Name: a mouse model for chronic pancreatitis via bile duct tnbs infusion
Uploaded: 2021-02-28T13:30:00
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Este estudio fue apoyado por el Departamento de Asuntos de Veteranos (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536), y el Instituto Nacional de Salud otorga subvenciones # 1R01DK105183, DK120394 y DK118529 a HW. Agradecemos al Dr. Hongju Wu por compartir experiencias técnicas.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur y el Centro Médico Ralph H. Johnson. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J entre 8-10 semanas de edad. Los ratones fueron alojados bajo un ciclo estándar de 12 luces / 12 oscuros con acceso ad libitum a los alimentos y al agua.
1. Preparación de TNBS solución inyectable
<ol><li>Preparar etanol al 10% en s...

<ol>
	<li>Klauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+induced+vs.+classical+animal+models+of+chronic+pancreatitis:+a+critical+comparison.">Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison.</a> The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).</li><li>Liao, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+is+involved+in+&#181;-opioid+receptor+suppression+in+the+spinal+dorsal+horn+in+a+rat+model+of+chronic+pancreatitis+pain.">Histone deacetylase 2 is involved in &#181;-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).</li><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+activity+governs+increased+susceptibility+to+pancreatitis+in+mice+expressing+human+PRSS1R122H.">Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Stem+Cell+Therapy+Mitigates+Chronic+Pancreatitis+via+Differentiation+into+Acinar-like+Cells+in+Mice.">Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice.</a> Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).</li><li>Aghdassi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+investigating+chronic+pancreatitis.">Animal models for investigating chronic pancreatitis.</a> Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).</li><li>Scoggins, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-dependent+acinar+cell+apoptosis+triggers+epithelial+proliferation+in+duct-ligated+murine+pancreas.">p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).</li><li>Bradley, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+duct+pressure+in+chronic+pancreatitis.">Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis.</a> The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).</li><li>Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+pancreatitis:+can+it+be+translated+to+human+pain+study.">Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study.</a> World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).</li><li>Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+behavioral+changes+in+nociception+in+a+novel+rat+model+of+chronic+pancreatitis+for+the+study+of+pain.">Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain.</a> Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).</li><li>Cattaruzza, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+receptor+potential+ankyrin+1+mediates+chronic+pancreatitis+pain+in+mice.">Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+insular+cortex+mediates+hyperalgesia+induced+by+chronic+pancreatitis+in+rats.">Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats.</a> Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).</li><li>Puig-Div&#237;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+pancreatic+disease+by+trinitrobenzene+sulfonic+acid+infusion+into+rat+pancreatic+ducts.">Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts.</a> Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX4+Gene+Transfer+Induces+alpha-to-beta+Cell+Phenotypic+Conversion+and+Confers+Therapeutic+Benefits+for+Diabetes+Treatment.">PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment.</a> Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).</li><li>Ceppa, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+proteases+mediate+inflammatory+pain+in+acute+pancreatitis.">Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).</li><li>Puig-Divi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+pancreatic+disease+by+trinitrobenzene+sulfonic+acid+infusion+into+rat+pancreatic+ducts.">Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts.</a> Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).</li><li>Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+excitability+and+suppression+of+A-type+K++current+of+pancreas-specific+afferent+neurons+in+a+rat+model+of+chronic+pancreatitis.">Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).</li><li>Drewes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+in+chronic+pancreatitis:+the+role+of+neuropathic+pain+mechanisms.">Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms.</a> Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).</li></ol>

La infusión de TNBS en las vías biliares para inducir pancreatitis crónica es técnicamente un desafío en ratones, ya que hasta el 22,5% de los ratones pueden morir dentro de los 3-4 días posteriores a la infusión del medicamento10. Aquí, este informe refinó el procedimiento basado en estudios previos y redujo la mortalidad temprana de ratones a <10%. Por ejemplo, el aumento del volumen de medicamentos (de 35 μL a 50 μL) puede garantizar que los medicamentos lleguen a todo el páncreas. ...

La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la atrofia del páncreas, fibrosis, dolor abdominal y eventual pérdida de las funciones exocrina y endocrina1. Los tratamientos médicos y quirúrgicos actuales no son curativos, sino que se llevan a cabo para aliviar los síntomas que son la consecuencia de la enfermedad: dolor abdominal refractario, disfunción endocrina y exocrina. Por lo tanto, se necesitan urgentemente tratamientos más efectivos2. Los modelos animales proporcionan una herramienta esencial para desarrollar una mejor comprensión de la enfermedad e investigar posibles terapias3. Se han desarrollado múltiples modelos de ratón para PC, de los cuales se utilizan comúnmente modelos de ceruleína y / o alcohol. Se ha demostrado que la ceruleína, un oligopéptido que estimula la secreción pancreática, induce de forma reproducible un modelo de PC con atrofia pancreática, fibrosis, entre otros4. Otro modelo común utiliza inyecciones seriadas de L-arginina, que produce insuficiencia exocrina similar a la observada en pacientes humanos5. La PC también puede ser inducida por ligadura completa o parcial del conducto pancreático, así como por hipertensión del conducto pancreático6,7. A pesar de la variedad de modelos animales disponibles para la PC, ninguno de estos modelos reproduce eficazmente el dolor abdominal experimentado por los pacientes conPC 8.
Estudios previos mostraron que la inyección pancreática local de ácido 2,4,6 -trinitrobenceno sulfónico (TNBS) replica el dolor persistente experimentado por los pacientes con PC9,10,11. Los ratones tratados con TNBS demostraron hipersensibilidad abdominal y un aumento de los comportamientos relacionados con el dolor, así como una "hipersensibilidad generalizada" a los estímulos dolorosos, un fenómeno que se ha observado en pacientes con PC10. Además de imitar con precisión el dolor CP, el modelo TNBS también replica otras características patológicas de la condición humana como la fibrosis, la infiltración de células mononucleares y el reemplazo de células acinares con tejido graso10,12. Sin embargo, la infusión de TNBS a través del conducto biliar es un procedimiento técnicamente desafiante en ratones que puede causar la muerte. Hasta donde sabemos, no existe un protocolo visual que muestre cómo se realiza la infusión de conductos biliares. En este artículo, demostramos el procedimiento de la infusión de ducción biliar de TNBS para generar un modelo de ratón CP. Este procedimiento ayudará a generar valiosos modelos animales para el estudio de la PC y otras enfermedades pancreáticas y se puede utilizar para infundir otros materiales (por ejemplo, virus, células) en el páncreas13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin v/v</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23426796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Anesthesia system</td>
			<td>VetEquip, Inc.</td>
			<td>901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride, injection</td>
			<td>Par Sterile Products, LLC</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0553859A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Micro Dissecting scissors 4&#8221; straight sharp</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps 4&#8221; extra delicate tip</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated pad</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMKMBKM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25&#8221;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-7850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31-gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>324909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine prep pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro clip applying forceps 5.5&#8221;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro clip, straight strong curved 1x6mm</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro clip, straight, 0.75mm clip width</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>92822-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture 4-0</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>MV-8683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture 5-0</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>MV-8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, 0.9% intravenous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2B1322Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape, sterile</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>DR1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Von Frey filaments</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>EB2-VFF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for chronic pancreatitis via bile duct tnbs infusion

La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad compleja que involucra inflamación pancreática y fibrosis, atrofia glandular, dolor abdominal y otros síntomas. Se han desarrollado varios modelos de roedores para estudiar la CP, de los cuales el modelo de infusión de ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS) del conducto biliar 2,4,6 replica las características del dolor neuropático observado en la PC. Sin embargo, la infusión de medicamentos para las vías biliares en ratones es técnicamente desafiante. Este protocolo demuestra el procedimiento de infusión de TNBS de conducto biliar para la generación de un modelo de ratón CP. TNBS se infundió en el páncreas a través de la ampolla de Vater en el duodeno. Este protocolo optimizó el volumen de medicamentos, las técnicas quirúrgicas y el manejo de medicamentos durante el procedimiento. Los ratones tratados con TNBS mostraron características de PC reflejadas por las reducciones de peso corporal y páncreas, los cambios en los comportamientos asociados al dolor y la morfología pancreática anormal. Con estas mejoras, la mortalidad asociada con la inyección de TNBS fue mínima. Este procedimiento no solo es crítico en la generación de modelos de enfermedad pancreática, sino que también es útil en la administración local de medicamentos pancreáticos.

Los procedimientos de infusión de conductos biliares se optimizaron para reducir la mortalidad de ratones asociada con este procedimiento10. TNBS se administró por primera vez en un volumen total de 35 μL o 50 μL. La inyección de TNBS en un volumen de 50 μL podría llegar a todo el páncreas e inducir un fenotipo de enfermedad más homogéneo(Figura 1B). Además, la inyección de TNBS utilizando una jeringa de insulina con aguja 31G podría controlar mejor la ve...

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A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad caracterizada por inflamación y fibrosis del páncreas, a menudo asociada con dolor abdominal intratable. Este artículo se centra en refinar la técnica para generar un modelo de ratón de CP mediante infusión de conductos biliares con ácido sulfónico trinitrobenceno 2,4,6 (TNBS).

Un modelo de ratón para la pancreatitis crónica a través de la infusión de TNBS del conducto biliar

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

La pancreatitis crónica es una enfermedad compleja que involucra inflamación pancreática, fibrosis, dolor abdominal y otros síntomas. El modelo de infusión TNBS del conducto biliar replica el dolor neuropático observado en pacientes con pancreatitis crónica. Este protocolo de infusión de TNBS de conducto biliar ha sido optimizado para inducir la generación de un modelo de pancreatitis crónica en ratones.Como la fusión de fármacos del conducto biliar en ratones es técnicamente desafiante, su visualización será útil para los investigadores nuevos en el método. Antes y dos y tres semanas después de la cirugía, use monofilamentos de Von Frey para aplicar diferentes niveles de fuerza en orden ascendente al área abdominal superior de un ratón negro C57 de ocho a 10 semanas de edad, 10 veces durante uno o dos segundos por aplicación. Considere elevar la retracción o lamer el abdomen como una respuesta positiva.A continuación, cargue una jeringa de insulina equipada con una aguja de calibre 31 con 50 microlitros de una solución TNBS al 0,75 por ciento recién preparada. Cargue una segunda jeringa con 50 microlitros de etanol al 10 por ciento en solución salina como control del vehículo y coloque ambas jeringas en hielo protegido de la luz. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, retire el vello de la región abdominal del ratón anestesiado afeitándose o aplicando crema depilación y coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica calentada bajo un microscopio de disección.Aplique ungüento veterinario en cada ojo y desinfecte el sitio quirúrgico con tres toallitas secuenciales de dos por ciento de yodo y tres toallitas de etanol al 70 por ciento use micro tijeras para hacer una incisión de 0.5 a un centímetro en un movimiento continuo y use hisopos de algodón para exponer suavemente el duodeno y localizar el conducto biliar común. Para evitar el flujo del tratamiento hacia el hígado y la vesícula biliar, use el microscopio para colocar un micro hemoclip recto sobre el conducto común proximal e inserte la aguja de la jeringa cargada con TNBS a través de la papila del vater en el conducto pancreático. Use un micro hemoclip curvo para asegurar la aguja e infunda la solución en el conducto pancreático en el transcurso de un minuto.Cuando se haya entregado toda la solución, retire cuidadosamente las micro abrazaderas y confirme que el duodeno ha vuelto a su posición original. Antes del cierre de la cavidad abdominal, agregue 500 microlitros de solución salina estéril de 36 a 37 grados Celsius para ayudar a que el duodeno vuelva a su posición original y para ayudar con la recuperación de la peristalsis. Use una sutura continua con un punto de cinco O para cerrar la incisión en la capa muscular y cierre la piel con una sutura interrumpida con un punto de cuatro O.Luego coloque el mouse en una jaula de recuperación en una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recostación completa. Monitoree la salud y el comportamiento del ratón diariamente durante la primera semana después de la cirugía para detectar signos de angustia, como vocalizar, una postura de espalda encorvada o reducir la locomoción y medir el peso corporal cada dos días. Como se ha observado, la inyección de 50 microlitros de tinta como se ha demostrado da como resultado la infiltración de todo el páncreas, permitiendo la inducción de un fenotipo de enfermedad más homogéneo.En este análisis representativo, en los primeros tres días después de la cirugía, los ratones en el grupo de control perdieron alrededor del seis por ciento de su peso corporal original antes de recuperarse gradualmente y ganar más del 100% de su peso corporal original para el día 21. En contraste, los ratones que recibieron TNBS perdieron alrededor del 15 por ciento de su peso corporal original durante los primeros cinco días después de la cirugía y recuperaron poco menos del 100 por ciento de su peso corporal original para el día 21. En comparación con los ratones de control, los animales inyectados con TNBS mostraron un aumento de la hipersensibilidad mecánica abdominal durante la segunda y tercera semana después de la cirugía.El tamaño y el peso por peso corporal de los páncreas se redujeron significativamente en ratones TNBS en comparación con los páncreas cosechados de animales de control, lo que sugiere una marcada atrofia pancreática en animales tratados con TNBS consistente con los hallazgos en humanos con pancreatitis crónica grave y a largo plazo. El análisis histológico de las secciones de tejido pancreático de ratones tratados con etanol de control mostró una morfología normal, mientras que las secciones de tejido de ratones tratados con TNBS exhibieron una realización vacua con una pérdida masiva de células acinares que fueron reemplazadas por infiltración de células grasas y fibrosis. Evitar que el TNBS inyectado entre en la vejiga gal y el intestino es importante ya que un TNBS tiene efectos dañinos para el tejido.Durante la infusión, mantenga la mano lo más estable posible para evitar la punción que actúa ese conducto biliar. Además de inducir el desarrollo de pancreatitis crónica, este arte de ratones de infusión de conductos biliares se puede utilizar para el desarrollo de otros modelos de enfermedad pancreática. Este modelo de ratón de pancreatitis crónica TNBS se puede utilizar para estudiar tanto la patogénesis como el tratamiento de la pancreatitis crónica, así como otras enfermedades pancreáticas.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

Medicina

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