Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

We willen Olivier Pourquié en Alexander Aulehla bedanken voor de LuVeLu reporter-stam, het SunJin-laboratorium voor het RapiClear-testmonster, Hugo Pereira voor de hulp bij het gebruik van BigStitcher, Nuno Granjeiro voor het helpen opzetten van het live beeldvormingsapparaat, de IGC-dierenfaciliteit en voormalige en huidige leden van het Mallo-lab voor nuttige opmerkingen en ondersteuning tijdens dit werk.
We danken de technische ondersteuning van de Advanced Imaging Facility van de IGC, die wordt ondersteund door Portugese financiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 en ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, medegefinancierd door het regionaal operationeel programma van Lissabon (Lisboa 2020), in het kader van de partnerschapsovereenkomst van Portugal 2020, via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (FEDER) en Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Het werk beschreven in dit manuscript werd ondersteund door subsidies LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) en SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) aan M.M., de onderzoeksinfrastructuur Congento, project LISBOA-01-0145-FEDER-022170, en de PhD fellowship PD/BD/128426/2017 aan A.D.

Dierproeven volgden de Portugese (Portaria 1005/92) en Europese (Richtlijn 2010/63/EU) wetgevingen met betrekking tot huisvesting, houderij en welzijn. Het project werd beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het 'Instituto Gulbenkian de Ciência' en door de Portugese nationale entiteit 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (licentiereferentie: 014308).
1. Monstervoorbereiding voor 3D- en 4D-beeldvorming
OPMERKING: Hier geven we een gedet...

Axiale verlenging en segmentatie zijn twee van de meest complexe en dynamische processen die plaatsvinden tijdens de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. Het gebruik van 3D- en 4D-beeldvorming met single-cell tracking wordt al enige tijd toegepast om deze processen te bestuderen bij zowel zebravis- als kippenembryo's, waarvoor toegankelijkheid en kweekomstandigheden complexe beeldvormingvergemakkelijken 19,44,45,46,47,48,49 ...

De vorming van de lichaamsas van gewervelde dieren is een zeer complex en dynamisch proces dat plaatsvindt tijdens de embryonale ontwikkeling. Aan het einde van de gastrulatie [bij de muis, rond embryonale dag (E) 8.0], wordt een groep epiblastvoorlopercellen die bekend staan als neuromesodermale voorlopercellen (NMP's) een belangrijke aanjager van axiale uitbreiding in een kop-staartsequentie, die de neurale buis en paraxiale mesodermale weefsels genereert tijdens nek-, romp- en staartvorming 1,2,3,4 . Interessant is dat de positie die deze NMP's innemen in de caudale epiblast een sleutelrol lijkt te spelen in de beslissing om te differentiëren in mesoderm of neuro-emtoderm5. Hoewel we momenteel geen precieze moleculaire vingerafdruk voor NMP's hebben, wordt over het algemeen gedacht dat deze cellen T (Brachyury) en Sox2 5,6 co-expresseren. De exacte mechanismen die NMP-lotbeslissingen reguleren (d.w.z. of ze neurale of mesodermale routes nemen) beginnen pas nauwkeurig te worden gedefinieerd. Tbx6-expressie in het primitieve streepgebied is een vroege marker van NMP-lotbeslissing, omdat dit gen betrokken is bij de inductie en specificatie van mesoderm 6,7. Interessant is dat vroege mesodermcellen hoge niveaus van Epha18 lijken uit te drukken, en Wnt / β-catenine-signalering, evenals Msgn1 bleken ook een belangrijke rol te spelen bij paraxiale mesodermdifferentiatie en somietvorming 9,10. Een volledige ruimtelijk-temporele analyse van NMP's op eencellig niveau zal zeker instrumenteel zijn om de moleculaire mechanismen die mesodermspecificatie beheersen volledig te begrijpen.
De vorming van somieten (wervelvoorlopers) is een belangrijk kenmerk van gewervelde dieren. Tijdens axiale elongatie wordt het paraxiale mesoderm gesegmenteerd in een reeks bilaterale herhalende eenheden die bekend staan als somites. Het aantal somites en de tijd die nodig is voor de vorming van nieuwe segmenten varieert per soort11,12. Somitogenese omvat periodieke signaaloscillaties (bekend als de "segmentatieklok") die kunnen worden waargenomen door de cyclische expressie van verschillende genen van de Notch-, Wnt- en Fgf-signaalroutes in het presomitische mesoderm (bijv. Lfng)11,12. Het huidige model van somitogenese postuleert ook het bestaan van een "rijpingsgolffront", een reeks complexe signaalgradiënten met Fgf-, Wnt- en retinoïnezuursignalering die de positie van de achterste grens van elke nieuwe somiet bepalen. Een gecoördineerde interactie tussen de "segmentatieklok" en het "rijpingsgolffront" is daarom fundamenteel voor het genereren van deze wervelvoorlopermodules, aangezien verstoringen in deze belangrijke morfogenetische processen kunnen leiden tot embryonale letaliteit of tot de vorming van aangeboren misvormingen (bijv. Scoliose)13,14,15.
Ondanks aanzienlijke recente vooruitgang in beeldvormingstechnieken, biobeeldanalysemethoden en software, zijn de meeste studies van axiale elongatie en somitogenese nog steeds afhankelijk van enkelvoudige / geïsoleerde tweedimensionale beeldgegevens (bijv. Secties), die geen volledige multidimensionale weefselvisualisatie mogelijk maken en een duidelijk onderscheid tussen pathologische misvormingen (d.w.z. als gevolg van mutaties) versus normale morfologische variatie tijdens de embryonale ontwikkeling bemoeilijken16 . Beeldvorming in 3D heeft al nieuwe morfogenetische bewegingen blootgelegd, voorheen niet geïdentificeerd door standaard 2D-methoden 17,18,19,20, wat de kracht van in toto-beeldvorming benadrukt om de mechanismen van gewervelde somitogenese en axiale extensie te begrijpen.
3D- en 4D-microscopie van muizenembryo's, met name live beeldvorming, zijn technisch uitdagend en vereisen kritieke stappen tijdens monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensvoorverwerking om nauwkeurige en zinvolle spatio-temporele analyse mogelijk te maken. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring van muizenembryo's, dat kan worden gebruikt om zowel NMP's als mesodermale cellen te bestuderen tijdens axiale extensie en segmentatie. Daarnaast beschrijven we ook een protocol voor optische projectietomografie (OPT) van oudere embryo's en foetussen, dat 3D in toto visualisatie en kwantificering van pathologische afwijkingen mogelijk maakt die het gevolg kunnen zijn van problemen tijdens somitogenese (bijv. Botfusie en scoliose)13,21,22. Ten slotte illustreren we de kracht van 3D-beeldvormingsreconstructies in de studie en het onderwijs van gewervelde segmentatie en axiale elongatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

Somitogenese is een kenmerk van de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. Al jaren bestuderen onderzoekers dit proces in een verscheidenheid aan organismen met behulp van een breed scala aan technieken die ex vivo en in vitro benaderingen omvatten. De meeste studies vertrouwen echter nog steeds op de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvormingsgegevens, wat een goede evaluatie van een ontwikkelingsproces zoals axiale extensie en somitogenese met zeer dynamische interacties in een complexe 3D-ruimte beperkt. Hier beschrijven we technieken die muis live imaging acquisitie, datasetverwerking, visualisatie en analyse in 3D en 4D mogelijk maken om de cellen (bijv. Neuromesodermale voorlopers) te bestuderen die betrokken zijn bij deze ontwikkelingsprocessen. We bieden ook een stapsgewijs protocol voor optische projectietomografie en whole-mount immunofluorescentiemicroscopie in muizenembryo's (van monstervoorbereiding tot beeldacquisitie) en tonen een pijplijn die we hebben ontwikkeld om 3D-beeldgegevens te verwerken en te visualiseren. We breiden het gebruik van sommige van deze technieken uit en benadrukken specifieke kenmerken van verschillende beschikbare software (bijv. Fiji / ImageJ, Drishti, Amira en Imaris) die kunnen worden gebruikt om ons huidige begrip van axiale extensie en somietvorming (bijv. 3D-reconstructies) te verbeteren. Al met al benadrukken de hier beschreven technieken het belang van 3D-gegevensvisualisatie en -analyse in de ontwikkelingsbiologie en kunnen ze andere onderzoekers helpen om 3D- en 4D-beeldgegevens beter aan te pakken in de context van axiale uitbreiding en segmentatie van gewervelde dieren. Ten slotte maakt het werk ook gebruik van nieuwe hulpmiddelen om het onderwijzen van de embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren te vergemakkelijken.

De representatieve resultaten die in dit artikel worden getoond voor zowel de live als de immunofluorescentiebeeldvorming, werden verkregen met behulp van een twee-fotonensysteem, met een 20 × 1.0 NA waterobjectief, de excitatielaser afgestemd op 960 nm en GaAsP-fotodetectoren (zoals beschreven in Dias et al. (2020)43. Optische projectietomografie werd gedaan met behulp van een op maat gemaakte OPenT-scanner (zoals beschreven in Gualda et al. (2013)28.
<p class="jove_c...

Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

De organogenesestadia in de muizenembryo's blijven slecht bestudeerd, deels als gevolg van de moeilijke visualisatie van de embryocomplexstructuren. Dit protocol beschrijft technieken die 3D- en 4D-visualisatie en analyse van muizenembryo's mogelijk maken tijdens axiale extensie en segmentatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om de complexe structuren van het muizenembryo te bestuderen en te tonen als 3D-dynamische objecten.Dit protocol bevat technieken die kunnen worden gebruikt bij de studie van aangeboren misvormingen die de wervel en het ruggenmerg van zoogdieren aantasten, zoals scoliose. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt met in vitro modelsystemen, waardoor de studie van de menselijke embryonale ontwikkeling mogelijk is. Om muizenembryo's tussen embryonale dag 8.25 en embryonale dag 10.5 voor te bereiden op live beeldvorming, ontleedt u de embryo's in voorverwarmd M2-medium bij 37 graden Celsius.Verwijder de dooierzak voorzichtig met een schone tang en was het embryo eenmaal met vers M2-medium om bloed en vuil te verwijderen dat tijdens de dissectie is geproduceerd. Tijdens de live beeldvormingsprocedure incuberen embryo's in dmem-medium met lage glucose, aangevuld met 10% HyClone gedefinieerde FBS, twee millimolar L-glutamine en 1% penicilline streptomycine in een verwarmde kamer van 37 graden Celsius en een 65% zuurstof met 5% koolstofdioxideomgeving. Om muizenembryo's in een vergelijkbaar stadium voor te bereiden op immunofluorescentiemicroscopie, in plaats van verwarmd M2 te gebruiken, ontleedt u de embryo's in koude PBS en fixeert u in 4% paraformaldehyde.Na het uitvoeren van het hele mount immunofluorescentiekleuringsprotocol zoals beschreven in het tekstmanuscript, kan weefselklaring worden bereikt met RapiClear. Plaats eerst de embryo's in het midden van een 75 bij 25 millimeter depressie concave glasplaat, verwijder alle PBST in de microscoopdepressieglaas en voeg 200 microliter clearingoplossing toe en bedek vervolgens het diapreparaat met een doos. Na 10 minuten beschermd tegen het licht, wanneer embryo's transparant beginnen te worden, vervangt u de opruimoplossing en wacht u nog eens 20 minuten.Bedek het embryo met een deklip die van de ene kant begint en zachtjes naar de andere kant beweegt. Het monster is nu klaar voor beeldvorming. Voor het opruimen met methylsalicylaat of BABB, zorg ervoor dat de embryo's volledig zijn uitgedroogd in 100% methanol en start vervolgens de reeks BABB en methanol met 20% opeenvolgende concentratieverhogingen en een incubatie van 20 minuten voor elke stap.Wanneer de BABB-oplossing 100% bereikt, breng dan twee extra wijzigingen aan voor een nieuwe oplossing. Bereid een glazen schuif van 20 bij 60 millimeter 1,5 afdekglas voor om de embryo's te monteren om te voorkomen dat het monster wordt samengedrukt. Voeg afstandhouders toe die zijn gemaakt van dunne metalen ringen.Breng de gewiste embryo's over naar de microscoopglaasjes met behulp van een tandenstoker, een fijn wattenpuntje of een Pasteur-pipet. Voeg vervolgens een druppel montagemedium toe, dek af met een ander vergelijkbaar dekglas en sluit af met gesmolten paraffine om het preparaat beter te stabiliseren om bubbels te voorkomen. Plaats de deklip aan één kant en schuif deze vervolgens geleidelijk en voorzichtig zijwaarts, voeg indien nodig meer medium toe.Het monster is nu klaar om in de microscoop te worden afgebeeld. Gebruik Fiji / ImageJ om het embryo na beeldvorming te herpositioneren in een gestandaardiseerde anterieur-achterste en dorsaal-ventrale aspositie. Verklein de grootte van de gegevensset in de afbeelding van Fiji, schaal en voeg vervolgens de schaalwaarden X, Y en Z in die nodig zijn om de gegevensset te verkleinen tot minder dan 200 megabytes.Zorg ervoor dat de optie Nieuw venster maken is aangevinkt. Ga vervolgens naar plug-ins en open 3D Viewer. Klik in het 3D Viewer-venster op het embryo om het te selecteren, waardoor een rood 3D-vak verschijnt.Wanneer u deze modus gebruikt, regelt u de rotatie van de gegevensset met een muis. Nadat u de perfecte positie van het embryo hebt gegarandeerd, selecteert u bewerken, transformeert u de afbeelding en exporteert u de getransformeerde afbeelding in het 3D Viewer-venster. Inspecteer de verschillende orthogonale vlakken, ga vervolgens naar afbeelding, stapel en selecteer orthogonale weergaven.Wanneer het embryo correct is gepositioneerd, selecteert u het venstermenu van de 3D Viewer en bewerkt, transformeert en slaat u de transformatiematrix op in een tekstbestand met een matextensie. Open het tekstbestand met Fiji/ImageJ, verwijder de eerste twee regels en sla het opnieuw op. Dit creëert een transformatiematrixbestand dat compatibel is met de TransformJ-plug-in.Schakel over naar de volledige resolutie dataset en voer de bewerkingsplug-ins TransformJ en TransformJ affine uit. Blader in het nieuwe venster om te zoeken naar het matrixbestand dat eerder is opgeslagen, selecteer de cubic B-spline-interpolatie en herhaal isotroop en klik vervolgens op OK. Na het correct herpositioneren van het embryo, trimt u het grootste deel van de gecreëerde lege ruimte. Om een volledig Z-projectiebeeld uit te voeren, klikt u op stapels, Z-project en kiest u maximale intensiteit.Teken vervolgens de minimale ROI die het hele embryo in X en Y bevat.Schakel over naar de oorspronkelijke afbeeldingsvensters van de dataset door te klikken op bewerken, selecteren, selectie herstellen en bijsnijden door afbeelding te selecteren. Snijd de plakjes in het begin en het einde die embryoweefsels niet kruisen door afbeeldings- en openingsstapels te selecteren, klik op gereedschappen, selecteer de plakverwijderaar en geef het eerste en laatste segment op dat moet worden verwijderd, zorg ervoor dat u de toename in één wijzigt. Voer indien gewenst verdere analyses en 3D-reconstructies uit met behulp van de instructies in het tekstmanuscript.Om 3D-analyse van meer ontwikkelde embryo's uit te voeren, ontleedt u embryonale dag 18,5 foetussen in koude PBS, verwijdert u alle extra embryonale membranen en wast u de foetussen vervolgens meerdere keren in verse PBS om bloed en puin te verwijderen dat tijdens de dissectieprocedure is geproduceerd. Fix foetussen in 4% PFA gemaakt in PBS bij vier graden Celsius gedurende vijf tot zeven dagen. Na het meerdere malen wassen van het embryo in PBS, droogt u de foetussen uit door te broeden in 10% 10 opeenvolgende verhogingen van methanoloplossingen totdat 100% methanol is bereikt.Voer elke incubatie gedurende 25 minuten uit op een shaker bij kamertemperatuur. Incubateer vervolgens foetussen afzonderlijk op een shaker eerst gedurende één dag in 5% waterstofperoxide in methanol en vervolgens in 10% waterstofperoxide in methanol gedurende maximaal drie dagen totdat de embryo's alle natuurlijke pigmentatie verliezen. Rehydrateer de embryo's geleidelijk in een omgekeerde methanolreeks in gedemineraliseerd water met elke incubatie gedurende 20 minuten op een shaker bij kamertemperatuur en was de embryo's vervolgens drie keer gedurende 30 minuten per wasbeurt in gedemineraliseerd water.Om foetussen in 1% agaroseblokken in te bedden, vult u een plastic buis of spuit van 50 milliliter met gesmolten agarose, plaatst u de foetus in de agarose in een verticale positie en behoudt u deze positie met een tang tijdens het stollen van de agarose. Plaats de mal met het blok gedurende 30 minuten op vier graden Celsius zodat de agarose volledig is gejollificeerd, verwijder vervolgens het agaroseblok met de foetus uit de mal en plaats het in een container met gedemoraliseerd water. Voer de uitdroging van de foetus geleidelijk uit met 10% verhoging van de methanolconcentratie verdund in gedemineraliseerd water of PBS, waarbij het monster gedurende ten minste 45 minuten bij kamertemperatuur op een shaker in methanolconcentratie wordt gehouden totdat 100% methanol is bereikt.Verwijder de foetussen door ze gedurende 2,5 uur in elke concentratie door een reeks BABB-oplossing en methanol te bewegen met 25% toename van de BABB-concentratie totdat 100% BABB wordt bereikt. Vervang de BABB-oplossing elke dag door een nieuwe totdat de foetus volledig transparant is. Dit proces kan drie tot vijf dagen duren.Gebruik lijm om het gewiste agaroseblok aan de motoras van de OPT-scanner te bevestigen, pas vervolgens de optica aan om een beeld van de hele foetus te verkrijgen en ga verder met het verkrijgen van een volledige projectiedataset. De 4D live imaging techniek maakt de dynamische analyse van LuVeLu reporter expressie en embryonale dag 8.5 Snai1-voorwaardelijke knock-out embryo's mogelijk. Samen met het normale LuVeLu-signaal op het presomitische mesoderm vertonen Snai1-voorwaardelijke knock-outembryo's LuVeLu-expressie in de ectopische uitstulping die ontstaat uit de primitieve streep.Whole mount immunofluorescentie assays maken de detectie van potentiële NMP's en belangrijke regulatoren van mesoderm differentiatie mogelijk. Witte en gele pijlen markeren verschillen in de embryo's van het gemuteerde en wilde type. 3D-renderisatie van whole mount immunostainings maakt een beter begrip van het weefsel of de structuur in de studie mogelijk.In dit geval werd de locatie van potentiële NMP's in de staartknop onderzocht. 3D-weefselreconstructies zijn ook belangrijk om morfologische defecten in muizenembryo's te begrijpen en te karakteriseren. Interactieve visualisatie van 3D-reconstructie kan ook worden gebouwd in gebruiksvriendelijke formaten.Bijvoorbeeld in een PDF-bestand. Deze 3D embryo caudale structuren kunnen worden gebruikt om de kracht van 3D-modellen aan een meer algemeen publiek te illustreren en om te helpen bij de studie bij het aanleren van een gewervelde axiale elongatie en segmentatie. Ten slotte is 3D in toto visualisatie van meer ontwikkelde muizenembryo's mogelijk met behulp van de OTP-microscopietechniek.Geanimeerde renderings worden hier getoond, met de nadruk op belangrijke plakjes embryonale dag 18,5 foetussen. Het belangrijkste om te onthouden is dat het resultaat een getrouwe weergave moet blijven van wat er in het embryo wordt waargenomen. Onderzoekers kunnen deze methoden gebruiken om verder te gaan dan alleen statische weergave van de afbeeldingen, maar ook video's, driedimensionale reconstructies en zelfs interactieve 3D-modellen van hun gegevens.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisatie van Chondrocyte Intercalatie en Directional Proliferatie via Zebrabow Klonale Cell Analysis in het Embryonale Meckel&#39;s Kraakbeen

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse van retinoïnezuur geïnduceerde neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in twee en drie-dimensionale embryoiden organen

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...