Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Vi vil gerne takke Olivier Pourquié og Alexander Aulehla for LuVeLu-reporterstammen, SunJin-laboratoriet for RapiClear-testprøven, Hugo Pereira for hjælpen ved hjælp af BigStitcher, Nuno Granjeiro for at hjælpe med at oprette det levende billeddannelsesapparat, IGC-dyreanlægget og tidligere og nuværende medlemmer af Mallo-laboratoriet for nyttige kommentarer og støtte i løbet af dette arbejde.
Vi takker for den tekniske støtte fra IGC's Advanced Imaging Facility, som støttes af portugisisk finansiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 og ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, medfinansieret af Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), under Portugal 2020-partnerskabsaftalen, gennem Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (FEDER) og Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Arbejdet beskrevet i dette manuskript blev støttet af tilskud LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) og SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) til M.M., forskningsinfrastrukturen Congento, projekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170 og ph.d.-stipendiet PD/BD/128426/2017 til A.D.

Dyreforsøg fulgte den portugisiske (Portaria 1005/92) og den europæiske (direktiv 2010/63/EU) lovgivning om bolig, opdræt og velfærd. Projektet blev gennemgået og godkendt af den etiske komité for »Instituto Gulbenkian de Ciência« og af den portugisiske nationale enhed, »Direcção Geral de Alimentação e Veterinária« (licensreference: 014308).
1. Prøveforberedelse til 3D- og 4D-billeddannelse
BEMÆRK: Her giver vi en detaljeret beskrivelse af, hvordan m...

Aksial forlængelse og segmentering er to af de mest komplekse og dynamiske processer, der forekommer under hvirveldyrs embryonale udvikling. Brugen af 3D- og 4D-billeddannelse med enkeltcellesporing er i nogen tid blevet anvendt til at studere disse processer i både zebrafisk og kyllingeembryoner, for hvilke tilgængelighed og dyrkningsbetingelser letter kompleks billeddannelse 19,44,45,46,47,48,49...

Vertebrat kropsaksedannelse er en meget kompleks og dynamisk proces, der forekommer under embryonal udvikling. I slutningen af gastrulation [i musen, omkring embryonal dag (E) 8.0] bliver en gruppe epiblast-stamceller kendt som neuromesodermale forfædre (NMP'er) en vigtig drivkraft for aksial forlængelse i en hoved til hale-sekvens, der genererer neuralrøret og paraxialt mesodermalt væv under nakke-, bagagerums- og haledannelse 1,2,3,4 . Interessant nok synes den position, som disse NMP'er indtager i den kaudale epiblast, at spille en nøglerolle i beslutningen om at differentiere til mesoderm eller neuroektoderm5. Selvom vi i øjeblikket mangler et præcist molekylært fingeraftryk for NMP'er, menes disse celler generelt at co-udtrykke T (Brachyury) og Sox2 5,6. De nøjagtige mekanismer, der regulerer NMP-skæbnebeslutninger (dvs. om de tager neurale eller mesodermale ruter) begynder kun at blive præcist defineret. Tbx6-ekspression i den primitive streak-region er en tidlig markør for NMP-skæbnebeslutning, da dette gen er involveret i induktion og specifikation af mesoderm 6,7. Interessant nok synes tidlige mesodermceller at udtrykke høje niveauer af Epha18, og Wnt / β-catenin-signalering samt Msgn1 viste sig også at spille vigtige roller i paraxial mesodermdifferentiering og somitdannelse 9,10. En komplet rumlig-tidsmæssig analyse af NMP'er på et enkeltcelleniveau vil helt sikkert være medvirkende til fuldt ud at forstå de molekylære mekanismer, der styrer mesodermspecifikationen.
Dannelsen af somitter (hvirvler prækursorer) er et centralt træk ved hvirveldyr. Under aksial forlængelse bliver den paraksiale mesoderm segmenteret i en række bilaterale gentagne enheder kendt som somitter. Antallet af somitter og den tid, der kræves til dannelsen af nye segmenter, varierer mellemarterne 11,12. Somitogenese involverer periodiske signalsvingninger (kendt som "segmenteringsuret"), der kan observeres ved den cykliske ekspression af flere gener af Notch-, Wnt- og Fgf-signalvejene i den præsomitiske mesoderm (f.eks. Lfng)11,12. Den nuværende model for somitogenese postulerer også eksistensen af en "modningsbølgefront", en række komplekse signalgradienter, der involverer Fgf-, Wnt- og retinsyresignalering, der definerer positionen af den bageste grænse for hver ny somit. En koordineret interaktion mellem "segmenteringsuret" og "modningsbølgefronten" er derfor grundlæggende for dannelsen af disse hvirvelforløbermoduler, da forstyrrelser i disse vigtige morfogenetiske processer kan resultere i embryonal dødelighed eller i dannelsen af medfødte misdannelser (f.eks. Skoliose)13,14,15.
På trods af betydelige nylige fremskridt inden for billeddannelsesteknikker, bioimageanalysemetoder og software er de fleste undersøgelser af aksial forlængelse og somitogenese stadig afhængige af enkelt-/isolerede todimensionelle billeddata (f.eks. sektioner), som ikke tillader en fuld flerdimensionel vævsvisualisering og komplicerer en klar differentiering mellem patologiske misdannelser (dvs. på grund af mutationer) ifølge normal morfologisk variation, der forekommer under embryonal udvikling16 . Billeddannelse i 3D har allerede afdækket nye morfogenetiske bevægelser, der tidligere ikke blev identificeret ved standard 2D-metoder 17,18,19,20, hvilket fremhæver kraften i in toto-billeddannelse til at forstå mekanismerne for hvirveldyr somitogenese og aksial forlængelse.
3D- og 4D-mikroskopi af museembryoner, især levende billeddannelse, er teknisk udfordrende og kræver kritiske trin under prøveforberedelse, billedindsamling og databehandling for at muliggøre nøjagtig og meningsfuld rumlig-tidsmæssig analyse. Her beskriver vi en detaljeret protokol for levende billeddannelse og helmonteret immunofluorescensfarvning af museembryoner, der kan bruges til at studere både NMP'er og mesodermale celler under aksial forlængelse og segmentering. Derudover beskriver vi også en protokol til optisk projektionstomografi (OPT) af ældre embryoner og fostre, der tillader 3D in toto visualisering og kvantificering af patologiske abnormiteter, der kan skyldes problemer under somitogenese (f.eks. Knoglefusion og skoliose)13,21,22. Endelig illustrerer vi kraften i 3D-billeddannelsesrekonstruktioner i studiet og undervisningen i hvirveldyrsegmentering og aksial forlængelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

Somitogenese er et kendetegn for hvirveldyrs embryonale udvikling. I årevis har forskere studeret denne proces i en række organismer ved hjælp af en bred vifte af teknikker, der omfatter ex vivo- og in vitro-tilgange. Imidlertid er de fleste undersøgelser stadig afhængige af analysen af todimensionelle (2D) billeddannelsesdata, hvilket begrænser korrekt evaluering af en udviklingsproces som aksial forlængelse og somitogenese, der involverer meget dynamiske interaktioner i et komplekst 3D-rum. Her beskriver vi teknikker, der gør det muligt for musens levende billeddannelsesindsamling, behandling af datasæt, visualisering og analyse i 3D og 4D at studere de celler (f.eks. Neuromesodermale forfædre), der er involveret i disse udviklingsprocesser. Vi leverer også en trinvis protokol til optisk projektionstomografi og helmonteret immunfluorescensmikroskopi i museembryoner (fra prøveforberedelse til billedoptagelse) og viser en pipeline, som vi udviklede til at behandle og visualisere 3D-billeddata. Vi udvider brugen af nogle af disse teknikker og fremhæver specifikke funktioner i forskellige tilgængelige software (f.eks. Fiji / ImageJ, Drishti, Amira og Imaris), der kan bruges til at forbedre vores nuværende forståelse af aksial forlængelse og somitdannelse (f.eks. 3D-rekonstruktioner). Alt i alt understreger de her beskrevne teknikker vigtigheden af 3D-datavisualisering og analyse i udviklingsbiologi og kan hjælpe andre forskere til bedre at adressere 3D- og 4D-billeddata i forbindelse med hvirveldyrs aksiale udvidelse og segmentering. Endelig anvender værket også nye værktøjer til at lette undervisningen i hvirveldyrs embryonale udvikling.

De repræsentative resultater, der er vist i dette papir for både levende og immunofluorescensbilleddannelse, blev opnået ved hjælp af et to-fotonsystem med et 20 × 1.0 NA-vandmål, excitationslaseren indstillet til 960 nm og GaAsP-fotodetektorer (som beskrevet i Dias et al. (2020) 43. Optisk projektionstomografi blev udført ved hjælp af en specialbygget OPenT-scanner (som beskrevet i Gualda et al. (2013) 28.
Live billeddannelse (4D...

Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Her beskriver vi beregningsværktøjer og metoder, der muliggør visualisering og analyse af tre- og firedimensionelle billeddata for museembryoner i forbindelse med aksial forlængelse og segmentering, opnået ved in toto optisk projektionstomografi og ved levende billeddannelse og helmonteret immunofluorescensfarvning ved hjælp af multifotonmikroskopi.

Tre- og firedimensionelle visualiserings- og analysemetoder til undersøgelse af hvirveldyrs aksiale forlængelse og segmentering

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Organogenesestadierne i museembryonerne forbliver dårligt undersøgt delvist på grund af den vanskelige visualisering af embryokompleksstrukturerne. Denne protokol beskriver teknikker, der tillader 3D- og 4D-visualisering og analyse af museembryoner under aksial forlængelse og segmentering. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver forskere mulighed for at studere og vise de komplekse strukturer af museembryoet som 3D-dynamiske objekter.Denne protokol indeholder teknikker, der kan bruges i undersøgelsen af medfødte misdannelser, der påvirker hvirvlen og rygmarven hos pattedyr, såsom skoliose. Disse teknikker kan også anvendes med in vitro-modelsystemer, hvilket gør det muligt at studere menneskelig embryonal udvikling. For at forberede museembryoner mellem embryonal dag 8.25 og embryonal dag 10.5 til levende billeddannelse skal embryonerne dissekeres i forvarmet M2-medium ved 37 grader Celsius.Fjern forsigtigt æggeblommesækken ved hjælp af rene tang og vask embryoet en gang med frisk M2-medium for at fjerne blod og snavs, der produceres under dissektion. Under den levende billeddannelsesprocedure inkuberer embryoner i DMEM-medium med lavt glucose suppleret med 10% HyClone defineret FBS, to millimolære L-glutamin og 1% penicillin streptomycin i et 37 grader Celsius opvarmet kammer og et 65% ilt med 5% kuldioxidmiljø. For at forberede lignende stadiemusembryoner til immunofluorescensmikroskopi, i stedet for at bruge opvarmet M2, dissekere embryonerne i kold PBS og fiksere i 4% paraformaldehyd.Efter at have udført hele monteringsimmunfluorescensfarvningsprotokollen som beskrevet i tekstmanuskriptet, kan vævsclearance opnås ved hjælp af RapiClear. Placer først embryonerne i midten af et 75 ved 25 millimeter depression konkavt glas dias, fjern al PBST i mikroskop depression dias og tilsæt 200 mikroliter clearing opløsning, og dæk derefter diaspræparatet med en kasse. Efter 10 minutter beskyttet mod lyset, når embryoner begynder at blive gennemsigtige, skal du udskifte clearingopløsningen og vente yderligere 20 minutter.Top embryoet med et dækslip, der starter fra den ene side og forsigtigt bevæger sig mod den anden. Prøven er nu klar til billeddannelse. Ved rydning ved hjælp af methylsalicylat eller BABB skal det sikres, at embryonerne er fuldstændigt dehydreret i 100% methanol, og start derefter serien af BABB og methanol med 20% successive stigninger i koncentrationen og en 20-minutters inkubation for hvert trin.Når BABB-opløsningen når 100%, skal du foretage yderligere to ændringer for en frisk løsning. Forbered en 20 ved 60 millimeter 1,5 dækglasrutschebane for at montere embryonerne for at undgå at komprimere prøven. Tilføj afstands afstands afstandsarealer lavet af tynde metalskiver.Overfør de ryddede embryoner til mikroskopets dias ved hjælp af et tandstikker, en fin bomuldsspids eller en Pasteur-pipette. Tilsæt derefter en dråbe monteringsmedium, dæk med et andet lignende dækglas og forsegl med smeltet paraffin for bedre at stabilisere præparatet for at undgå bobler. Placer dækslaget på den ene side, og skub det derefter gradvist og forsigtigt sidelæns, og tilsæt om nødvendigt mere medium.Prøven er nu klar til at blive afbildet i mikroskopet. Brug Fiji / ImageJ til at omplacere embryoet til en standardiseret forreste-bageste og dorsal-ventral akseposition efter billeddannelse. Reducer datasætstørrelsen i Fijis billede, og skaler derefter de X-, Y- og Z-skalaværdier, der er nødvendige for at reducere datasættet til mindre end 200 megabyte.Sørg for, at indstillingen Opret nyt vindue er markeret. Gå derefter til plugins og åbn 3D Viewer. Inde i 3D Viewer-vinduet skal du klikke på embryoet for at vælge det, hvilket får en rød 3D-boks til at vises.Når du bruger denne tilstand, skal du styre rotationen af datasættet med en mus. Når du har sikret embryoets perfekte position, skal du vælge rediger, transformere billedet og eksportere transformeret billede i 3D-fremviservinduet. Undersøg de forskellige ortogonale planer, gå derefter til billedet, stak derefter og vælg ortogonale visninger.Når embryoet er korrekt placeret, skal du vælge vinduesmenuen 3D-fremviser og derefter redigere, transformere og gemme transformationsmatrix til en tekstfil med en måtteudvidelse. Åbn tekstfilen ved hjælp af Fiji / ImageJ, fjern de to første linjer og gem igen. Dette skaber en transformationsmatrixfil, der er kompatibel med TransformJ-pluginet.Skift til datasættet i fuld opløsning, og udfør handlingsplugins TransformJ og TransformJ affine. I det nye vindue skal du gennemse for at søge efter matrixfilen, der tidligere er gemt, vælge den kubiske B-spline-interpolation og genprøve isotropisk og derefter klikke på OK. Efter korrekt omplacering af embryoet skal du trimme det meste af det skabte tomme rum. For at udføre et fuldt Z-projektionsbillede skal du klikke på stakke, Z Project og vælge maksimal intensitet.Tegn derefter det mindste investeringsafkast, der indeholder hele embryoet i X og Y.Skift til de originale datasætbilledvinduer ved at klikke på rediger, vælg, gendan markering og beskæring ved at vælge billede. Trim skiverne i begyndelsen og slutningen, der ikke skærer embryovæv ved at vælge billed- og åbningsstakke, klik på værktøjer, vælg skivefjerneren, og angiv den første og sidste skive, der skal fjernes, og sørg for at ændre stigningen til en. Hvis det ønskes, skal du udføre yderligere analyse og 3D-rekonstruktioner ved hjælp af instruktionerne i tekstmanuskriptet.For at udføre 3D-analyse af mere udviklede embryoner skal du dissekere embryonale dag 18,5 fostre i kold PBS, fjerne alle ekstra embryonale membraner og derefter vaske fostrene flere gange i frisk PBS for at fjerne blod og snavs produceret under dissektionsproceduren. Fix fostre i 4% PFA lavet i PBS ved fire grader Celsius i fem til syv dage. Efter vask af embryoet flere gange i PBS dehydreres fostrene ved at inkubere i 10%10 successive stigninger af methanolopløsninger, indtil 100% methanol er nået.Udfør hver inkubation i 25 minutter på en ryster ved stuetemperatur. Dernæst inkuberes fostre separat på en ryster først i en dag i 5% hydrogenperoxid i methanol og derefter i 10% hydrogenperoxid i methanol i op til tre dage, indtil embryonerne mister al naturlig pigmentering. Rehydrer embryonerne gradvist i en omvendt methanolserie i demineraliseret vand med hver inkubation i 20 minutter på en ryster ved stuetemperatur, og vask derefter embryonerne tre gange i 30 minutter pr. vask i demineraliseret vand.For at indlejre fostre i 1% agaroseblokke skal du fylde et 50 ml plastrør eller sprøjte med smeltet agarose, derefter placere fosteret i agarose i lodret stilling og opretholde denne position med tang under størkning af agarose. Placer formen med blokken ved fire grader Celsius i 30 minutter, så agarose kan gelificere fuldt ud, fjern derefter agaroseblokken med fosteret fra formen og læg den i en beholder med demoraliseret vand. Udfør fostrets dehydrering gradvist med 10% stigninger i methanolkoncentrationen fortyndet i demineraliseret vand eller PBS, og hold prøven i methanolkoncentration i mindst 45 minutter ved stuetemperatur på en ryster, indtil 100% methanol er nået.Ryd fostrene ved at flytte dem gennem en serie BABB-opløsning og methanol i 2,5 timer i hver koncentration med 25% stigninger i BABB-koncentrationen, indtil de når 100% BABB. Udskift BABB-opløsningen med en frisk hver dag, indtil fosteret er helt gennemsigtigt. Denne proces kan tage tre til fem dage.Brug lim til at fastgøre den ryddede agaroseblok til OPT-scannerens motorakse, juster derefter optikken for at få et billede af hele fosteret og fortsæt med at erhverve et komplet projektionsdatasæt. 4D live imaging teknikken muliggør dynamisk analyse af LuVeLu reporter udtryk og embryonale dag 8.5 Snai1-betingede knockout embryoner. Sammen med det normale LuVeLu-signal på den præsomitiske mesoderm viser Snai1-betingede knockout-embryoner LuVeLu-udtryk i den ektopiske bule, der stammer fra den primitive stribe.Hele monterede immunofluorescensassays muliggør påvisning af potentielle NMP'er og nøgleregulatorer for mesodermdifferentiering. Hvide og gule pile fremhæver forskelle i embryoner af mutant og vild type. 3D-gengivelse af hele monteringsimmunstainings muliggør en bedre forståelse af vævet eller strukturen i undersøgelsen.I dette tilfælde blev placeringen af potentielle NMP'er i haleknoppen undersøgt. 3D-vævsrekonstruktioner er også vigtige for at forstå og karakterisere morfologiske defekter i museembryoner. Interaktiv visualisering af 3D-rekonstruktion kan også bygges i brugervenlige formater.For eksempel i en PDF-fil. Disse 3D-embryo kaudale strukturer kan bruges til at illustrere kraften i 3D-modeller til et mere generelt publikum og til at hjælpe i undersøgelsen med at undervise i en hvirveldyrs aksiale forlængelse og segmentering. Endelig er 3D in toto visualisering af mere udviklede museembryoner mulig ved hjælp af OTP-mikroskopiteknikken.Animerede gengivelser vises her, der fremhæver nøgleskiver af embryonale dag 18,5 fostre. Det vigtigste at huske er, at resultatet skal forblive en trofast repræsentation af, hvad der observeres i embryoet. Forskere kan bruge disse metoder til at gå ud over at præsentere bare statisk til billederne, men også inkludere videoer, tredimensionelle rekonstruktioner og endda interaktive 3D-modeller af deres data.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering af en human neural stamcelle Line på tredimensionelle kulturer, Analyse af MicroRNA og formodede målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Kultur Faryngeal Arches at studere hjerte og Muskel Progenitorer og deres niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering af Chondrocyt Intercalation og Directional spredning via Zebrabow Klonal Cell Analysis i Embryonale Meckel s Brusk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Måling og Real Time Visualisering af Somatisk Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse af retinoidsyre-induceret Neural Differentiation af muse embryonale stamceller i to og tre-dimensionelle embryoide legemer

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Brug af In Vivo og væv og celle eksplantat tilgange til at studere morfogenese og patogenese af embryonale og Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelationsmaalinger super-opløsning og elektronmikroskopi at løse Protein lokalisering i zebrafisk nethinden

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tre-dimensionelle gengivelse og analyse af Immunolabeled, klarere menneskelige placenta villøs vaskulære netværk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...