Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

نود أن نشكر أوليفييه بوركييه وألكسندر أوليهلا على سلالة مراسل LuVeLu ، ومختبر SunJin لعينة اختبار RapiClear ، وهوغو بيريرا على المساعدة في استخدام BigStitcher ، ونونو غرانجيرو للمساعدة في إعداد جهاز التصوير الحي ، ومرفق الحيوانات التابع للجنة الحكومية الدولية والأعضاء السابقين والحاليين في مختبر Mallo للحصول على تعليقات ودعم مفيدين خلال هذا العمل.
ونشكر الدعم التقني المقدم من مرفق التصوير المتقدم التابع للجنة الحكومية الدولية، والذي يدعمه التمويل البرتغالي المرجع #PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 والمرجع رقم PTDC/BII-BTI/32375/2017، الذي يشترك في تمويله برنامج لشبونة التشغيلي الإقليمي (لشبونة 2020)، بموجب اتفاق الشراكة البرتغالي لعام 2020، من خلال الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (FEDER) ومؤسسة العلوم والتكنولوجيا (FCT، البرتغال). تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة من خلال منح LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT، البرتغال) و SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia، البرتغال) إلى M.M.، والبنية التحتية البحثية Congento، ومشروع LISBOA-01-0145-FEDER-022170، وزمالة الدكتوراه PD/BD/128426/2017 إلى A.D.

اتبعت التجارب التي شملت الحيوانات التشريعات البرتغالية (Portaria 1005/92) والأوروبية (التوجيه 2010/63/EU) المتعلقة بالإسكان والتربية والرعاية الاجتماعية. وقد استعرضت المشروع ووافقت عليه لجنة الأخلاقيات التابعة ل "معهد غولبنكيان دي سينسيا" والكيان الوطني البرتغالي "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (مرجع ا...

الاستطالة المحورية والتقسيم هما من أكثر العمليات تعقيدا وديناميكية التي تحدث أثناء التطور الجنيني للفقاريات. تم تطبيق استخدام التصوير ثلاثي الأبعاد و 4D مع تتبع خلية واحدة ، لبعض الوقت ، لدراسة هذه العمليات في كل من أجنة الزرد والدجاج ، والتي تسهل ظروف الوصول إليها واستزراعها التصوير الم?...

تشكيل محور جسم الفقاريات هو عملية معقدة للغاية وديناميكية تحدث أثناء التطور الجنيني. في نهاية عملية المعدة [في الفأر ، حول اليوم الجنيني (E) 8.0] ، تصبح مجموعة من الخلايا السلفية الفوقية المعروفة باسم أسلاف الجلد المتوسط العصبي (NMPs) محركا رئيسيا للامتداد المحوري في تسلسل الرأس إلى الذيل ، مما يولد الأنبوب العصبي وأنسجة الجلد المتوسط الباراكسي أثناء تكوين الرقبة والجذع والذيل1،2،3،4 . ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن الموقع الذي تشغله هذه NMPs في الأرومة الذيلية يلعب دورا رئيسيا في قرار التمايز إلى الأديم المتوسط أو الأديم العصبي5. على الرغم من أننا نفتقر حاليا إلى بصمة جزيئية دقيقة ل NMPs ، إلا أنه يعتقد عموما أن هذه الخلايا تشترك في التعبير عن T (Brachyury) و Sox2 5,6. الآليات الدقيقة التي تنظم قرارات مصير NMP (أي ما إذا كانت تتخذ طرقا عصبية أو متوسطة الجلد) بدأت فقط في التحديد بدقة. تعبير Tbx6 في منطقة الخط البدائي هو علامة مبكرة على قرار مصير NMP ، حيث يشارك هذا الجين في تحريض ومواصفات الأديم المتوسط 6,7. ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن خلايا الأديم المتوسط المبكرة تعبر عن مستويات عالية من Epha18 ، وإشارات Wnt / β-catenin ، وكذلك Msgn1 ، كما تبين أنها تلعب أدوارا مهمة في تمايز الأديم المتوسط الباراكسي وتكوين السوميت 9,10. من المؤكد أن التحليل المكاني الزماني الكامل ل NMPs على مستوى خلية واحدة سيكون مفيدا لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في مواصفات الأديم المتوسط بشكل كامل.
تشكيل سوميت (سلائف الفقرات) هو سمة رئيسية من سمات الفقاريات. أثناء الاستطالة المحورية ، يصبح الأديم المتوسط الباراكسالي مجزأ في سلسلة من الوحدات المتكررة الثنائية المعروفة باسم somites. يختلف عدد السوميت والوقت اللازم لتشكيل شرائح جديدة بين الأنواع11,12. يتضمن تكوين السوميتوجينيسيس تذبذبات إشارات دورية (تعرف باسم "ساعة التجزئة") يمكن ملاحظتها من خلال التعبير الدوري لعدة جينات من مسارات إشارات Notch و Wnt و Fgf في الأديم المتوسط قبل الوهمي (على سبيل المثال ، Lfng) 11,12. يفترض النموذج الحالي لتكوين السوميتوجينيسيس أيضا وجود "جبهة موجية للنضج" ، وهي سلسلة من تدرجات الإشارات المعقدة التي تنطوي على إشارات Fgf و Wnt وحمض الريتينويك التي تحدد موضع الحدود الخلفية لكل سوميت جديد. ولذلك فإن التفاعل المنسق بين "ساعة التجزئة" و "الجبهة الموجية للنضج" أمر أساسي لتوليد وحدات سلائف الفقرات هذه لأن الاضطرابات في هذه العمليات المورفوجينية الرئيسية يمكن أن تؤدي إلى الفتك الجنيني أو إلى تكوين تشوهات خلقية (مثل الجنف) 13،14،15.
على الرغم من التطورات الحديثة الكبيرة في تقنيات التصوير وطرق وبرامج تحليل الصور الحيوية ، فإن معظم دراسات الاستطالة المحورية وتكوين السميتوجينيا لا تزال تعتمد على بيانات الصور ثنائية الأبعاد المفردة / المعزولة (على سبيل المثال ، الأقسام) ، والتي لا تسمح بتصور كامل متعدد الأبعاد للأنسجة ويعقد التمييز الواضح بين التشوهات المرضية (أي بسبب الطفرات) مقابل التباين المورفولوجي الطبيعي الذي يحدث أثناء التطور الجنيني16 . وقد كشف التصوير في 3D بالفعل عن حركات مورفوجينية جديدة ، لم يتم تحديدها سابقا من خلال الطرق القياسية ثنائية الأبعاد17،18،19،20 ، مما يسلط الضوء على قوة التصوير في toto لفهم آليات تكوين الفقاريات والامتداد المحوري.
يعد الفحص المجهري 3D و 4D لأجنة الفئران ، وخاصة التصوير الحي ، تحديا تقنيا ويتطلب خطوات حاسمة أثناء إعداد العينات والحصول على الصور والمعالجة المسبقة للبيانات من أجل السماح بتحليل مكاني وزماني دقيق وذي مغزى. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للتصوير الحي وتلطيخ التألق المناعي الكامل لأجنة الفئران ، والذي يمكن استخدامه لدراسة كل من NMPs وخلايا الجلد المتوسط أثناء التمديد المحوري والتقسيم. بالإضافة إلى ذلك ، نصف أيضا بروتوكولا للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري (OPT) للأجنة والأجنة الأكبر سنا ، والذي يسمح ب 3D في تصور toto وتحديد كمية التشوهات المرضية التي يمكن أن تنتج عن مشاكل أثناء تكوين السوميتوجينيسيس (على سبيل المثال ، اندماج العظام والجنف) 13،21،22. أخيرا ، نوضح قوة إعادة بناء التصوير 3D في دراسة وتدريس تجزئة الفقاريات والاستطالة المحورية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

Somitogenesis هو السمة المميزة للتطور الجنيني الفقاري. لسنوات ، كان الباحثون يدرسون هذه العملية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية باستخدام مجموعة واسعة من التقنيات التي تشمل النهج خارج الجسم الحي وفي المختبر. ومع ذلك ، لا تزال معظم الدراسات تعتمد على تحليل بيانات التصوير ثنائية الأبعاد (2D) ، مما يحد من التقييم السليم لعملية تنموية مثل الامتداد المحوري وتكوين السوميتوجينيسيس التي تنطوي على تفاعلات ديناميكية للغاية في مساحة 3D معقدة. هنا نصف التقنيات التي تسمح للفأر بالحصول على التصوير الحي ، ومعالجة مجموعة البيانات ، والتصور والتحليل في 3D و 4D لدراسة الخلايا (على سبيل المثال ، أسلاف الجلد المتوسط العصبي) المشاركة في هذه العمليات التنموية. كما نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري والمجهر المناعي الكامل في أجنة الفئران (من إعداد العينات إلى الحصول على الصور) ونظهر خط أنابيب قمنا بتطويره لمعالجة وتصور بيانات صورة 3D. نحن نوسع نطاق استخدام بعض هذه التقنيات ونسلط الضوء على ميزات محددة لمختلف البرامج المتاحة (على سبيل المثال ، فيجي / ImageJ ، Drishti ، Amira و Imaris) التي يمكن استخدامها لتحسين فهمنا الحالي للامتداد المحوري وتشكيل somite (على سبيل المثال ، إعادة بناء 3D). بشكل عام ، تؤكد التقنيات الموصوفة هنا على أهمية تصور وتحليل البيانات ثلاثية الأبعاد في البيولوجيا التنموية ، وقد تساعد الباحثين الآخرين على معالجة بيانات الصور ثلاثية الأبعاد و 4D بشكل أفضل في سياق الامتداد المحوري للفقاريات وتجزئتها. وأخيرا، يستخدم العمل أيضا أدوات جديدة لتسهيل تعليم التطور الجنيني للفقاريات.

تم الحصول على النتائج التمثيلية الموضحة في هذه الورقة لكل من التصوير الحي والتألق المناعي ، باستخدام نظام ثنائي الفوتون ، مع هدف مائي 20 × 1.0 NA ، وليزر الإثارة مضبوط إلى 960 نانومتر ، وأجهزة الكشف الضوئي GaAsP (كما هو موضح في Dias et al. (2020)43. تم إجراء التصوير المقطعي بالإسقاط البصري باست...

Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

هنا ، نصف الأدوات والأساليب الحسابية التي تسمح بتصور وتحليل بيانات الصور ثلاثية ورباعية الأبعاد لأجنة الفئران في سياق الاستطالة المحورية والتقسيم ، والتي تم الحصول عليها عن طريق التصوير المقطعي بالإسقاط البصري ، وعن طريق التصوير الحي وتلطيخ التألق المناعي الكامل باستخدام المجهر متعدد الفوتونات.

نهج التصور والتحليل ثلاثي ورباعي الأبعاد لدراسة الاستطالة المحورية الفقارية وتجزئتها

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

لا تزال مراحل التكوين العضوي في أجنة الفئران غير مدروسة بشكل جيد جزئيا بسبب صعوبة تصور الهياكل المعقدة للجنين. يصف هذا البروتوكول التقنيات التي تسمح بتصور وتحليل أجنة الفئران 3D و 4D أثناء التمديد المحوري والتقسيم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بدراسة وإظهار الهياكل المعقدة لجنين الفأر ككائنات ديناميكية 3D.يحتوي هذا البروتوكول على تقنيات يمكن استخدامها في دراسة التشوهات الخلقية التي تؤثر على الفقرة والحبل الشوكي للثدييات ، مثل الجنف. يمكن أيضا استخدام هذه التقنيات مع أنظمة النماذج في المختبر ، مما يسمح بدراسة التطور الجنيني البشري. لإعداد أجنة الفئران بين اليوم الجنيني 8.25 واليوم الجنيني 10.5 للتصوير الحي ، تشريح الأجنة في وسط M2 المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.قم بإزالة كيس صفار البيض بلطف باستخدام ملقط نظيف واغسل الجنين مرة واحدة بوسط M2 طازج لإزالة الدم والحطام الناتج أثناء التشريح. أثناء إجراء التصوير الحي ، احتضن الأجنة في وسط DMEM منخفض الجلوكوز مع استكمال 10٪ HyClone المحدد FBS ، واثنين من الملليمولات L-glutamine ، و 1٪ البنسلين الستربتومايسين في غرفة ساخنة 37 درجة مئوية و 65٪ من الأكسجين مع بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪. لإعداد أجنة الفئران في مرحلة مماثلة للفحص المجهري المناعي ، بدلا من استخدام M2 الساخن ، تشريح الأجنة في PBS الباردة وإصلاحها في 4 ٪ paraformaldehyde.بعد تنفيذ بروتوكول تلطيخ التألق المناعي الكامل كما هو موضح في مخطوطة النص ، يمكن تحقيق إزالة الأنسجة باستخدام RapiClear. أولا ، ضع الأجنة في وسط شريحة زجاجية مقعرة للاكتئاب 75 × 25 ملم ، وقم بإزالة كل PBST في شريحة الاكتئاب المجهري وأضف 200 ميكرولتر من محلول المقاصة ، ثم قم بتغطية إعداد الشريحة بصندوق. بعد 10 دقائق محمية من الضوء ، عندما تبدأ الأجنة في أن تصبح شفافة ، استبدل محلول المقاصة وانتظر 20 دقيقة إضافية.أعلى الجنين مع غطاء يبدأ من جانب واحد ويتحرك بلطف نحو الجانب الآخر. العينة جاهزة الآن للتصوير. للتطهير باستخدام ميثيل ساليسيلات أو BAB ، تأكد من أن الأجنة مجففة تماما في 100٪ من الميثانول ثم ابدأ سلسلة BABB والميثانول مع زيادات متتالية بنسبة 20٪ في التركيز وحضانة لمدة 20 دقيقة لكل خطوة.عندما يصل حل BABB إلى 100٪ ، قم بإجراء تغييرين إضافيين للحصول على حل جديد. قم بإعداد شريحة زجاجية بغطاء 20 × 60 ملم 1.5 لتركيب الأجنة لتجنب ضغط العينة. أضف فواصل مصنوعة من غسالات معدنية رقيقة.انقل الأجنة التي تم تطهيرها إلى شرائح المجهر باستخدام مسواك أو طرف قطني ناعم أو ماصة باستور. ثم أضف قطرة من وسط التركيب ، وقم بتغطيتها بزجاج غطاء آخر مماثل وختم بالبارافين المذاب لتحقيق استقرار أفضل في التحضير لتجنب الفقاعات. ضع الغطاء على جانب واحد ثم حركه تدريجيا وبلطف جانبيا ، مع إضافة المزيد من الوسط إذا لزم الأمر.العينة جاهزة الآن ليتم تصويرها في المجهر. استخدم فيجي/ImageJ لإعادة وضع الجنين في وضع موحد للمحور الأمامي الخلفي والظهري البطني بعد التصوير. قم بتقليل حجم مجموعة البيانات في صورة فيجي، ثم قم بقياس وإدراج قيم المقياس X و Y و Z اللازمة لتقليل مجموعة البيانات إلى أقل من 200 ميغابايت.تأكد من تحديد خيار إنشاء نافذة جديدة. ثم انتقل إلى المكونات الإضافية وافتح 3D Viewer. داخل نافذة 3D Viewer ، انقر فوق الجنين لتحديده ، مما يتسبب في ظهور مربع 3D أحمر.عند استخدام هذا الوضع، يمكنك التحكم في دوران مجموعة البيانات باستخدام الماوس. بعد ضمان الموضع المثالي للجنين ، حدد تحرير الصورة وتحويلها وتصدير الصورة المحولة في نافذة 3D Viewer. افحص المستويات المتعامدة المختلفة، ثم انتقل إلى الصورة، ثم قم بتكديس طرق العرض المتعامدة وتحديدها.عندما يتم وضع الجنين بشكل صحيح ، حدد قائمة نافذة 3D Viewer ، ثم قم بتحرير مصفوفة التحويل وتحويلها وحفظها إلى ملف نصي بامتداد حصيرة. افتح الملف النصي باستخدام فيجي / ImageJ ، وقم بإزالة السطرين الأولين وإعادة حفظه. يؤدي ذلك إلى إنشاء ملف مصفوفة تحويل متوافق مع المكون الإضافي TransformJ.قم بالتبديل إلى مجموعة بيانات الدقة الكاملة وقم بتنفيذ المكونات الإضافية للتشغيل TransformJ و TransformJ affine. في النافذة الجديدة، استعرض للبحث عن ملف المصفوفة الذي تم حفظه مسبقا، وحدد الاستيفاء المكعب B-spline وأعد تشكيله بشكل متساوي الاستواء، ثم انقر فوق موافق. بعد إعادة وضع الجنين بشكل صحيح ، قم بتقليم معظم المساحة الفارغة التي تم إنشاؤها. لتنفيذ صورة إسقاط Z كاملة ، انقر فوق المكدسات ، Z Project ، واختر أقصى كثافة.ثم ارسم الحد الأدنى لعائد الاستثمار الذي يحتوي على الجنين بأكمله في X و Y.Switch إلى نوافذ صورة مجموعة البيانات الأصلية بالنقر فوق التحرير والتحديد واستعادة التحديد والاقتصاص عن طريق تحديد الصورة. قم بقص الشرائح في البداية والنهاية التي لا تتقاطع مع أنسجة الجنين عن طريق تحديد مكدسات الصور وفتحها ، والنقر فوق الأدوات ، وتحديد مزيل الشرائح ، وتحديد الشريحة الأولى والأخيرة المراد إزالتها ، مع التأكد من تغيير الزيادة إلى واحدة. إذا رغبت في ذلك ، قم بإجراء مزيد من التحليل وإعادة بناء 3D باستخدام التعليمات الموجودة في مخطوطة النص.لإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد للأجنة الأكثر تطورا ، قم بتشريح الأجنة الجنينية 18.5 جنينا في PBS الباردة ، وإزالة جميع الأغشية الجنينية الإضافية ، ثم غسل الأجنة عدة مرات في PBS جديدة لإزالة الدم والحطام الناتج أثناء إجراء التشريح. إصلاح الأجنة في 4٪ PFA المصنوعة في PBS عند أربع درجات مئوية لمدة خمسة إلى سبعة أيام. بعد غسل الجنين عدة مرات في PBS ، جفف الأجنة عن طريق احتضان 10٪ 10 زيادات متتالية من محاليل الميثانول حتى يتم الوصول إلى 100٪ من الميثانول.قم بإجراء كل حضانة لمدة 25 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن الأجنة بشكل منفصل على شاكر أولا لمدة يوم واحد في 5٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول ثم في 10٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول لمدة تصل إلى ثلاثة أيام حتى تفقد الأجنة كل التصبغ الطبيعي. قم بإعادة ترطيب الأجنة تدريجيا في سلسلة عكسية من الميثانول في ماء منزوع المعادن مع كل حضانة لمدة 20 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل الأجنة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل غسل في ماء منزوع المعادن.لتضمين الأجنة في كتل الأغاروز 1٪ ، املأ أنبوبا بلاستيكيا أو حقنة سعة 50 ملليلتر بالأغاروز المذاب ، ثم ضع الجنين في الأغاروز في وضع رأسي وحافظ على هذا الوضع بالملقط أثناء تصلب الأغاروس. ضع القالب مع الكتلة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يهتز الأغاروز بالكامل ، ثم أزل كتلة الأغاروز مع الجنين من القالب وضعها في وعاء به ماء محبط. قم بإجراء جفاف الجنين تدريجيا مع زيادة بنسبة 10٪ في تركيز الميثانول المخفف في الماء منزوع المعادن أو PBS ، مع الحفاظ على العينة في تركيز الميثانول لمدة 45 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة على شاكر حتى يتم الوصول إلى 100٪ من الميثانول.قم بمسح الأجنة عن طريق تحريكها من خلال محلول BABB المتسلسل والميثانول لمدة 2.5 ساعة في كل تركيز مع زيادة بنسبة 25٪ في تركيز BABB حتى الوصول إلى 100٪ BABB. استبدل محلول BABB بمحلول جديد كل يوم حتى يصبح الجنين شفافا تماما. قد تستغرق هذه العملية من ثلاثة إلى خمسة أيام.استخدم الغراء لتوصيل كتلة الأغاروز التي تم مسحها بالمحور الحركي للماسح الضوئي OPT ، ثم اضبط البصريات للحصول على صورة للجنين بأكمله والمضي قدما في الحصول على مجموعة بيانات إسقاط كاملة. تتيح تقنية التصوير الحي 4D التحليل الديناميكي لتعبير مراسل LuVeLu والأجنة الجنينية 8.5 Snai1 المشروطة. جنبا إلى جنب مع إشارة LuVeLu الطبيعية على الأديم المتوسط presomitic ، تعرض الأجنة الضربة القاضية المشروطة Snai1 تعبير LuVeLu في الانتفاخ خارج الرحم الذي ينشأ من الخط البدائي.تسمح اختبارات التألق المناعي الكامل بالكشف عن NMPs المحتملة والمنظمين الرئيسيين لتمايز الأديم المتوسط. تسلط الأسهم البيضاء والصفراء الضوء على الاختلافات في الأجنة المتحولة والبرية. 3D تقديم كامل جبل المناعية تمكن من فهم أفضل للأنسجة أو الهيكل في الدراسة.في هذه الحالة ، تم التحقيق في موقع NMPs المحتملة في برعم الذيل. إعادة بناء الأنسجة 3D مهمة أيضا لفهم وتوصيف العيوب المورفولوجية في أجنة الفئران. يمكن أيضا بناء التصور التفاعلي لإعادة الإعمار 3D بتنسيقات سهلة الاستخدام.على سبيل المثال، في ملف PDF. يمكن استخدام هذه الهياكل الذيلية الجنينية ثلاثية الأبعاد لتوضيح قوة النماذج ثلاثية الأبعاد لجمهور أكثر عمومية وللمساعدة في الدراسة في تعليم الاستطالة المحورية الفقارية وتقسيمها. أخيرا ، من الممكن استخدام 3D في تصور toto لأجنة الفئران الأكثر تطورا باستخدام تقنية الفحص المجهري OTP.يتم عرض عروض متحركة هنا ، مع تسليط الضوء على شرائح رئيسية من أجنة اليوم الجنيني 18.5. أهم شيء يجب تذكره هو أن النتيجة يجب أن تظل تمثيلا أمينا لما لوحظ في الجنين. يمكن للباحثين استخدام هذه الأساليب لتجاوز تقديم الصور الثابتة فقط ، ولكن أيضا تضمين مقاطع الفيديو وإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد وحتى نماذج 3D التفاعلية لبياناتهم.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

الحركية قياس وفي الوقت الحقيقي التصور من إعادة برمجة الجسدية

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

تحليل الناجم عن حمض الريتينويك العصبية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الهيئات مضغي اثنين وثلاثة الأبعاد

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

التقديم ثلاثي الأبعاد وتحليل إيمونولابيليد، أوضح البشري شبكات الأوعية الدموية فيلوس المشيمية

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...