Name: a mouse model for chronic pancreatitis via bile duct tnbs infusion
Uploaded: 2021-02-28T13:30:00
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この研究は、退役軍人省(VA-ORD BLR&DメリットI01BX004536)と国立衛生研究所の助成金#1R01DK105183、DK120394、およびHWにDK118529によってサポートされました。技術経験を共有してくれたホンジュ・ウー博士に感謝します。

すべての手順は、サウスカロライナ医科大学とラルフ・H・ジョンソン医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認を得て行われました。C57BL/6J雄マウスは、8〜10週齢の間に、この研究で使用された。マウスは、食物および水へのアドリビタムアクセスを伴う標準的な12光/12暗いサイクルの下に収容された。
1. 注射用TNBS溶液の調製
<ol><li>10%のエタノールを0.9%生?...

<ol>
	<li>Klauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+induced+vs.+classical+animal+models+of+chronic+pancreatitis:+a+critical+comparison.">Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison.</a> The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).</li><li>Liao, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+is+involved+in+&#181;-opioid+receptor+suppression+in+the+spinal+dorsal+horn+in+a+rat+model+of+chronic+pancreatitis+pain.">Histone deacetylase 2 is involved in &#181;-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).</li><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+activity+governs+increased+susceptibility+to+pancreatitis+in+mice+expressing+human+PRSS1R122H.">Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Stem+Cell+Therapy+Mitigates+Chronic+Pancreatitis+via+Differentiation+into+Acinar-like+Cells+in+Mice.">Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice.</a> Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).</li><li>Aghdassi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+investigating+chronic+pancreatitis.">Animal models for investigating chronic pancreatitis.</a> Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).</li><li>Scoggins, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-dependent+acinar+cell+apoptosis+triggers+epithelial+proliferation+in+duct-ligated+murine+pancreas.">p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).</li><li>Bradley, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+duct+pressure+in+chronic+pancreatitis.">Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis.</a> The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).</li><li>Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+pancreatitis:+can+it+be+translated+to+human+pain+study.">Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study.</a> World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).</li><li>Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+behavioral+changes+in+nociception+in+a+novel+rat+model+of+chronic+pancreatitis+for+the+study+of+pain.">Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain.</a> Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).</li><li>Cattaruzza, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+receptor+potential+ankyrin+1+mediates+chronic+pancreatitis+pain+in+mice.">Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+insular+cortex+mediates+hyperalgesia+induced+by+chronic+pancreatitis+in+rats.">Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats.</a> Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).</li><li>Puig-Div&#237;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+pancreatic+disease+by+trinitrobenzene+sulfonic+acid+infusion+into+rat+pancreatic+ducts.">Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts.</a> Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX4+Gene+Transfer+Induces+alpha-to-beta+Cell+Phenotypic+Conversion+and+Confers+Therapeutic+Benefits+for+Diabetes+Treatment.">PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment.</a> Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).</li><li>Ceppa, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+proteases+mediate+inflammatory+pain+in+acute+pancreatitis.">Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).</li><li>Puig-Divi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+pancreatic+disease+by+trinitrobenzene+sulfonic+acid+infusion+into+rat+pancreatic+ducts.">Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts.</a> Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).</li><li>Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+excitability+and+suppression+of+A-type+K++current+of+pancreas-specific+afferent+neurons+in+a+rat+model+of+chronic+pancreatitis.">Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).</li><li>Drewes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+in+chronic+pancreatitis:+the+role+of+neuropathic+pain+mechanisms.">Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms.</a> Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).</li></ol>

慢性膵炎を誘発するTNBSの胆管注入は、マウスでは技術的に困難であり、マウスの最大22.5%が薬物注入10の3〜4日以内に死ぬ可能性がある。ここでは、この報告書は、以前の研究に基づいて手順を洗練し、早期マウス死亡率を<10%に減少させた。例えば、薬物量の増加(35μLから50μL)は、薬物が膵臓全体に到達することを保証することができる。インスリン注射器と小さい針サイ?...

慢性膵炎(CP)は、膵臓の萎縮、線維症、腹痛、および外分泌および内分泌機能の両方の最終的な喪失を特徴とする慢性炎症性疾患である。現在の医学的および外科的治療は治癒的ではありませんが、難治性腹痛、内分泌および外分泌機能不全という疾患の結果である症状を緩和するために行われている。したがって、より効果的な治療が緊急に必要とされる2.動物モデルは、病気のより良い理解を開発し、潜在的な治療薬を調査するための不可欠なツールを提供します3.CP用の複数のマウスモデルが開発されており、その中でセルリンやアルコールモデルが一般的に使用されています。セレルミンは、膵臓分泌を刺激するオリゴペプチドであり、膵萎縮、線維症、とりわけ4を特徴とするCPモデルを再現的に誘導することが示されている。別の一般的なモデルは、L-アルギニンの連続注射を使用します, 人間の患者で観察されたものと同様の外分泌不全を生成します 5.CPはまた、完全または部分的な膵管結紮、ならびに膵管高血圧6、7によって誘発され得る。CPで利用可能な様々な動物モデルにもかかわらず、これらのモデルのどれも効果的にCP患者8によって経験した腹痛を再現しません。
これまでの研究では、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の局所膵臓注射は、CP患者9、10、11が経験した持続的な痛みを複製することを示した。TNBS処置マウスは、腹部過敏症および疼痛関連行動の増加ならびに痛みを伴う刺激に対する「一般化過敏症」を示し、CP患者10において観察されている現象である。TNBSモデルは、CP疼痛を正確に模倣することに加えて、線維症、単核細胞浸潤、および脂肪組織10、12との共生細胞の置換などのヒト状態の他の病理学的特徴を複製する。しかし、胆管を介したTNBS注入は、死を引き起こす可能性のあるマウスでは技術的に困難な手順である。私たちの知る限りでは、胆管注入がどのように行われるかを示す視覚的なプロトコルはありません。本稿では、CPマウスモデルを生成するTNBSの胆管注入の手順を示す。この手順は、CPおよび他の膵臓疾患の研究のための貴重な動物モデルを生成するのに役立ち、膵臓13に他の材料(例えば、ウイルス、細胞)を注入するために使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin v/v</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23426796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Anesthesia system</td>
			<td>VetEquip, Inc.</td>
			<td>901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride, injection</td>
			<td>Par Sterile Products, LLC</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0553859A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Micro Dissecting scissors 4&#8221; straight sharp</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps 4&#8221; extra delicate tip</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated pad</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMKMBKM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25&#8221;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-7850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31-gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>324909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine prep pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro clip applying forceps 5.5&#8221;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro clip, straight strong curved 1x6mm</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro clip, straight, 0.75mm clip width</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>92822-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture 4-0</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>MV-8683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture 5-0</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>MV-8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, 0.9% intravenous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2B1322Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape, sterile</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>DR1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Von Frey filaments</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>EB2-VFF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for chronic pancreatitis via bile duct tnbs infusion

慢性膵炎(CP)は、膵炎や線維症、腺萎縮、腹痛および他の症状を含む複雑な疾患である。CPを研究するためにいくつかのげっ歯類モデルが開発されており、そのうち胆管2,4,6 -トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)注入モデルは、CPに見られる神経因性疼痛の特徴を再現しています。しかし、マウスの胆管薬物注入は技術的に困難です。このプロトコルは、CPマウスモデルの生成のための胆管TNBS注入の手順を示す。TNBSは十二指腸のヴァーターのアンフィラを通して膵臓に注入された。このプロトコルは、処置中に薬物容積、外科技術および薬物処理を最大限に活用した。TNBS治療マウスは、体重および膵臓の体重減少、疼痛関連行動の変化、および異常な膵形態によって反映されるCPの特徴を示した。これらの改善により、TNBS注射に伴う死亡率は最小限であった。この手順は、膵臓疾患モデルを生成する上で重要であるだけでなく、局所的な膵薬の送達にも有用である。

胆管注入手順は、この手順10に関連するマウスの死亡率を減少させるために最適化された。TNBSは、最初に35μLまたは50μLの総体積で与えられた。50 μLの容積でTNBSを注入すると、膵臓全体に達し、より均質な疾患表現型を誘導する可能性がある(図1B)。さらに、31G針を用いたインスリン注射器を使用したTNBSの注射は、通常の注射器および針のサイズに対す...

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A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

慢性膵炎(CP)は、しばしば難治性腹痛に関連する膵臓の炎症および線維症を特徴とする疾患である。本稿では、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いた胆管注入を介してCPのマウスモデルを生成する技術を改良することに焦点を当てています。

胆管TNBS輸液による慢性膵炎のマウスモデル

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

慢性膵炎は、膵炎、線維症、腹痛、その他の症状を伴う複雑な疾患です。胆管TNBS注入モデルは慢性膵炎患者で観察される神経因性疼痛を複製する。この胆管TNBS注入プロトコルは、マウスの慢性膵炎モデルの生成を誘導するために最適化されています。マウスの胆管薬物融合は技術的に困難であるため、その視覚化は、この方法に新しい研究者に役立ちます。手術の前と2週間と3週間後に、フォン・フレイのモノフィラメントを使用して、生後8〜10週のC57ブラックシックスマウスの上腹部に異なるレベルの力を加え、1回1〜2秒間10回適用します。肯定的な応答として腹部の退位または舐めを上げることを検討してください。次に、新たに調製した0.75%TNBS溶液の50マイクロリットルを備えた31ゲージ針を装備したインスリン注射器をロードする。車両制御として生理食塩水に50マイクロリットルのエタノールを含む2番目の注射器をロードし、両方の注射器を光から保護された氷の上に置きます。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、剃毛または脱毛クリームを塗布することによって麻酔マウスの腹部領域から毛髪を取り除き、解剖顕微鏡の下で加熱された外科パッドの上にマウスを置きます。各眼に獣医軟膏を塗布し、3つの連続した2%のヨウ素と3つの70パーセントのエタノールワイプで外科部位を消毒し、マイクロハサミを使用して1回の連続運動で0.5〜1センチメートルの切開を行い、綿棒を使用して十二指腸を穏やかに露出させ、共通の胆管を見つけます。肝臓と胆嚢への治療の流れを防ぐために、顕微鏡を使用して近位共通の管の上にまっすぐなマイクロヘモクリップを配置し、TNBSに装填された注射器の針を膵管にバターの乳頭を通して挿入する。湾曲したマイクロヘモクリップを使用して針を固定し、1分間にわたって溶液を膵管に注入します。すべての溶液が届いた時、慎重にマイクロクランプを取り外し、十二指腸が元の位置に戻っていることを確認します。腹腔の閉鎖前に、十二指腸が元の位置に戻るのを助け、蠕動の回復を助けるために36〜37°Cの無菌生理食塩水の500マイクロリットルを加える。5-Oステッチで連続縫合糸を使用して筋肉層の切開を閉じ、4-Oステッチで中断された縫合糸を使用して皮膚を閉じます。その後、完全な再実行まで監視と加熱パッド上の回復ケージにマウスを置きます。手術後の最初の週にマウスの健康と行動を毎日監視し、発声、腰の姿勢、移動を減らし、1日おきに体重を測定するなど、苦痛の兆候を確認します。観察されるように、50マイクロリットルのインクの注入が示されるように、膵臓全体の浸潤をもたらし、より均質な疾患表現型の誘導を可能にする。この代表的な分析では、手術後の最初の3日間で、対照群のマウスは元の体重の約6%を失い、21日目までに徐々に回復し、元の体重の100%以上を得た。対照的に、TNBSを受けたマウスは、手術後の最初の5日間に元の体重の約15%を失い、21日目までに元の体重の100%弱を取り戻しました。対照マウスと比較して、TNBS注射動物は手術後2週目と3週目に腹部の機械的過敏症の増加を示した。膵臓の体重当たりの大きさおよび重量は、対照動物から採取された膵臓と比較してTNBSマウスで有意に減少した、重篤で長期にわたる慢性膵炎を有するヒトにおける知見と一致するTNBS処置動物における顕著な膵萎縮を示唆した。対照エタノール処理マウスからの膵組織切片の組織学的分析は正常な形態を示し、TNBS処置マウスの組織切片は脂肪細胞浸潤および線維化に置き換えられたアシナル細胞の大量喪失で空虚な実現を示した。注射されたTNBSがgal膀胱に入るのを防ぐことは、TNBSが組織に有害な影響を及ぼすので重要である。注入中は、その胆管の穿刺作用を避けるために、手をできるだけ安定に保ちます。慢性膵炎の発症を誘発することに加えて、この胆管注入マウスは、他の膵病モデルの開発に使用することができる。このTNBS慢性膵炎マウスモデルは、慢性膵炎の病態と治療、ならびに他の膵臓疾患の両方を研究するために使用することができる。

Research

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Medicine

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