर शुद्धिकरण के लिए बहु-अच्छी प्लेटों के साथ विभिन्न रेजिन के कई क्रोमेटोग्राफी कॉलम को इंटरफेस कर सकता है। इस एडाप्टर के साथ, हमने प्रोटीन शुद्धिकरण की एक किफायती और बहुमुखी विधि विकसित की है जिसका उपयोग स्वचालित प्रणाली की गति में गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम प्रतिद्वंद्वी के तहत किया जा सकता है।यहां हम निकेल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी और आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी के लिए इस विधि को दिखाते हैं। एक लंबी ड्रिप प्लेट पर एक पंचर सीलिंग चटाई रखकर MCPA इकट्ठा, तो सीलिंग चटाई के छेद में स्तंभों की वांछित संख्या डालें । कई गुना के आधार में एक खुली संग्रह प्लेटें रखें और कई गुना के शीर्ष के साथ बंद करें।टयूबिंग संलग्न करें और शीर्ष पर कॉलम के साथ इकट्ठे MCPA जगह है। कॉलम में निकल-एनटीए समाधान के पिपेट 1.2 लाख। पाइपिंग करते समय, यह सुनिश्चित करें कि मोती पूरी तरह से मिश्रित रहें।पंप पर स्विच करें और कॉलम के माध्यम से और नीचे संग्रह प्लेट में 20% इथेनॉल चलाएं। एक बार तरल के माध्यम से चला रहा है पंप बंद कर दें । संग्रह प्लेट की सामग्री को अपशिष्ट बॉक्स में निपटाएं।सभी स्तंभों में ईडीटीए बफर के तीन राल वॉल्यूम जोड़ें। पंप चालू करें और तरल के माध्यम से चलाएं। अब 0.5 मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड बफर के तीन राल मात्रा के साथ कॉलम धोएं।100 मिलीमोलर निकल सल्फेट के चार राल मात्रा के साथ कॉलम धोएं, फिर मिली-क्यू पानी के 10 राल की मात्रा। यदि कोई कॉलम धीमा चल रहा है, तो सिरिंज प्लंजर के साथ तरल को धक्का दें। एक बेकार बॉक्स में संग्रह प्लेटों की सामग्री डालो।फिर कॉलम को दो बार 10 मिलीमोलर इमिडाजोल वॉश बफर के चार राल वॉल्यूम के साथ धोएं और कलेक्शन प्लेट्स खाली करें । यदि कई नमूनों को शुद्ध किया जा रहा है, एक ४८ अच्छी तरह से प्लेटों के साथ खुले संग्रह प्लेटों की जगह । वैक्यूम बंद होने के साथ, lysates को कॉलम में लोड करें।बाध्यकारी को अधिकतम करने के लिए कॉलम में मोतियों और lysates को धीरे-धीरे मिलाने के लिए एक पतली प्लास्टिक स्टरर का उपयोग करें। पंप चालू करें और तरल के माध्यम से चलाएं। यदि कोई कॉलम अवरुद्ध हो जाता है, तो lysate राल मिश्रण को एक ताजा फ़िल्टर के साथ एक कॉलम में स्थानांतरित करें।अपने प्रवाह के माध्यम से शामिल करने के लिए संग्रह प्लेटों फ्रीज। एक खुली संग्रह प्लेट के साथ प्रतिस्थापित करें और फिर कॉलम को 10 मिलीमोलर इमिडाजोल वॉश बफर के नौ राल वॉल्यूम के साथ धोएं। इस स्टेप को चार-पांच बार दोहराएं।ओवरफ्लो से बचने के लिए समय-समय पर बेकार प्लेटों को खाली करें। एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट के साथ खुले संग्रह प्लेटों की जगह, A1 सुनिश्चित करने के शीर्ष बाएं कोने में है । कॉलम में हतोत्साहित एल्यूशन बफर की एक राल मात्रा।तरल के माध्यम से चलाने के लिए और संग्रह प्लेट की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां कुओं के बीच कोई संदूषण है । अगले कमजोर पड़ने के लिए, पिछले चरणों को दोहराएं और एक ताजा संग्रह प्लेट में इकट्ठा करें। शुद्धता और एकाग्रता विश्लेषण के लिए प्रत्येक एल्यूशन का 50 माइक्रोलीटर एलिकोट लें।इसके बाद, 20% इथेनॉल के दो मिलीलीटर के साथ कॉलम धोएं। कॉलम में 20% इथेनॉल के एक और दो लाख जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए एक 50 लाख ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले इथेनॉल में मोतियों को मिलाने के लिए ताजा पतली प्लास्टिक उभारक का उपयोग करें। सभी स्तंभों में एक खुली संग्रह प्लेट और सिरिंज प्लंजर के साथ वैक्यूम में एमसीपीए को कई गुना इकट्ठा करें।आगे की पंक्ति से सिरिंज प्लंजर के सभी निकालें। एक पांच लाख सिरिंज प्लंजर से रबर गैसकेट निकालें और फिर केंद्र में एक छेद छेद । फिर पंचर रबर गैसकेट के माध्यम से एक खुले कॉलम के नीचे धक्का।इन चरणों को दोहराएं और कॉलम की आगे की पंक्ति में डालें। सुनिश्चित करें कि क्यू सेफरोज मोती पूरी तरह से मिश्रित हैं। और नीले पिपेट टिप के साथ जो नीचे से दो सेंटीमीटर काटता है, क्यू सेफ्रॉस मोतियों के 800 माइक्रोलीटर खुले स्तंभों में पिपेट करते हैं।एक बार मोती कॉलम के नीचे करने के लिए बस गए हैं, वैक्यूम पंप पर स्विच करने के लिए पर्याप्त 20% इथेनॉल के माध्यम से चलाने के लिए । 10 मिलीमोलर ट्रिस के दो लाख के साथ दो बार कॉलम धोएं। ट्रों बफर के माध्यम से चलाने के लिए राल बाहर सुखाने को रोकने के लिए पंप बंद कर दें ।अपवाह को त्याग दिया जा सकता है और 48-अच्छी संग्रह प्लेटों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। पहली पंक्ति में क्यू Sepharose कॉलम को शुद्ध करने के लिए सभी नमूनों को स्थानांतरित करें और वैक्यूम पंप चालू करने से पहले लगभग दो मिनट के लिए नमूनों और मोतियों को मिलाने के लिए एक पतली प्लास्टिक उभारक का उपयोग करें। बाद के विश्लेषण के लिए अपने प्रवाह को स्टोर या फ्रीज करें।एक खुली संग्रह प्लेट के साथ, 10 मिलीमोलर ट्रिस के दो लाख के साथ दो बार कॉलम धोएं। 96-वेल प्लेट के साथ खुली संग्रह प्लेटों को बदलें। पहली पंक्ति में या दूसरी पंक्ति में पहला एल्यूशन अंश एकत्र किया जा सकता है।दूसरी पंक्ति में elute करने के लिए, इन पदों से सिरिंज प्लंजर निकालें । क्यू सेफरोज कॉलम को इन पदों में ले जाएं और फिर पहली पंक्ति में खुले स्तंभों में सिरिंज गिर जाएं। क्यू सेफरोज कॉलम में पहले नमक सांद्रता का एक मिलीलीटर पिपेट करें।पंप चालू करें और एल्यूशन इकट्ठा करें। अगले एल्यूशन को इकट्ठा करने के लिए, अगले पदों से सिरिंज प्लंपर्स को हटा दें, क्यू सेफ्रॉस कॉलम को इन पदों में ले जाएं और फिर पिछले पदों में प्लंपर्स को बदलें। इन चरणों को प्रत्येक क्रमिक नमक एकाग्रता के लिए दोहराएं जो एल्यूट करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।सुनिश्चित करें कि हर चार एल्यूशन के लिए एक नई संग्रह प्लेट का उपयोग किया जाता है और हर प्लेट को लेबल और संग्रहीत किया जाता है। एक खुली संग्रह प्लेटों के साथ, चार मोलर सोडियम क्लोराइड, 10 मिलीमोलर ट्रिस के दो लाख के साथ कॉलम धोएं। 20% इथेनॉल के दो लाख पिपेट और इसे तब तक चलाएं जब तक कि यह मोतियों के ठीक ऊपर न हो और फिर भंडारण के लिए स्तंभों को सील न करें।एक उदाहरण के रूप में, एमसीपीए ने एक निकल-एनटीए द्वारा 14 AbpSH3 म्यूटेंट को सफलतापूर्वक शुद्ध किया है। एक छोटा सा संदूषक 25 किलोडटन में देखा जा सकता है, हालांकि प्रोटीन अभी भी काफी हद तक शुद्ध है । विकृत स्थितियों में देखे गए छोटे संदूषकों को देशी परिस्थितियों में हटा दिया जाता है।यह तब दिखाया गया था जब 11 अलग-अलग एसएच 3 डोमेन शुद्ध किए गए थे। इससे पता चलता है कि एमसीपीए का इस्तेमाल शुद्धिकरण की स्थिति की तुलना के लिए किया जा सकता है। AbpSH3 को lysates से आयन विनिमय शुद्धि के माध्यम से अधिकांश संदूषकों से अलग किया जा सकता है।विभिन्न उच्च आणविक वजन संदूषकों के साथ काफी शुद्ध AbpSH3 प्रोटीन की अच्छी पैदावार बरामद की गई । नमूनों के बाद निकल-एनटीए के शुद्धिकरण MCPA के साथ आयन विनिमय का उपयोग सफलतापूर्वक इन उच्च वजन संदूषकों को हटा दिया है । हालांकि अभी भी थोड़ा संदूषण है, अंश अभी भी काफी हद तक शुद्ध हैं और एनएमआर और थर्मल केमिकल डेनैचुरेशन परख का उपयोग करके अच्छे बायोफिजिकल डेटा मिले हैं।अंत में, हमारे परिणाम बताते हैं कि हमारी परिकल्पना सही है और एमसीपीए विभिन्न क्रोमेटोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा को सफलतापूर्वक शुद्ध कर सकता है। शुद्धिकरण की स्थिति को अनुकूलित करने के लिए एक ही रन के भीतर एमसीपीए प्रणाली को कई तरीकों से कॉन्फ़िगर किया जा सकता है। सेटअप सरल, सस्ता और अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं को प्रशिक्षित करने में आसान है, विशेष रूप से प्रयोगशालाओं में जो नियमित रूप से प्रोटीन को शुद्ध नहीं करते हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

एक प्रोटीन प्रोटीन की उच्च throughput पहचान नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण का प्रयोग एक परमाणु cofactor साथ बातचीत के लिए तैयारी विधि

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

उच्च प्रवाह, मात्रात्मक डॉट दाग विश्लेषण का उपयोग ऊतक के स्तर पर एक चयनित प्रोटीन की सामग्री का निरपेक्ष निर्धारण (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellular प्रोटीन Microarray कम संबध रिसेप्टर का उच्च प्रवाह का पता लगाने के लिए प्रौद्योगिकी-Ligand बातचीत

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

उपंयास की पहचान CK2 kinase एक बहुमुखी जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग substrates

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

डीएनए द्वारा डीएनए अनुक्रम मान्यता उच्च-Throughput प्राइमाज़ प्रोफ़ेशनल का उपयोग कर

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

उच्च थ्रूपुट कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस और डायरेक्ट स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी एक फोटोनिक चिप का उपयोग कर

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

पुनः संयोजक जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक "दोहरी-अतिरिक्त" कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

उच्च-थ्रूपुट अलगाव और छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग मापदंडों का अनुकूलन

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

माइक्रोडायलिसिस के माध्यम से उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन क्रिस्टलीकरण

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...