Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
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Nous tenons à remercier Olivier Pourquié et Alexander Aulehla pour la souche reporter LuVeLu, le laboratoire SunJin pour l’échantillon d’essai RapiClear, Hugo Pereira pour l’aide apportée à BigStitcher, Nuno Granjeiro pour avoir aidé à mettre en place l’appareil d’imagerie en direct, l’installation animale IGC et les membres passés et présents du laboratoire Mallo pour les commentaires utiles et le soutien au cours de ce travail.
Nous remercions le soutien technique de l’installation d’imagerie avancée de l’IGC, qui est soutenu par un financement portugais ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 et ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinancé par le programme opérationnel régional de Lisbonne (Lisboa 2020), dans le cadre de l’accord de partenariat Portugal 2020, par l’intermédiaire du Fonds européen de développement régional (FEDER) et de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été soutenus par des subventions LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) et SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) à M.M., l’infrastructure de recherche Congento, le projet LISBOA-01-0145-FEDER-022170, et la bourse de doctorat PD/BD/128426/2017 à A.D.

Les expériences impliquant des animaux ont suivi les législations portugaise (Portaria 1005/92) et européenne (directive 2010/63/UE) concernant le logement, l’élevage et le bien-être. Le projet a été examiné et approuvé par le comité d’éthique de l’Instituto Gulbenkian de Ciência et par l’entité nationale portugaise Direcção Geral de Alimentação e Veterinária (référence de licence: 014308).
1. Préparation des échantillons pour l’imagerie 3D et 4D
<p class="jov...

L’allongement axial et la segmentation sont deux des processus les plus complexes et les plus dynamiques qui se produisent au cours du développement embryonnaire des vertébrés. L’utilisation de l’imagerie 3D et 4D avec suivi unicellulaire est appliquée, depuis un certain temps, pour étudier ces processus chez les embryons de poisson-zèbre et de poulet, pour lesquels l’accessibilité et les conditions de culture facilitent l’imagerie complexe 19,44,45,46,47,48,49 <sup cla...

La formation de l’axe du corps des vertébrés est un processus très complexe et dynamique qui se produit au cours du développement embryonnaire. À la fin de la gastrulation [chez la souris, vers le jour embryonnaire (E) 8.0], un groupe de cellules progénitrices épiblastiques connues sous le nom de progéniteurs neuromésodermiques (NMP) deviennent un facteur clé de l’extension axiale dans une séquence tête-queue, générant le tube neural et les tissus mésodermiques paraxiaux lors de la formation du cou, du tronc et de la queue 1,2,3,4 . Fait intéressant, la position que ces NMP occupent dans l’épiblaste caudal semble jouer un rôle clé dans la décision de différenciation en mésoderme ou neuroectoderme5. Bien que nous manquions actuellement d’une empreinte moléculaire précise pour les NMP, on pense généralement que ces cellules co-expriment T (Brachyury) et Sox2 5,6. Les mécanismes exacts régulant les décisions relatives au devenir des NMP (c.-à-d. s’ils prennent des voies neuronales ou mésodermiques) commencent seulement à être définis avec précision. L’expression de Tbx6 dans la région primitive de la striure est un marqueur précoce de la décision du devenir NMP, car ce gène est impliqué dans l’induction et la spécification du mésoderme 6,7. Fait intéressant, les premières cellules du mésoderme semblent exprimer des niveaux élevés d’Epha18, et la signalisation Wnt / β-caténine, ainsi que Msgn1 ont également joué un rôle important dans la différenciation du mésoderme paraxial et la formation de somite 9,10. Une analyse spatio-temporelle complète des PNM au niveau d’une seule cellule sera certainement déterminante pour bien comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la spécification du mésoderme.
La formation de somites (précurseurs des vertèbres) est une caractéristique clé des vertébrés. Au cours de l’allongement axial, le mésoderme paraxial devient segmenté en une série d’unités répétitives bilatérales appelées somites. Le nombre de somites et le temps nécessaire à la formation de nouveaux segments varient selon les espèces 11,12. La somitogenèse implique des oscillations de signalisation périodiques (connues sous le nom d'« horloge de segmentation ») qui peuvent être observées par l’expression cyclique de plusieurs gènes des voies de signalisation Notch, Wnt et Fgf dans le mésoderme présomitique (par exemple, Lfng)11,12. Le modèle actuel de somitogenèse postule également l’existence d’un « front d’onde de maturation », une série de gradients de signalisation complexes impliquant Fgf, Wnt et la signalisation de l’acide rétinoïque qui définissent la position de la bordure postérieure de chaque nouvelle somite. Une interaction coordonnée entre « l’horloge de segmentation » et le « front d’onde de maturation » est donc fondamentale pour la génération de ces modules précurseurs de vertèbres, car des perturbations dans ces processus morphogénétiques clés peuvent entraîner une létalité embryonnaire ou la formation de malformations congénitales (par exemple, la scoliose)13,14,15.
Malgré les progrès récents substantiels dans les techniques d’imagerie, les méthodes d’analyse de bioimage et les logiciels, la plupart des études sur l’allongement axial et la somitogenèse reposent toujours sur des données d’image bidimensionnelles uniques / isolées (par exemple, des sections), ce qui ne permet pas une visualisation complète des tissus multidimensionnels et complique la différenciation claire entre les malformations pathologiques (c’est-à-dire dues à des mutations) et les variations morphologiques normales survenant au cours du développement embryonnaire16 . L’imagerie en 3D a déjà mis au jour de nouveaux mouvements morphogénétiques, qui n’étaient pas identifiés auparavant par les méthodes 2D standard 17,18,19,20, mettant en évidence la puissance de l’imagerie in toto pour comprendre les mécanismes de la somitogenèse des vertébrés et de l’extension axiale.
La microscopie 3D et 4D d’embryons de souris, en particulier l’imagerie en direct, est techniquement difficile et nécessite des étapes critiques lors de la préparation des échantillons, de l’acquisition d’images et du prétraitement des données afin de permettre une analyse spatio-temporelle précise et significative. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’imagerie en direct et la coloration par immunofluorescence en monture entière d’embryons de souris, qui peut être utilisé pour étudier à la fois les NMP et les cellules mésodermiques pendant l’extension axiale et la segmentation. En outre, nous décrivons également un protocole de tomographie par projection optique (OPT) d’embryons et de fœtus plus âgés, qui permet la visualisation et la quantification en 3D des anomalies pathologiques pouvant résulter de problèmes lors de la somitogenèse (par exemple, fusion osseuse et scoliose)13,21,22. Enfin, nous illustrons la puissance des reconstructions d’imagerie 3D dans l’étude et l’enseignement de la segmentation des vertébrés et de l’allongement axial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

La somitogenèse est une caractéristique du développement embryonnaire des vertébrés. Pendant des années, les chercheurs ont étudié ce processus dans une variété d’organismes en utilisant un large éventail de techniques englobant des approches ex vivo et in vitro. Cependant, la plupart des études reposent encore sur l’analyse de données d’imagerie bidimensionnelle (2D), ce qui limite l’évaluation correcte d’un processus de développement comme l’extension axiale et la somitogenèse impliquant des interactions hautement dynamiques dans un espace 3D complexe. Nous décrivons ici les techniques qui permettent l’acquisition d’images en direct de souris, le traitement d’ensembles de données, la visualisation et l’analyse en 3D et 4D pour étudier les cellules (par exemple, les progéniteurs neuromésodermiques) impliquées dans ces processus de développement. Nous fournissons également un protocole étape par étape pour la tomographie par projection optique et la microscopie par immunofluorescence à montage entier dans des embryons de souris (de la préparation de l’échantillon à l’acquisition d’images) et montrons un pipeline que nous avons développé pour traiter et visualiser les données d’images 3D. Nous étendons l’utilisation de certaines de ces techniques et mettons en évidence les caractéristiques spécifiques de différents logiciels disponibles (par exemple, Fidji / ImageJ, Drishti, Amira et Imaris) qui peuvent être utilisés pour améliorer notre compréhension actuelle de l’extension axiale et de la formation de somite (par exemple, les reconstructions 3D). Dans l’ensemble, les techniques décrites ici soulignent l’importance de la visualisation et de l’analyse de données 3D en biologie du développement et pourraient aider d’autres chercheurs à mieux traiter les données d’images 3D et 4D dans le contexte de l’extension et de la segmentation axiales des vertébrés. Enfin, le travail utilise également de nouveaux outils pour faciliter l’enseignement du développement embryonnaire des vertébrés.

Les résultats représentatifs présentés dans cet article pour l’imagerie en direct et l’imagerie par immunofluorescence ont été obtenus à l’aide d’un système à deux photons, avec un objectif d’eau de 20 × 1,0 NA, le laser d’excitation réglé à 960 nm et des photodétecteurs GaAsP (comme décrit dans Dias et al. (2020)43. La tomographie par projection optique a été réalisée à l’aide d’un scanner OPenT construit sur mesure (tel que décrit dans Gualda et al. (2013)<su...

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Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Nous décrivons ici des outils et des méthodes de calcul qui permettent la visualisation et l’analyse de données d’images tridimensionnelles et quadridimensionnelles d’embryons de souris dans le contexte de l’allongement axial et de la segmentation, obtenues par tomographie par projection optique in toto, et par imagerie en direct et coloration par immunofluorescence en monture entière à l’aide de la microscopie multiphotonique.

Approches de visualisation et d’analyse tridimensionnelles et quadridimensionnelles pour étudier l’allongement et la segmentation axial des vertébrés

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Les stades de l’organogenèse chez les embryons de souris restent mal étudiés, en partie en raison de la visualisation difficile des structures complexes embryonnaires. Ce protocole décrit les techniques qui permettent la visualisation et l’analyse 3D et 4D d’embryons de souris lors de l’extension axiale et de la segmentation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs d’étudier et de montrer les structures complexes de l’embryon de souris en tant qu’objets dynamiques 3D.Ce protocole contient des techniques qui peuvent être utilisées dans l’étude des malformations congénitales affectant la vertèbre et la moelle épinière des mammifères, telles que la scoliose. Ces techniques peuvent également être utilisées avec des systèmes modèles in vitro, permettant ainsi l’étude du développement embryonnaire humain. Pour préparer les embryons de souris entre le jour embryonnaire 8.25 et le jour embryonnaire 10.5 pour l’imagerie vivante, disséquez les embryons dans un milieu M2 préchauffé à 37 degrés Celsius.Retirez doucement le sac vitellin à l’aide d’une pince propre et lavez l’embryon une fois avec un milieu M2 frais pour éliminer le sang et les débris produits lors de la dissection. Au cours de la procédure d’imagerie en direct, incuber des embryons dans un milieu DMEM à faible teneur en glucose complété par un FBS défini par HyClone à 10%, deux millimolaires L-glutamine et 1% de streptomycine à la pénicilline dans une chambre chauffée à 37 degrés Celsius et un oxygène à 65% avec un environnement à 5% de dioxyde de carbone. Pour préparer des embryons de souris de stade similaire pour la microscopie d’immunofluorescence, au lieu d’utiliser du M2 chauffé, disséquez les embryons dans du PBS froid et fixez-les dans du paraformaldéhyde à 4%.Après avoir effectué l’ensemble du protocole de coloration par immunofluorescence de montage tel que décrit dans le manuscrit du texte, la clairance tissulaire peut être obtenue à l’aide de RapiClear. Tout d’abord, placez les embryons au centre d’une lame de verre concave de dépression de 75 x 25 millimètres, retirez tout le PBST dans la lame de dépression du microscope et ajoutez 200 microlitres de solution de nettoyage, puis couvrez la préparation de la lame avec une boîte. Après 10 minutes à l’abri de la lumière, lorsque les embryons commencent à devenir transparents, remplacez la solution de nettoyage et attendez 20 minutes supplémentaires.Recouvrez l’embryon d’une lèvre de couverture partant d’un côté et se déplaçant doucement vers l’autre. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie. Pour le nettoyage à l’aide de salicylate de méthyle ou de BABB, assurez-vous que les embryons sont complètement déshydratés dans du méthanol à 100%, puis commencez la série de BABB et de méthanol avec des augmentations successives de concentration de 20% et une incubation de 20 minutes pour chaque étape.Lorsque la solution BABB atteint 100 %, apportez deux modifications supplémentaires pour une nouvelle solution. Préparez une lame de verre de couverture de 20 x 60 millimètres 1,5 pour monter les embryons afin d’éviter de comprimer l’échantillon. Ajoutez des entretoises fabriquées à partir de rondelles métalliques minces.Transférez les embryons dégagés sur les lames du microscope à l’aide d’un cure-dent, d’une pointe de coton fin ou d’une pipette Pasteur. Ajoutez ensuite une goutte de support de montage, couvrez avec un autre verre de couverture similaire et scellez avec de la paraffine fondue pour mieux stabiliser la préparation afin d’éviter les bulles. Placez le couvercle d’un côté, puis faites-le glisser progressivement et doucement sur le côté, en ajoutant plus de médium si nécessaire.L’échantillon est maintenant prêt à être imagé au microscope. Utilisez Fidji/ImageJ pour repositionner l’embryon dans une position normalisée de l’axe antérieur-postérieur et dorsal-ventral après l’imagerie. Réduisez la taille du jeu de données dans l’image de Fidji, puis mettez à l’échelle et insérez les valeurs d’échelle X, Y et Z nécessaires pour réduire le jeu de données à moins de 200 mégaoctets.Assurez-vous que l’option Créer une nouvelle fenêtre est cochée. Ensuite, allez dans les plugins et ouvrez 3D Viewer. Dans la fenêtre de la visionneuse 3D, cliquez sur l’embryon pour le sélectionner, ce qui provoque l’apparition d’une boîte 3D rouge.Lorsque vous utilisez ce mode, contrôlez la rotation du jeu de données avec une souris. Après avoir assuré la position parfaite de l’embryon, sélectionnez Modifier, transformer l’image et exporter l’image transformée dans la fenêtre visionneuse 3D. Inspectez les différents plans orthogonaux, puis accédez à l’image, puis empilez et sélectionnez des vues orthogonales.Lorsque l’embryon est correctement positionné, sélectionnez le menu de la fenêtre visionneuse 3D, puis modifiez, transformez et enregistrez la matrice de transformation dans un fichier texte avec une extension de tapis. Ouvrez le fichier texte à l’aide de Fiji/ImageJ, supprimez les deux premières lignes et enregistrez-les à nouveau. Cela crée un fichier de matrice de transformation compatible avec le plugin TransformJ.Basculez vers le jeu de données pleine résolution et exécutez les plugins d’opération TransformJ et TransformJ affine. Dans la nouvelle fenêtre, recherchez le fichier matriciel précédemment enregistré, sélectionnez l’interpolation B-spline cubique et rééchantillonnez isotropement, puis cliquez sur OK. Après avoir correctement repositionné l’embryon, coupez la majeure partie de l’espace vide créé. Pour effectuer une image de projection Z complète, cliquez sur piles, Projet Z et choisissez intensité maximale.Dessinez ensuite le retour sur investissement minimum qui contient l’embryon entier dans X et Y.Basculez vers les fenêtres d’image du jeu de données d’origine en cliquant sur modifier, sélectionner, restaurer la sélection et recadrer en sélectionnant l’image. Coupez les tranches au début et à la fin qui n’intersectent pas les tissus embryonnaires en sélectionnant l’image et en ouvrant les piles, cliquez sur les outils, sélectionnez le dissolvant de tranche et spécifiez la première et la dernière tranche à supprimer, en vous assurant de changer l’incrément en un. Si vous le souhaitez, effectuez des analyses supplémentaires et des reconstructions 3D en utilisant les instructions du manuscrit textuel.Pour effectuer une analyse 3D d’embryons plus développés, disséquer les fœtus embryonnaires du jour 18,5 dans le PBS froid, enlever toutes les membranes embryonnaires supplémentaires, puis laver les fœtus plusieurs fois dans du PBS frais pour éliminer le sang et les débris produits pendant la procédure de dissection. Fixer les fœtus dans 4% PFA fabriqué dans PBS à quatre degrés Celsius pendant cinq à sept jours. Après avoir lavé l’embryon plusieurs fois dans du PBS, déshydratez les fœtus en incubant dans des augmentations successives de 10%10 de solutions de méthanol jusqu’à ce que 100% de méthanol soit atteint.Effectuez chaque incubation pendant 25 minutes sur un agitateur à température ambiante. Ensuite, incuber les fœtus séparément sur un agitateur d’abord pendant une journée dans du peroxyde d’hydrogène à 5% dans du méthanol, puis dans du peroxyde d’hydrogène à 10% dans du méthanol pendant trois jours jusqu’à ce que les embryons perdent toute pigmentation naturelle. Réhydrater progressivement les embryons dans une série de méthanol inversé dans de l’eau déminéralisée à chaque incubation pendant 20 minutes sur un agitateur à température ambiante, puis laver les embryons trois fois pendant 30 minutes par lavage dans de l’eau déminéralisée.Pour intégrer les fœtus dans des blocs d’agarose à 1%, remplissez un tube ou une seringue en plastique de 50 millilitres avec de l’agarose fondue, puis placez le fœtus dans l’agarose en position verticale et maintenez cette position avec une pince pendant la solidification de l’agarose. Placez la moisissure avec le bloc à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour que l’agarose se gélifie complètement, puis retirez le bloc d’agarose avec le fœtus de la moisissure et placez-le dans un récipient avec de l’eau démoralisée. Effectuer la déshydratation du fœtus progressivement avec une augmentation de 10% de la concentration de méthanol dilué dans de l’eau déminéralisée ou PBS, en gardant l’échantillon en concentration de méthanol pendant au moins 45 minutes à température ambiante sur un agitateur jusqu’à ce que 100% de méthanol soit atteint.Éliminez les fœtus en les déplaçant à travers une solution BABB en série et du méthanol pendant 2,5 heures dans chaque concentration avec une augmentation de 25% de la concentration BABB jusqu’à atteindre 100% BABB. Remplacez la solution BABB par une solution fraîche tous les jours jusqu’à ce que le fœtus soit complètement transparent. Ce processus peut prendre de trois à cinq jours.Utilisez de la colle pour fixer le bloc d’agarose dégagé à l’axe moteur du scanner OPT, puis ajustez l’optique pour obtenir une image du fœtus entier et procédez à l’acquisition d’un ensemble de données de projection complet. La technique d’imagerie en direct 4D permet l’analyse dynamique de l’expression du rapporteur LuVeLu et des embryons knockout conditionnels Snai1 du jour embryonnaire 8,5. Avec le signal LuVeLu normal sur le mésoderme présomitique, les embryons knockout conditionnels Snai1 présentent une expression LuVeLu dans le renflement ectopique qui résulte de la traînée primitive.Les tests d’immunofluorescence de montage entier permettent de détecter les NMP potentiels et les principaux régulateurs de la différenciation du mésoderme. Les flèches blanches et jaunes mettent en évidence les différences entre les embryons mutants et sauvages. Le rendu 3D d’immunocolorations de monture entières permet une meilleure compréhension du tissu ou de la structure dans l’étude.Dans ce cas, l’emplacement des PNM potentiels dans le bourgeon de queue a été étudié. Les reconstructions tissulaires 3D sont également importantes pour comprendre et caractériser les défauts morphologiques des embryons de souris. La visualisation interactive de la reconstruction 3D peut également être construite dans des formats conviviaux.Par exemple, dans un fichier PDF. Ces structures caudales embryonnaires 3D peuvent être utilisées pour illustrer la puissance des modèles 3D à un public plus général et pour aider à l’étude dans l’enseignement de l’allongement et de la segmentation axials d’un vertébré. Enfin, la visualisation 3D in toto d’embryons de souris plus développés est possible en utilisant la technique de microscopie OTP.Des rendus animés sont montrés ici, mettant en évidence des tranches clés de fœtus embryonnaires de jour 18,5. La chose la plus importante à retenir est que le résultat doit rester une représentation fidèle de ce qui est observé dans l’embryon. Les chercheurs peuvent utiliser ces méthodes pour aller au-delà de la simple présentation statique aux images, mais aussi inclure des vidéos, des reconstructions tridimensionnelles et même des modèles 3D interactifs de leurs données.

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Rendu tridimensionnel et l’analyse d’immunomarquées, a précisé réseaux vasculaires villosités placentaires humains

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...