Name: an economical and versatile high-throughput protein purification system using a multi-column plate adapter
Uploaded: 2021-05-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter at JoVE.com

Bu yayında bildirilen araştırmalar, P20GM103451 hibe numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ve Liverpool Üniversitesi'nden bir iç araştırma hibesi ile desteklendi.

1. Denatüre Ni-NTA kromatografisi
<ol><li>Arabellekler hazırlanıyor NOT: Tüm arabelleklerin ayrıntıları için Tablo 1'e bakın.<ol>
<li>500 mL 0,5 M NaOH'u yapın, önce Milli-Q suyunu eklediğinizden emin olun ve ardından beher bir karıştırıcı üzerindeyken NaOH'u yavaşça ekleyin. 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.</li>
		<li>0,22 μm filtre kullanarak 100 mL 0,1 M nikel sülfat ve filtre hazırlayın.</li>
		<li>50 mL 2 M imidazol hazırlayın ve 0,22 μm filtre kullanarak filt...

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Automated+Mid-Scale+Parallel+Protein+Purification+System+for+Antibody+Purification+and+Affinity+Chromatography.">Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography.</a> Protein Expression and Purification. , 128 (2016).</li><li>Renaud, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+in+Drug+Discovery:+Impact,+Challenges+and+Opportunities.+Nature+Reviews.">Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews.</a> Drug Discovery. 15 (10), (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Protein+Purification+and+Quality+Assessment+for+Crystallization.">High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization.</a> Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).</li><li>Pan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Metal+Affinity+NCTR+25+Tag+as+a+Better+Alternative+to+the+His-tag+for+the+Expression+of+Recombinant+Fused+Proteins.">A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins.</a> Protein Expression and Purification. , 164 (2019).</li><li>Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+HaloTag+Technology+to+Expression+and+Purification+of+Cannabinoid+Receptor+CB2.">Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2.</a> Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).</li><li>Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+the+Purification+of+Recombinant+Tagged+Proteins.">Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins.</a> Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).</li><li>Gaberc-Porekar, V., Menart, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography.">Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).</li><li>Anderson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Process+of+Structure-Based+Drug+Design.">The Process of Structure-Based Drug Design.</a> Chemistry &amp; Biology. 10 (9), (2003).</li><li>Cummin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High-Throughput+Purification+Method+for+Hit+Identification+in+Protein+Screening.">A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening.</a> Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).</li><li>Dominguez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Column+Plate+Adapter+Provides+an+Economical+and+Versatile+High-Throughput+Protein+Purification+System.">A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System.</a> Protein Expression and Purification. , 152 (2018).</li><li>Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+and+Classification+of+Native+Proteins+From+E.+Coli+Commonly+Co-Purified+by+Immobilised+Metal+Affinity+Chromatography.">Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).</li><li>Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Chromatography+for+Antibody+Purification.">Affinity Chromatography for Antibody Purification.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).</li><li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Biology+and+Drug+Discovery+for+Protein-Protein+Interactions.">Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).</li><li>Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Structural+Genomics:+the+First+Quindecennial.">The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).</li></ol>

Yöntem, nispeten deneyimsiz protein biyokimyacıları için sağlam ve kullanımı kolaydır, ancak akılda tutulması gereken birkaç husus vardır.
Toplama plakalarını aşırı doldurma konusunda dikkatli olun
48 kuyulu toplama plakasının kendisi kuyu başına sadece 5 mL tutarken, her 96 kuyu sadece 2 mL tutar. Kuyuları aşırı doldurma riski olduğundan, sütun boyunca tampon eklerken ve örnek çalıştırırken bu akılda tutulmalıdır...

Miligram miktarlarda saflaştırılmış protein elde etmek için protein saflaştırma teknikleri, özellikle NMR gibi biyofiziksel yöntemler için karakterizasyon ve analizleri için zorunludur. Protein saflaştırma, ilaç keşif süreçleri ve protein-protein etkileşim çalışmaları gibi diğer çalışma alanlarında da merkezidir; bununla birlikte, bu miktarda saf protein elde etmek, bu teknikler için bir darboğazhalinegelebilir 1,2,3. Protein saflaştırmanın temel yöntemi, proteinlerin ve etiketlerinin bireysel özelliklerine dayanan çeşitli yöntemler içeren kromatografidir. Benzeşim kromatografisinde, proteinler kromatografi reçinesi üzerinde belirli bir substrata benzeyen bir etiket olarak çalışan ek bir protein veya peptit motifine sahiptir4. En yaygın benzeşim yöntemi, His etiketli proteinleri kullanan hareketsiz metal benzeşim kromatografisidir (IMAC), bir diğer popüler yöntem ise proteinleri yüklerine göre ayıran iyon değişimi kromatografisidir. En yüksek saflık için, benzeşim kromatografisi ve iyon değişiminin bir kombinasyonu sıklıkla birlikte kullanılır ve genellikle yüksek verim için pahalı laboratuvar ekipmanı gerektirir.
Fonksiyonel proteomiklerin gelişen çağı, belirli analizler için tekil proteinleri değil, kapsamlı analiz ve genom geniş çalışmaları için aynı anda çok sayıda proteini arındırmak için yüksek verimli tekniklere olan talebi körüklüyor5. Hareketsiz metal benzeşimi kromatografisi (IMAC), yüksek verimli protein saflaştırma6,7 için en yaygın kullanılan yöntemlerdenbiridir,ancak otomatik sistemleri daha küçük laboratuvarlar için maliyetli ve uygun değildir8. Şu anda mevcut olan daha uygun fiyatlı plaka tabanlı alternatifler, vakum gibi erişilebilir laboratuvar tabanlı ekipmanların kullanımını kullanır. Bu yöntemler saflaştırma hızını artırmada başarılı olsa da, sadece daha küçük ölçekte yüksek verimli saflaştırma elde edebilir, sadece mikrogram aralığında protein verebilir. Bu sınırlamalar, önceden paketlenmiş 96 kuyu filtre plakasının (örneğin, şu anda Cytiva'ya ait olan GE Healthcare'den) biyofizik tekniklerden önce kullanılamayacağı anlamına gelir9. Yerçekimi kromatografisi en uygun maliyetli saflaştırma yöntemidir; ancak, birden fazla sütun kurmak sakıncalı ve birden fazla protein için hataya eğilimli olabilir.
Çok sütunlu bir plaka adaptörü (MCPA) geliştirilmiştir ve etiketli maya SH3 etki alanlarını arındırmak için paralel benzeşim kromatografi sütunlarını aynı anda başarılı ve rahat bir şekilde çalıştırdığı kanıtlanmıştır10. MCPA, maliyetli enstrümantasyona bağlı olmayan uygun maliyetli yüksek verimli saflaştırma yöntemi sunar. Esnek tasarımı, miligram proteini yerçekimi veya vakum manifoldu altında birden fazla benzeşim kromatografi kolonu ile etkili bir şekilde saflaştırabilir. Ayrıca, daha hızlı iyileştirme için her bir sütun için reçine türü, hacmi ve diğer parametreler ayarlanabilir. Bu çalışma, MCPA tarafından iyon değişim kromatografisinin, ABP1 SH3 alanının saflaştırılmasını geliştirmek için MCPA tarafından benzeşim kromatografisi ile birlikte kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, bu yöntemler kullanılarak paralel olarak 24 farklı protein ayrılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL/ well collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201240-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL/ well collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201238-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well long drip plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>200919-100</td>
			<td>Come with 0.25 um filters which are to be removed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate seal/mat</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201158-100</td>
			<td>Should be peirceable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His60 Ni Superflow Resin</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>635660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP anion exchange column</td>
			<td>GE Healthcare (Cytiva)</td>
			<td>17115301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lvis plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with FLUOstar Omega plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male leur plugs</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45503-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>575650-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir collection plate</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>201244-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Repeater Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2226020</td>
			<td>With 5 mL and 50 mL syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUSAFE vacuum</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>158 320</td>
			<td>The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an economical and versatile high-throughput protein purification system using a multi-column plate adapter

Protein saflaştırma, protein yapısı ve fonksiyonunun incelenmesi için zorunludur ve genellikle biyofizik tekniklerle birlikte kullanılır. Ayrıca yeni terapötiklerin geliştirilmesinde önemli bir bileşendir. Fonksiyonel proteomiklerin gelişen çağı, bunu kolaylaştırmak için yüksek verimli protein saflaştırma ve gelişmiş tekniklere olan talebi körüklüyor. Çok sütunlu plaka adaptörünün (MCPA) paralel saflaştırma için çok kuyulu plakalarla farklı reçinelerin birden fazla kromatografi sütununu arayüzleyebileceği varsayıldı. Bu yöntem, otomatik bir sistemin hızına rakip olarak yerçekimi veya vakum altında kullanılabilen ekonomik ve çok yönlü bir protein saflaştırma yöntemi sunar. MCPA, sonraki karakterizasyon ve analiz için uygun fiyatlı ve zaman verimli bir yöntemle miligram protein verimini geri kazanmak için kullanılabilir. MCPA, SH3 etki alanlarının yüksek verimli benzeşimlilik saflaştırılması için kullanılmıştır. İyon değişimi, Ni-NTA benzeşim kromatografisi sonrası proteini saflaştırmak için MCPA aracılığıyla da gösterilmiştir ve bu sistemin diğer saflaştırma türlerine nasıl uyarlanabilebileceğini gösterir. Birden fazla sütunla kurulumu nedeniyle, parametrelerin bireysel olarak özelleştirilmesi, mevcut plaka tabanlı yöntemlerle elde edilemeyen aynı saflaştırmada yapılabilir.

Örnek olarak, MCPA, Ni-NTA (Şekil 2A) aracılığıyla denatüre koşullarında 14 AbpSH3 mutantını başarıyla arındırmıştır. Küçük bir kirletici ~ 25 kDa görülebilir, ancak protein hala büyük ölçüde saftır. Bu kirleticinin, E. coli11'debulunan ortak bir ko-saflaştırılmış protein olan YodA olduğuna inanılmaktadır. Şekil 2B, yerel koşullar altında 11 farklı SH3 etki alanının saflaştır?...

Watch this Scientific Journal Video about An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter at JoVE.com

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Çok sütunlu plaka adaptörü, kromatografi sütunlarının paralel benzeşim veya iyon değişimi saflaştırması için çok kuyulu toplama plakalarıyla arayüzlenmesini sağlayarak ekonomik yüksek verimli protein saflaştırma yöntemi sağlar. Uygun fiyatlı enstrümantasyon yoluyla miligram protein miktarı sağlayan yerçekimi veya vakum altında kullanılabilir.

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Çok sütunlu plaka adaptörü kullanan ekonomik ve çok yönlü yüksek verimli protein arıtma sistemi. Merhaba, protein saflaştırma protein yapısı ve fonksiyonu çalışması için zorunludur. Ve genellikle biyofizik tekniklerle birlikte kullanılır.Bu, özellikle yüksek verimli protein üretimi gerektiren fonksiyonel proteomik çağda önemlidir. Çok sütunlu bir plaka adaptörü olan MCPA'nın, paralel saflaştırma için çok kuyulu plakalarla farklı reçinelerin birden fazla kromatografi sütununu arayüzleyebileceği varsayımını yaptık. Bu adaptör ile otomatik bir sistem hızında yerçekimi veya vakum rakibi altında kullanılabilecek ekonomik ve çok yönlü bir protein arıtma yöntemi geliştirdik.Burada nikel benzeşim kromatografisi ve iyon değişim kromatografisi için bu yöntemi gösteriyoruz. Uzun bir damlama plakasına delinmiş bir sızdırmazlık paspası yerleştirerek MCPA'yı monte edin, ardından istediğiniz sayıda sütunu sızdırmazlık paspasının deliklerine yerleştirin. Manifoldun tabanına açık bir toplama plakası yerleştirin ve manifoldun üst kısmıyla kapatın.Boruyu takın ve monte edilmiş MCPA'yı üstte sütunlarla yerleştirin. Sütunlara nikel-NTA çözeltisinin pipet 1.2 mil. Pipetleme yaparken, boncukların tamamen karışık kalmasını sağlayın.Pompayı çalıştırın ve %20 etanol'ü kolonlardan geçirip aşağıdaki toplama plakasına doğru çalıştırın. Sıvı çalıştırılıyorsa pompayı kapatın. Toplama plakasının içeriğini bir atık kutusuna atın.Tüm sütunlara üç reçine birimi EDTA arabelleği ekleyin. Pompayı açın ve sıvıyı çalıştırın. Şimdi sütunları 0,5 molar sodyum hidroksit tamponu üç reçine hacmi ile yıkayın.Sütunları dört reçine hacminde 100 milimolar nikel sülfat, ardından 10 reçine hacmi Mili-Q su ile yıkayın. Bir sütun daha yavaş çalışıyorsa, sıvıyı şırınna pistonu ile itin. Toplama plakalarının içeriğini bir atık kutusuna dökün.Daha sonra sütunları 10 milimoler imidazol yıkama tamponu dört reçine hacmi ile iki kez yıkayın ve toplama plakalarını boşaltın. Birden fazla numune saflaştırılıyorsa, açık toplama plakalarını 48 kuyu plakalarıyla değiştirin. Vakum kapalıyken, lisatları sütunlara yükleyin.Bağlamayı en üst düzeye çıkarmak için sütundaki boncukları ve lysates'i hafifçe karıştırmak için ince bir plastik karıştırıcı kullanın. Pompayı açın ve sıvıyı çalıştırın. Bir sütun engellenirse, lisat reçine karışımını taze filtreli bir sütuna aktarın.Akışlarınızı içerecek şekilde toplama plakalarını dondurun. Açık bir toplama plakası ile değiştirildi ve ardından sütunları 10 milimolar imidazol yıkama tamponunun dokuz reçine hacmiyle yıkayın. Bu adımı dört veya beş kez tekrarlayın.Taşmasını önlemek için atık plakalarını periyodik olarak boşaltın. Açık toplama plakalarını 96 kuyulu bir plaka ile değiştirerek A1'in sol üst köşede olmasını sağlayın. Sütunlara bir denatüre elution arabelleği bir reçine hacmi pipet.Sıvıyı çalıştırın ve kuyular arasında kirlenme olmadığından emin olmak için toplama plakasını kontrol edin. Bir sonraki seyreltme için, önceki adımları tekrarlayın ve taze bir toplama plakasında toplayın. Saflık ve konsantrasyon analizi için her bir elutiondan 50 mikroliter aliquot alın.Daha sonra, sütunları iki mililitre% 20 etanol ile yıkayın. Sütunlara iki milyon % 20 etanol daha ekleyin ve dört santigrat derecede depolama için 50 mil tüpe aktarmadan önce etanoldeki boncukları karıştırmak için taze ince plastik karıştırıcıyı kullanın. MCPA'yı vakum manifoldunda açık bir toplama plakası ve tüm sütunlarda şırıng pistonları ile monte edin.Tüm şırınna pistonlarını ön sıradan çıkarın. Lastik contayı beş mil şırınna pistonundan çıkarın ve ardından ortada bir delik açın. Daha sonra açık bir sütunun altını delinmiş kauçuk contadan geçirin.Bu adımları yineleyin ve sütunların ön satırına ekleyin. Q sepharose boncuklarının tamamen karıştığından emin olun. Ve alttan iki santimetre kesilen mavi pipet ucuyla, Q sepharose boncuklarının 800 mikrolitresini açık sütunlara borulayın.Boncuklar kolonların altına yerleştikten sonra, vakum pompasını% 20 etanolden geçecek kadar çalıştırın. Sütunları iki milyon 10 milimolar Tris ile iki kez yıkayın. Reçinenin kurumasını önlemek için Tris tamponu çalışmadan hemen önce pompayı kapatın.Runoff atılabilir ve 48 kuyulu bir toplama plakası ile değiştirilebilir. Saflaştırılacak tüm numuneleri ilk sıradaki Q Sepharose sütunlarına aktarın ve vakum pompasını açmadan önce numuneleri ve boncukları yaklaşık iki dakika karıştırmak için ince bir plastik karıştırıcı kullanın. Daha sonraki analizler için akışınızı saklayın veya dondurun.Açık bir toplama plakası ile sütunları iki milyon 10 milimolar Tris ile iki kez yıkayın. Açık toplama plakalarını 96 kuyu plakası ile değiştirin. İlk elution kesir ilk satırda veya ikinci satırda toplanabilir.İkinci sırada elute etmek için şırındıcı pistonları bu konumlardan çıkarın. Q Sepharose sütunlarını bu konumlara getirin ve sonra şırındıcı pistonları ilk satırdaki açık sütunlara yerleştirin. Q Sepharose sütunlarına ilk tuz konsantrasyonlarının bir mililitresini borulayın.Pompayı açın ve elution'ı toplayın. Bir sonraki elution toplamak için şırınna pistonlarını bir sonraki konumlardan çıkarın, Q Sepharose sütunlarını bu konumlara getirin ve ardından pistonları önceki konumlarda değiştirin. Elute etmek için kullanılan her ardışık tuz konsantrasyonu için bu adımları tekrarlayın.Her dört elution için yeni bir toplama plakası kullanıldığından ve her plakanın etiketlenerek depolandığından emin olun. Açık bir toplama plakası ile sütunları iki milyon dört azı dişi sodyum klorür, 10 milimolar Tris ile yıkayın. %20 etanolden iki milyon boru ve boncukların hemen üzerine çıkana kadar bunu çalıştırın ve sonra sütunları depolama için kapatın.Örnek olarak, MCPA 14 AbpSH3 mutantını beş sent-NTA ile denatüre koşullarında başarıyla arındırmıştır. Protein hala büyük ölçüde saf olmasına rağmen, 25 kilodaltonda küçük bir kirletici görülebilir. Denatüre koşullarında görülen küçük kirleticiler doğal koşullarda çıkarılır.Bu, 11 farklı SH3 etki alanı temizlendiğinde gösterildi. Bu, MCPA'nın saflaştırma koşullarının karşılaştırılması için kullanılabileceğini göstermektedir. AbpSH3, iyon değişimi saflaştırması yoluyla kirleticilerin çoğundan lysates'ten ayrılabilir.Önemli ölçüde saf AbpSH3 proteininin iyi verimleri, çeşitli yüksek moleküler ağırlıklardaki kirleticilerle geri kazanıldı. MCPA ile iyon değişimi kullanılarak nikel-NTA sonrası numunelerin saflaştırılması, bu yüksek ağırlıkta kirleticileri başarıyla çıkarmıştır. Hala hafif bir kontaminasyon olmasına rağmen, fraksiyonlar hala büyük ölçüde saftır ve NMR ve termal kimyasal denatürasyon testlerini kullanarak iyi biyofiziksel veriler elde etmişlerdir.Sonuç olarak, sonuçlarımız hipotezimizin doğru olduğunu ve MCPA'nın farklı kromatografi teknikleri kullanarak miligram protein miktarlarını başarıyla saflaştırabileceğini göstermektedir. MCPA sistemi, saflaştırma koşullarını optimize etmek için aynı çalıştırmalar içinde birden çok şekilde yapılandırılabilir. Kurulum basit, ucuz ve deneyimsiz kullanıcıları eğitmek kolaydır, özellikle proteinleri rutin olarak arındırmayan laboratuvarlarda.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Yüksek verimli izolasyon ve küçük hücre dışı veziküllerin saflaştırılması için akış sitometrik sıralama parametrelerinin optimizasyonu

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...