このプロトコルは、造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のためのインキュベーションの5日目から8日目までのニワトリ胚の準備と使用について説明しています。 5日目から8日目に卵殻から内容物を取り出す3つの方法は、殻内での発達を可能にし、基本的なラボツールのみを必要とします。このモデルは、血流イメージング、薬物送達、新しい超音波造影剤やトランスデューサーなど、超音波および血管研究のさまざまな側面を調査するのに適しています。5日齢の胚を準備するには、5日間のインキュベート受精卵を、卵をインキュベーター内と同じ向きにして予熱した卵ホルダーに入れ、ピンセット先端の先のとがったバックエンドを使用して、卵の最上部に小さなくぼみを作ります。
ピンセットを使用して卵の側面に卵の長さの約2/3の2番目のくぼみを作り、大きなピンセットを使用して卵の上部のくぼんだ領域から卵殻の小片を取り除き、気嚢が殻を深く浸透させずに周囲の空気と接触するように注意します。19ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器を使用して、針を下に向けて2番目のくぼみを通してシェルを貫通し、約2ミリリットルのアルブミンを引き出します。アルブミンを採取したら、テープを使用して穿刺を密封し、アルブミンを計量ボートに分注します。
大きなピンセットを使用して、絨毛尿膜の下の殻を取り除いたり、内膜を貫通したりすることなく、胚と絨毛尿膜が完全に見えるまで卵の上部の小さな開口部を拡大します。十分な開口部が作成されたら、ホルダー内で卵を180度回転させて、卵の上部の開口部が下部を向くようにします。1〜2分後、胚は浮き上がり、下から見えなくなります。
胚と絨毛尿膜全体が見えなくなり、卵黄だけが見えたら、側面の開口部からテープをはがします。卵の内側は開口部から膨らんでいるはずです。金属製の計量ボートホルダーの計量ボートの近くに卵の底を保持しながら、小さなピンセットの鋭い先端を使用して、開口部の幅全体にわたって膜に水平方向の引っかき傷をそっとすばやく作り、卵の内容物を計量ボートにそっと落とします。
心拍がまだ存在しているかどうかを確認して、胚がまだ生きていること、脈絡膜血管が無傷であること、そして血液や卵黄の漏れがないことを確認します。生存可能な胚を摂氏37度に置き、37マイクロリットルのPBS滴を胚と絨毛尿膜に定期的に投与します。6〜7日齢の胚と絨毛尿膜を収穫するには、5日齢の胚で実証されたように卵を準備し、19ゲージの針を備えた新しい5ミリリットルの注射器を使用して、針を下に向けて2番目のくぼみから殻を貫通し、1回の浸透で5〜6ミリリットルのアルブミンを引き出します。
アルブミンを採取したら、採取したアルブミンの代わりに、回収量を超える約1ミリリットルの37°CPBSを約1ミリリットル入れた10ミリリットルの注射器の針を下に向けてシェルの側面に挿入します。次に、隙間をテープですばやく再シールし、示されているように卵の処理を終了します。生後8日の受精卵から胚と絨毛尿膜を採取するには、卵を水平に持ち、大きなピンセットの後端を使用し、卵の長さの約半分に小さなくぼみを作ります。
卵殻のスペースの周りに約10ミリメートル離して360度のリングパターンに小さなくぼみを作ります。すべてのくぼみが作成されたら、ピンセットの先のとがった端を使用して、2つのくぼみの間の殻を割って、卵を摂氏37度のPBSに5分間完全に沈めます。孵卵の終わりに、卵をPBSの計量ボートの上に移動し、両方の親指を大きな穴に入れて卵をそっと開き、小さなくぼみに沿って割れます。
卵殻の周りに亀裂が形成されたら、卵の内容物が殻から分離するまでゆっくりと前後に動かしながら、両側をそっと引き離し、内容物を計量ボートに落とします。卵の内容物が入った計量ボートをPBSからゆっくりと持ち上げ、ウェイボートを少し傾けて余分なPBSを取り除きます。次に、計量ボートを金属製の計量ボートホルダーに入れます。
この段階で、胚に鼓動する心臓が見られます。顕微鏡イメージング用の胚および絨毛尿膜サンプルを調製するには、アガロース層を上に向けて、約500ミリリットルの摂氏37度PBSを含む1リットルのペトリ皿の底に、アガロースを含む音響膜を備えたホルダーを置きます。小さなハサミを使用して、絨毛尿膜全体の周囲に6〜7回のカットでビテルス膜にすばやく切り込み、計量ボートを回転させて精度と速度を向上させます。
大さじを使用して、胚と絨毛尿膜を含む切り欠き膜をすくい上げ、スプーンをゆっくりと上げて、胚と絨毛尿膜を含む切り欠き膜がまだ卵黄嚢膜の残りの部分に付着しているかどうかを目視検査できるようにします。スプーンを少し傾けて、ティッシュを乾燥させずにできるだけ多くの卵黄を取り除き、切り取った膜を1リットルのペトリ皿のPBSに沈めます。小さなピンセットを使用して、膜の一方の端をつかんで静かに回転させ、まだ付着している卵黄を取り除き、膜を音響膜のあるホルダーの上に移動します。
昆虫標本ピンを使用して、膜をホルダーの反対側の角に固定し、絨毛尿膜血管に穴を開けないようにします。両方の角が固定されたら、ホルダーを持ち上げて少し傾けてPBSの大部分を廃棄し、小さなピンセットを使用してメンブレンを伸ばしてホルダー全体に均等に分散させ、メンブレンの残りの部分をホルダーに平らに固定できるようにします。胚が固定されたら、ホルダーを摂氏37度の顕微鏡セットアップに入れ、サンプルの関心領域上に音響的および光学的に透明な膜を配置して、血管の光学的視覚化を可能にします。
この代表的な分析では、5、6、7、および8日齢の胚と脈絡膜が実証されたように除去されました。胚または絨毛尿膜への出血または損傷は観察できず、これらの方法を使用して、胚または絨毛尿膜血管に損傷を与えることなく卵内容物を安全に収穫できることを示しています。抽出中に複数の合併症が発生する可能性があるため、プロトコルに注意深く従い、損傷した組織サンプルを廃棄することが重要です。
実証されたように、胚には、例えばマイクロバブルなどの超音波造影剤を注入することができる。送達時に、マイクロバブルは注入された血管の内腔内を循環し、末梢血内を数時間循環するのを観察することができる。マイクロバブル注入前は、Bモードによって胚の心臓の内部でコントラストがすでに観察できますが、高周波超音波サブハーモニックイメージングでは観察できません。
マイクロバブルの添加は、両方のタイプの画像における胚のコントラストおよび視認性を増加させる。造影剤注入後に高周波3Dサブハーモニック画像を取得して、胚および絨毛尿膜内の血管ネットワークを視覚化することもできます。ニワトリ胚および絨毛尿膜血管は、超音波媒介薬物送達を調査するためにも使用することができる。
この手順を試みるときは、胚とCAMを常に摂氏37度に保ち、乾燥させないことが最も重要です。この手順に続いて、ニワトリ胚を水タンクや顕微鏡などのさまざまなセットアップに配置して、コントラスト増強超音波イメージングまたはマイクロバブルを介した薬物送達研究を実行できます。この方法と調製物は、超音波造影剤の研究に適しており、癌やウイルスの研究にも使用できます。
