A preparação de embriões de frango ex ovo e vasos de membrana corioalantóica como modelo in vivo para imagens de ultrassom com contraste e estudos de liberação de drogas mediados por microbolhas

Este protocolo descreve a preparação e o uso de embriões de galinha entre o quinto e o oitavo dia de incubação para imagens de ultrassom com contraste e estudos de entrega de drogas mediados por microbolhas Os três métodos para tirar o conteúdo da casca do ovo no quinto ao oitavo dia permitem seu desenvolvimento dentro da casca e requerem apenas ferramentas básicas de laboratório. Este modelo é adequado para investigar diferentes aspectos da pesquisa ultrassonográfica e vascular, como imagens de fluxo sanguíneo, entrega de medicamentos e novos agentes de contraste e transdutores de ultrassom. Para preparar um embrião de cinco dias de idade, coloque um óvulo fertilizado incubado de cinco dias em um suporte de ovos pré-aquecido com o ovo na mesma orientação que dentro da incubadora e use a extremidade traseira pontiaguda de uma ponta de pinça para fazer um pequeno recuo no topo do ovo.

Use a pinça para fazer um segundo recuo no lado do ovo cerca de 2/3 abaixo do comprimento do ovo e use um par de pinças maiores para remover um pequeno pedaço de casca de ovo da área recuada no topo do ovo, tomando cuidado para que o saco de ar entre em contato com o ar ambiente sem penetrar a casca muito profundamente. Usando uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 19, penetre na casca através do segundo recuo com a agulha apontando para baixo e retire aproximadamente dois mililitros de albumina. Quando a albumina tiver sido coletada, use fita adesiva para selar a punção e dispensar a albumina em um barco de pesagem.

Use as pinças grandes para ampliar a pequena abertura na parte superior do ovo até que o embrião e a membrana corioalantóica sejam totalmente visíveis sem remover a casca abaixo da membrana corioalantóica ou penetrar na membrana interna. Quando uma abertura suficiente tiver sido criada, gire o ovo 180 graus dentro do suporte para que a abertura na parte superior do ovo esteja agora voltada para a parte inferior. Após um a dois minutos, o embrião flutuará para cima, tornando-se invisível a partir do fundo.

Quando todo o embrião e a membrana corioalantóica desaparecerem da vista e apenas a gema estiver visível, remova a fita da abertura lateral. O interior do ovo deve inchar para fora da abertura. Ao segurar o fundo do ovo perto do barco de pesagem no suporte do barco de pesagem de metal, use os pontos afiados das pequenas pinças para fazer um arranhão horizontal suave, mas rapidamente, na membrana em toda a largura da abertura e solte suavemente o conteúdo do ovo no barco de pesagem.

Verifique se os batimentos cardíacos ainda estão presentes para confirmar que o embrião ainda está vivo, os vasos da membrana corioalantóica estão intactos e não há vazamento de sangue ou gema. Coloque o embrião viável a 37 graus Celsius com administração regular de gotas de 30 microlitros de 37 graus Celsius PBS ao embrião e à membrana corioalantóica. Para colher um embrião de seis a sete dias de idade e membrana corioalantóica, prepare o óvulo como demonstrado para um embrião de cinco dias de idade e use uma nova seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 19 para penetrar na casca através do segundo recuo com a agulha apontando para baixo para retirar cinco a seis mililitros de albumina em uma única penetração.

Quando a albumina tiver sido coletada, insira a agulha de uma seringa de 10 mililitros contendo aproximadamente um mililitro de 37 graus Celsius PBS, mais do que o volume retirado, no lado da casca com a agulha apontando para baixo para substituir a albumina colhida. Em seguida, lacre rapidamente a lacuna com um pedaço de fita adesiva e termine de processar o ovo conforme demonstrado. Para colher o embrião e a membrana corioalantóica de um óvulo fertilizado de oito dias de idade, segure o ovo horizontalmente, use a extremidade traseira de um par de pinças grandes e faça um pequeno recuo na metade do comprimento do ovo.

Faça pequenos recuos em um padrão de anel de 360 graus ao redor do espaço da casca do ovo a aproximadamente 10 milímetros de distância. Quando todas as reentrâncias tiverem sido criadas, use a extremidade pontiaguda da pinça para quebrar a casca entre duas das reentrâncias e submergir completamente o ovo em PBS Celsius de 37 graus Celsius por cinco minutos. No final da incubação, mova o ovo sobre um barco de pesagem no PBS e coloque os dois polegares no grande orifício para abrir suavemente o ovo, que deve rachar ao longo das pequenas reentrâncias.

Quando a rachadura se formar ao redor da casca do ovo, puxe suavemente os dois lados para longe, enquanto move suavemente os pedaços para frente e para trás até que o conteúdo do ovo seja separado da casca e solte o conteúdo no barco de pesagem. Levante lentamente o barco de pesagem contendo o conteúdo do ovo do PBS, inclinando ligeiramente o barco para remover qualquer excesso de PBS. Em seguida, coloque o barco de pesagem em um suporte de pesagem de metal.

Nesta fase, um coração batendo pode ser visto no embrião. Para preparar uma amostra de embrião e membrana corioalantóica para microscopia, coloque um suporte com uma membrana acústica com agarose no fundo de uma placa de Petri de uma ninhada contendo aproximadamente 500 mililitros de PBS Celsius de 37 graus com a camada de agarose voltada para cima. Use uma tesoura pequena para cortar rapidamente a membrana do vitelo em seis a sete cortes ao redor de toda a membrana corioalantóica enquanto gira o barco de pesagem para melhor precisão e velocidade.

Use uma colher de sopa para colher a membrana de recorte contendo o embrião e a membrana corioalantóica e levante lentamente a colher para permitir a inspeção visual de se a membrana recortada contendo o embrião e a membrana corioalantóica ainda está ligada ao restante da membrana do saco vitelino. Incline ligeiramente a colher para se livrar do máximo de gema possível sem secar o tecido e submerja a membrana recortada no PBS na placa de Petri de um litro. Usando pequenas pinças, segure e gire suavemente uma borda da membrana para remover qualquer gema que ainda esteja presa antes de mover a membrana sobre o suporte com a membrana acústica.

Use um pino de amostra de inseto para prender a membrana aos cantos opostos do suporte e evite perfurar os vasos da membrana corioalantóica. Quando ambos os cantos tiverem sido fixados, levante e incline ligeiramente o suporte para descartar a maior parte do PBS e use as pequenas pinças para esticar e distribuir uniformemente a membrana sobre o suporte para permitir que o resto da membrana seja fixado plano ao suporte. Quando o embrião tiver sido fixado, coloque o suporte em uma configuração de microscopia a 37 graus Celsius e coloque uma membrana acústica e opticamente transparente sobre a região de interesse da amostra para permitir a visualização óptica dos vasos.

Nesta análise representativa, embriões de cinco, seis, sete e oito dias de idade e membranas corioalantóicas foram removidos conforme demonstrado. Nenhum sangramento ou dano aos embriões ou membranas corioalantóicas pode ser observado, indicando que esses métodos podem ser usados para colher com segurança o conteúdo do óvulo sem prejudicar o embrião ou os vasos da membrana corioalantóica. Múltiplas complicações podem ocorrer durante a extração, por isso é importante seguir o protocolo cuidadosamente e descartar quaisquer amostras de tecido danificado.

Como demonstrado, o embrião pode ser injetado com, por exemplo, agentes de contraste de ultrassom, como microbolhas. Após o parto, as micro bolhas podem ser observadas circulando dentro do lúmen do vaso sanguíneo injetado e circulando dentro do sangue periférico por várias horas. Antes da injeção de microbolhas, o contraste já pode ser observado dentro do coração embrionário pelo modo B, mas não por ultrassom de alta frequência por imagem sub-harmônica.

A adição de microbolhas aumenta o contraste e a visibilidade do embrião em ambos os tipos de imagens. Imagens sub-harmônicas 3D de alta frequência também podem ser obtidas após a injeção de agente de contraste para visualizar redes de vasos dentro do embrião e da membrana corioalantóica. O embrião de galinha e os vasos da membrana corioalantóica também podem ser usados para investigar a entrega de medicamentos mediada por ultrassom.

Ao tentar este procedimento, é mais importante manter sempre o embrião e a CAM a 37 graus Celsius e não deixá-lo secar. Após este procedimento, o embrião de galinha pode ser colocado em diferentes configurações, como um tanque de água ou microscópio para realizar imagens de ultrassom com contraste ou estudos de entrega de medicamentos mediados por microbolhas. Este método e preparação é adequado para estudos de agentes de contraste de ultrassom e também pode ser usado para câncer e pesquisa de vírus.