Name: an economical and versatile high-throughput protein purification system using a multi-column plate adapter
Uploaded: 2021-05-21T13:00:00
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이 간행물에서 보고된 연구는 보조금 번호 P20GM103451및 리버풀 대학에서 내부 연구 교부금의 국립 의학 과학의 국립 학회에서 기관 개발 상 (IDeA)에 의해 지원되었습니다.

1. Ni-NTA 크로마토그래피 를 부인
<ol><li>버퍼 준비 참고: 모든 버퍼에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.<ol>
<li>0.5 M NaOH의 500mL를 구성하여 먼저 밀리-Q 물을 추가한 다음 비커가 교반기위에 있는 동안 NaOH를 천천히 추가하십시오. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터링합니다.</li>
		<li>0.22 μm 필터를 사용하여 0.1 M 니켈 황산염 및 필터의 100mL를 준비합니다.</li>
		<li>0.22 μm 필터를 사용?...

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Automated+Mid-Scale+Parallel+Protein+Purification+System+for+Antibody+Purification+and+Affinity+Chromatography.">Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography.</a> Protein Expression and Purification. , 128 (2016).</li><li>Renaud, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+in+Drug+Discovery:+Impact,+Challenges+and+Opportunities.+Nature+Reviews.">Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews.</a> Drug Discovery. 15 (10), (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Protein+Purification+and+Quality+Assessment+for+Crystallization.">High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization.</a> Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).</li><li>Pan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Metal+Affinity+NCTR+25+Tag+as+a+Better+Alternative+to+the+His-tag+for+the+Expression+of+Recombinant+Fused+Proteins.">A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins.</a> Protein Expression and Purification. , 164 (2019).</li><li>Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+HaloTag+Technology+to+Expression+and+Purification+of+Cannabinoid+Receptor+CB2.">Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2.</a> Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).</li><li>Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+the+Purification+of+Recombinant+Tagged+Proteins.">Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins.</a> Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).</li><li>Gaberc-Porekar, V., Menart, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography.">Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).</li><li>Anderson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Process+of+Structure-Based+Drug+Design.">The Process of Structure-Based Drug Design.</a> Chemistry &amp; Biology. 10 (9), (2003).</li><li>Cummin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High-Throughput+Purification+Method+for+Hit+Identification+in+Protein+Screening.">A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening.</a> Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).</li><li>Dominguez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Column+Plate+Adapter+Provides+an+Economical+and+Versatile+High-Throughput+Protein+Purification+System.">A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System.</a> Protein Expression and Purification. , 152 (2018).</li><li>Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+and+Classification+of+Native+Proteins+From+E.+Coli+Commonly+Co-Purified+by+Immobilised+Metal+Affinity+Chromatography.">Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).</li><li>Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Chromatography+for+Antibody+Purification.">Affinity Chromatography for Antibody Purification.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).</li><li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Biology+and+Drug+Discovery+for+Protein-Protein+Interactions.">Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).</li><li>Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Structural+Genomics:+the+First+Quindecennial.">The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).</li></ol>

이 방법은 상대적으로 경험이 부족한 단백질 생화학자에게 사용하기쉽고 견고하지만 몇 가지 고려 사항이 있습니다.
컬렉션 플레이트 과충전에 대한 주의 사항
48웰 컬렉션 플레이트 자체는 우물당 5mL에 불과하며 각 96웰은 2mL에 불과합니다. 우물을 과도하게 채울 위험이 있기 때문에 버퍼를 추가하고 열을 통해 샘플을 실행할 때 이 점을 염?...

정제된 단백질의 밀리그램 양을 달성하는 단백질 정제 기술은 특히 NMR과 같은 생물 물리학 적 방법에 대한 특성화 및 분석에 필수적입니다. 단백질 정제는 또한 약물 발견 과정 및 단백질 단백질 상호 작용 연구와 같은 연구의 다른 영역에 걸쳐 중심; 그러나, 이러한 양의 순수 단백질을 달성하는 것은 이러한 기술에 대한 병목 현상이 될 수 있다1,2,3. 단백질 정화를 위한 주요 방법은 단백질과 그들의 꼬리표의 개별적인 특성에 의존하는 다양한 방법을 포함하는 크로마토그래피입니다. 친화도 크로마토그래피에서, 단백질은 크로마토그래피 수지4에특정 기판에 대한 친화력을 갖는 태그로 작동하는 추가 단백질 또는 펩티드 모티프를 가지고 있다. 가장 일반적인 친화성 방법은 그의 태그 단백질을 사용하여 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)이며, 또 다른 인기있는 방법은 충전에 따라 단백질을 분리하는 이온 교환 크로마토그래피입니다. 최고 순도를 위해 친화도 크로마토그래피와 이온 교환의 조합이 자주 함께 사용되며 일반적으로 고처리량에 대한 고가의 실험실 장비가 필요합니다.
기능성 프로테오믹스의 진화하는 시대는 특정 분석을 위한 단수 단백질이 아니라 포괄적인 분석 및 게놈 와이드연구를위해 동시에 많은 수의 단백질을 정화하기 위한 고처리량 기술에 대한 수요를 촉진하고 있다 5. 고정금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)는 고처리량 단백질 정제6,7, 소규모 실험실8에 대해 비용이 많이 들고 저렴하지않은 고처리량 단백질 정제를 위한 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 현재 사용할 수있는 더 저렴한 판 기반 대안은 진공과 같은 접근 가능한 실험실 기반 장비의 사용을 사용합니다. 이러한 방법은 정화 속도를 개선하는 데 성공하지만, 마이크로그램 범위에서 단백질만 산출하는 작은 규모로고 처리량 정제를 달성할 수 있습니다. 이러한 제한은 미리 포장된 96개의 웰 필터 플레이트(예를 들어, 현재 Cytiva가 소유하고 있는 GE 헬스케어로부터)가 생물물리학 기술9이전에는 사용할 수 없음을 의미한다. 중력 크로마토그래피는 가장 비용 효율적인 정화 방법입니다. 그러나 여러 컬럼을 설정하는 것은 불편하며 여러 단백질에 오류가 발생하기 쉽습니다.
다중 컬럼 플레이트 어댑터(MCPA)가 성공적으로 편리하게 병렬 친화성 크로마토그래피 컬럼을 한 번에 실행하여 태그가 지정된 효모 SH3도메인(10)을정화하는 것으로 입증되었다. MCPA는 비용이 많이 드는 계측에 의존하지 않는 비용 효율적인 고처리량 정제 방법을 제공합니다. 유연한 설계는 중력 또는 진공 매니폴드 아래 여러 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통해 밀리그램의 단백질을 효과적으로 정화할 수 있습니다. 또한 수지 유형, 볼륨 및 기타 매개 변수는 각 개별 컬럼에 대해 조정하여 더 빠른 최적화를 할 수 있습니다. 이 연구는 MCPA에 의한 이온 교환 크로마토그래피를 MCPA에 의한 친화성 크로마토그래피와 함께 Abp1 SH3 도메인의 정제를 향상시키는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 추가적으로, 최대 24개의 다른 단백질은 이 방법을 사용하여 병렬로 분리될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL/ well collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201240-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL/ well collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201238-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well long drip plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>200919-100</td>
			<td>Come with 0.25 um filters which are to be removed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate seal/mat</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201158-100</td>
			<td>Should be peirceable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His60 Ni Superflow Resin</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>635660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP anion exchange column</td>
			<td>GE Healthcare (Cytiva)</td>
			<td>17115301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lvis plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with FLUOstar Omega plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male leur plugs</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45503-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>575650-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201244-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Repeater Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2226020</td>
			<td>With 5 mL and 50 mL syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUSAFE vacuum</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>158 320</td>
			<td>The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an economical and versatile high-throughput protein purification system using a multi-column plate adapter

단백질 정제는 단백질 구조 및 기능에 대한 연구에 필수적이며 일반적으로 생물 물리학 기술과 함께 사용됩니다. 그것은 또한 새로운 치료의 개발에 핵심 구성 요소. 기능성 프로테오믹스의 진화하는 시대는 이를 용이하게 하기 위해 고처리량 단백질 정제 및 개선된 기술에 대한 수요를 촉진하고 있다. 다중 컬럼 플레이트 어댑터(MCPA)가 병렬 정제를 위해 다중 웰 플레이트와 다른 수지의 여러 크로마토그래피 컬럼을 인터페이스할 수 있다고 가설이 있었습니다. 이 방법은 자동화 된 시스템의 속도에 필적하는 중력 이나 진공 하에서 사용할 수있는 경제적이고 다양한 단백질 정제 방법을 제공합니다. MCPA는 후속 특성화 및 분석을 위한 저렴하고 시간 효율적인 방법으로 단백질의 밀리그램 수율을 회수하는 데 사용할 수 있습니다. MCPA는 SH3 도메인의 높은 처리량 선호도 정화에 사용되었습니다. 이온 교환은 또한 단백질 포스트 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 정화하기 위해 MCPA를 통해 입증되었으며, 이는 이 시스템이 다른 정제 유형에 어떻게 적응될 수 있는지를 나타냅니다. 여러 열로 설정하기 때문에 파라미터의 개별 사용자 지정은 현재 플레이트 기반 방법에 의해 달성 할 수없는 동일한 정제로 이루어질 수 있습니다.

예를 들어, MCPA는 Ni-NTA(그림2A)를통해 데칭 조건에서 14개의 AbpSH3 돌연변이를 성공적으로 정제하였다. 작은 오염 물질 ~ 25 kDa를 볼 수 있지만 단백질은 여전히 대체로 순수합니다. 이 오염 물질은 대장균11에서발견되는 일반적인 공동 정제 단백질인 YodA로여겨진다. 도 2B는 네이티브 조건하에서 11개의 서로 다른 SH3 도메인?...

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An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하면 크롬노그래피 컬럼을 병렬 친화성 또는 이온 교환 정제를 위한 다중 웰 컬렉션 플레이트와 인터페이스하여 경제적인 높은 처리량 단백질 정제 방법을 제공합니다. 그것은 중력 또는 진공 산출 밀리 그램 양의 단백질을 통해 저렴 한 계측을 통해 사용할 수 있습니다.

다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하는 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정화 시스템

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

멀티 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하여 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정제 시스템. 안녕하세요, 단백질 정제는 단백질 구조와 기능에 대한 연구에 필수적입니다. 그리고 그것은 일반적으로 생물 물리학 기술과 함께 사용.이것은 높은 처리량 단백질 생산을 요구하는 기능성 proteomics의 시대에 특히 중요합니다. 우리는 다중 컬럼 플레이트 어댑터인 MCPA가 병렬 정화를 위해 다중 웰 플레이트와 다른 수지의 여러 크로마토그래피 컬럼을 인터페이스할 수 있다고 가설했습니다. 이 어댑터를 통해, 우리는 자동화 된 시스템의 속도로 중력 또는 진공 경쟁하에서 사용할 수있는 경제적이고 다양한 단백질 정제 방법을 개발했습니다.여기서 우리는 니켈 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 위한 이 방법을 보여줍니다. 긴 드립 플레이트에 천공 밀봉 매트를 배치하여 MCPA를 조립한 다음 원하는 수의 열을 밀봉 매트구멍에 삽입합니다. 매니폴드 의 바닥에 열린 컬렉션 플레이트를 놓고 매니폴드의 상단으로 닫습니다.튜빙을 부착하고 조립된 MCPA를 상단에 열로 놓습니다. 니켈-NTA 용액의 파이프 1.2 밀을 열로 넣습니다. 파이펫팅 하는 동안 구슬이 완전히 혼합 된 상태로 유지되도록하십시오.펌프를 켜고 컬럼을 통해 아래 컬렉션 플레이트에 20% 에탄올을 실행합니다. 액체가 통과되면 펌프를 끕니다. 수거판의 내용을 폐기상자에 넣습니다.모든 열에 EDTA 버퍼의 세 수지 볼륨을 추가합니다. 펌프를 켜고 액체를 통해 실행합니다. 이제 0.5 어금다 나트륨 수산화 나트륨 버퍼의 세 수지 볼륨으로 컬럼을 세척합니다.100 밀리머 니켈 황산염의 4 개의 수지 부피, 밀리-Q 물의 10 수지 부피로 열을 씻어. 컬럼이 느리게 실행되는 경우 주사기 플런저로 액체를 밀어 넣습니다. 수거판의 내용물을 쓰레기 상자에 붓습니다.그런 다음 10 밀리머 이미다졸 세척 버퍼의 네 수지 볼륨으로 열을 두 번 세척하고 수집 판을 비웁다. 여러 샘플이 정제되는 경우 열린 컬렉션 플레이트를 48웰 플레이트로 교체합니다. 진공을 끄면 용하를 열에 로드합니다.얇은 플라스틱 교반기를 사용하여 구슬과 기둥의 용재를 부드럽게 혼합하여 바인딩을 최대화합니다. 펌프를 켜고 액체를 통해 실행합니다. 컬럼이 막히면 리자테 수지 혼합물을 새 필터가 있는 열로 옮기습니다.유동을 포함하도록 컬렉션 플레이트를 동결합니다. 오픈 컬렉션 플레이트로 교체한 다음 10밀리머 이미다졸 워시 버퍼의 9개의 수지 부피로 컬럼을 세척합니다. 이 단계를 4~5회 반복합니다.오버플로를 방지하려면 정기적으로 폐기물 플레이트를 비웁웁타입니다. 오픈 컬렉션 플레이트를 96웰 플레이트로 교체하여 A1이 왼쪽 상단 모서리에 있는지 확인합니다. 열에 용출 버퍼를 데스팅하는 한 수지 볼륨을 파이프화합니다.액체를 통해 실행하고 우물 사이에 오염이 없는지 확인하기 위해 수집 판을 확인하십시오. 다음 희석을 위해 이전 단계를 반복하고 신선한 컬렉션 플레이트로 수집합니다. 순도 및 농도 분석을 위해 각 용출의 50 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 복용하십시오.다음으로, 20%에탄올의 2밀리리터로 컬럼을 씻는다. 기둥에 20%에탄올의 또 다른 두 개의 밀을 추가하고 신선한 얇은 플라스틱 교반기를 사용하여 에탄올의 구슬을 혼합한 후 섭씨 4도에서 보관할 수 있는 50mil 튜브로 옮길 수 있습니다. 모든 컬럼에 열린 컬렉션 플레이트와 주사기 플런지로 MCPA를 진공 매니폴드에 조립합니다.앞줄에서 주사기 플런서를 모두 제거합니다. 5 마일 주사기 플런저에서 고무 개스킷을 제거한 다음 중앙에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 구멍이 뚫린 고무 개스킷을 통해 열린 열의 바닥을 밀어 넣습니다.이러한 단계를 반복하고 열의 앞줄에 삽입합니다. Q 세파로즈 구슬이 완전히 혼합되어 있는지 확인합니다. 그리고 바닥에서 2센티미터 절단된 파란색 파이펫 팁으로 Q 세파로즈 구슬의 파이프 800 마이크로리터가 열린 기둥으로 들어갑니다.구슬이 기둥 의 바닥에 정착되면, 진공 펌프를 통해 20 %의 에탄올을 실행할 만큼 충분히 켭돌. 10 밀리머 트리의 두 밀로 열을 두 번 세척합니다. Tris 버퍼가 실행되기 직전에 펌프를 끄면 수지 건조를 방지합니다.유출을 폐기하고 48웰 컬렉션 플레이트로 교체할 수 있습니다. 모든 샘플을 첫 번째 행의 Q Sepharose 컬럼으로 정결시키고 얇은 플라스틱 교반기를 사용하여 진공 펌프를 켜기 전에 약 2 분 동안 샘플과 구슬을 혼합합니다. 나중에 분석을 위해 흐름 스루를 저장하거나 동결합니다.오픈 컬렉션 플레이트를 통해 10밀리머 트리의 두 밀로 컬럼을 두 번 씻으세요. 오픈 컬렉션 플레이트를 96웰 플레이트로 교체합니다. 첫 번째 용출 분획은 첫 번째 행 또는 두 번째 행에서 수집할 수 있습니다.두 번째 행에서 elute하려면 이러한 위치에서 주사기 플런서를 제거합니다. Q 세파로즈 열을 이러한 위치로 이동한 다음 주사기 플런저를 첫 번째 행의 열린 열에 배치합니다. 첫 번째 염 농도의 1 밀리리터를 Q 세파로즈 기둥에 넣습니다.펌프를 켜고 용출을 수집합니다. 다음 용출을 수집하려면 다음 위치에서 주사기 플런서를 제거하고 Q Sepharose 열을 이러한 위치로 이동한 다음 이전 위치에서 플런처를 교체합니다. 엘루트에 사용되는 각 연속염 농도에 대해 이 단계를 반복하십시오.4개의 elutions마다 새 컬렉션 플레이트가 사용되고 모든 플레이트에 레이블을 지정하고 저장되도록 합니다. 오픈 컬렉션 플레이트를 사용하여 4개의 어금니 나트륨 염화나트륨 2마일, 10밀리머 트리스로 컬럼을 세척합니다. 20%에탄올의 두 밀을 파이프로 고정하고 구슬 바로 위에 있을 때까지 이를 실행한 다음 열을 밀봉하여 보관합니다.예를 들어, MCPA는 니켈-NTA에 의한 데칭 조건에서 14개의 AbpSH3 돌연변이를 성공적으로 정제했습니다. 단백질은 여전히 크게 순수하지만 작은 오염 물질은 25 킬로달톤에서 볼 수 있습니다. 데니튜징 조건에서 볼 수 있는 작은 오염 물질은 네이티브 조건에서 제거됩니다.이는 11개의 다른 SH3 도메인이 정제되었을 때 나타났습니다. 이는 MCPA가 정화 조건의 비교에 사용될 수 있음을 보여준다. AbpSH3는 용액으로부터 정화를 통해 대부분의 오염 물질로부터 분리될 수 있다.상당히 순수한 AbpSH3 단백질의 좋은 수확량은 다양한 더 높은 분자량 오염 물질로 회복되었다. MCPA와의 이온 교환을 사용하여 니켈-NTA 이후의 시료의 정제는 이러한 고중량 오염 물질을 성공적으로 제거했습니다. 여전히 약간의 오염이 있지만, 분수는 여전히 크게 순수하고 NMR 및 열 화학 적 분해 분석을 사용하여 좋은 생물 물리학 데이터를 산출했다.결론적으로, 우리의 결과는 우리의 가설이 정확하고 MCPA가 다른 크로마토그래피 기술을 사용하여 단백질의 밀리그램 양을 성공적으로 정화할 수 있다는 것을 보여줍니다. MCPA 시스템은 정화 조건을 최적화하기 위해 동일한 실행 내에서 여러 가지 방법으로 구성할 수 있습니다. 이 설정은 간단하고 저렴하며 경험이 부족한 사용자를 훈련하기 쉽고, 특히 단백질을 일상적으로 정화하지 않는 실험실에서 쉽게 훈련할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...