Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
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Wir danken Olivier Pourquié und Alexander Aulehla für den LuVeLu-Reporterstamm, dem SunJin-Labor für das RapiClear-Testmuster, Hugo Pereira für die Hilfe bei der Verwendung von BigStitcher, Nuno Granjeiro für die Hilfe bei der Einrichtung des Live-Imaging-Apparates, der IGC-Tieranlage und ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Mallo-Labors für nützliche Kommentare und Unterstützung während dieser Arbeit.
Wir danken der technischen Unterstützung der Advanced Imaging Facility der IGC, die durch portugiesische Mittel unterstützt wird ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 und ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, kofinanziert durch das Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), im Rahmen des Partnerschaftsabkommens Portugal 2020, durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) und Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Die in diesem Manuskript beschriebenen Arbeiten wurden durch die Zuschüsse LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) und SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) an M.M., die Forschungsinfrastruktur Congento, das Projekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170 und das PhD-Stipendium PD/BD/128426/2017 an A.D.

Tierversuche folgten den portugiesischen (Portaria 1005/92) und europäischen (Richtlinie 2010/63/EU) Rechtsvorschriften über Unterkunft, Haltung und Wohlfahrt. Das Projekt wurde von der Ethikkommission des "Instituto Gulbenkian de Ciência" und von der portugiesischen Nationalstelle "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (Lizenzreferenz: 014308) geprüft und genehmigt.
1. Probenvorbereitung für 3D- und 4D-Bildgebung
HINWEIS: Hier finden Sie eine detaill...

Axiale Dehnung und Segmentierung sind zwei der komplexesten und dynamischsten Prozesse, die während der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren auftreten. Die Verwendung von 3D- und 4D-Bildgebung mit Einzelzellverfolgung wird seit einiger Zeit angewendet, um diese Prozesse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Hühnerembryonen zu untersuchen, für die Zugänglichkeit und Kulturbedingungen eine komplexe Bildgebung ermöglichen 19,44,45,46,47,48,49 <sup...

Die Bildung von Wirbelkörperachsen ist ein hochkomplexer und dynamischer Prozess, der während der Embryonalentwicklung stattfindet. Am Ende der Gastrulation [in der Maus, um den Embryonaltag (E) 8.0] wird eine Gruppe von Epiblast-Vorläuferzellen, die als neuromesodermale Vorläuferzellen (NMPs) bekannt sind, zu einem Schlüsseltreiber der axialen Ausdehnung in einer Kopf-zu-Schwanz-Sequenz und erzeugt das Neuralrohr und das paraxiale mesodermale Gewebe während der Hals-, Rumpf- und Schwanzbildung 1,2,3,4 . Interessanterweise scheint die Position, die diese NMPs im kaudalen Epiblasten einnehmen, eine Schlüsselrolle bei der Entscheidung zu spielen, in Mesoderm oder Neuroektoderm5 zu differenzieren. Obwohl uns derzeit ein präziser molekularer Fingerabdruck für NMPs fehlt, wird allgemein angenommen, dass diese Zellen T (Brachyury) und Sox2 5,6 koexprimieren. Die genauen Mechanismen, die NMP-Schicksalsentscheidungen regulieren (d.h. ob sie neuronale oder mesodermale Routen nehmen), beginnen erst jetzt genau definiert zu werden. Die Tbx6-Expression im primitiven Streifenbereich ist ein früher Marker für die NMP-Schicksalsentscheidung, da dieses Gen an der Induktion und Spezifikation von Mesoderm 6,7 beteiligt ist. Interessanterweise scheinen frühe Mesodermzellen hohe Konzentrationen von Epha18 zu exprimieren, und es wurde auch gezeigt, dass die Wnt/β-Catenin-Signalgebung sowie Msgn1 eine wichtige Rolle bei der paraxialen Mesodermdifferenzierung und der Somitbildung spielen 9,10. Eine vollständige räumlich-zeitliche Analyse von NMPs auf Einzelzellebene wird sicherlich entscheidend sein, um die molekularen Mechanismen, die die Mesoderm-Spezifikation steuern, vollständig zu verstehen.
Die Bildung von Somiten (Wirbelvorläufern) ist ein Schlüsselmerkmal von Wirbeltieren. Während der axialen Dehnung wird das paraxiale Mesoderm in eine Reihe von bilateralen sich wiederholenden Einheiten segmentiert, die als Somiten bezeichnet werden. Die Anzahl der Somiten und die Zeit, die für die Bildung neuer Segmente benötigt wird, variieren zwischen den Arten11,12. Somitogenese beinhaltet periodische Signalschwingungen (bekannt als "Segmentierungsuhr"), die durch die zyklische Expression mehrerer Gene der Signalwege Notch, Wnt und Fgf im präsomitischen Mesoderm (z. B. Lfng) beobachtet werden können11,12. Das aktuelle Modell der Somitogenese postuliert auch die Existenz einer "Reifungswellenfront", einer Reihe komplexer Signalgradienten mit Fgf-, Wnt- und Retinsäuresignalen, die die Position der hinteren Grenze jedes neuen Somits definieren. Eine koordinierte Wechselwirkung zwischen der "Segmentierungsuhr" und der "Reifungswellenfront" ist daher für die Erzeugung dieser Wirbelvorläufermodule von grundlegender Bedeutung, da Störungen in diesen wichtigen morphogenetischen Prozessen zu embryonaler Letalität oder zur Bildung angeborener Fehlbildungen (z.B. Skoliose) führen können)13,14,15.
Trotz erheblicher Fortschritte in jüngster Zeit bei bildgebenden Verfahren, Biobildanalysemethoden und Software stützen sich die meisten Studien zur axialen Dehnung und Somitogenese immer noch auf ein-/isolierte zweidimensionale Bilddaten (z. B. Schnitte), die keine vollständige mehrdimensionale Gewebevisualisierung ermöglichen und eine klare Unterscheidung zwischen pathologischen Fehlbildungen (d. H. Aufgrund von Mutationen) gegenüber normalen morphologischen Variationen während der Embryonalentwicklung erschweren16 . Die Bildgebung in 3D hat bereits neuartige morphogenetische Bewegungen aufgedeckt, die zuvor nicht durch Standard-2D-Methodenidentifiziert wurden 17,18,19,20, was die Leistungsfähigkeit der In-toto-Bildgebung unterstreicht, die Mechanismen der Wirbeltier-Somitogenese und der axialen Ausdehnung zu verstehen.
Die 3D- und 4D-Mikroskopie von Mausembryonen, insbesondere die Live-Bildgebung, ist technisch anspruchsvoll und erfordert kritische Schritte während der Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenvorverarbeitung, um eine genaue und aussagekräftige räumlich-zeitliche Analyse zu ermöglichen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Live-Bildgebung und die Ganz-Mount-Immunfluoreszenzfärbung von Mausembryonen, mit dem sowohl NMPs als auch mesodermale Zellen während der axialen Ausdehnung und Segmentierung untersucht werden können. Darüber hinaus beschreiben wir auch ein Protokoll für die optische Projektionstomographie (OPT) älterer Embryonen und Föten, das eine 3D-in-toto-Visualisierung und Quantifizierung von pathologischen Anomalien ermöglicht, die sich aus Problemen während der Somitogenese (z. B. Knochenfusion und Skoliose) ergeben können)13,21,22. Schließlich veranschaulichen wir die Leistungsfähigkeit von 3D-Bildgebungsrekonstruktionen in Studium und Lehre der Wirbeltiersegmentierung und axialen Dehnung.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

Die Somitogenese ist ein Kennzeichen der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren. Seit Jahren untersuchen Forscher diesen Prozess in einer Vielzahl von Organismen mit einer breiten Palette von Techniken, die Ex-vivo- und In-vitro-Ansätze umfassen. Die meisten Studien stützen sich jedoch immer noch auf die Analyse zweidimensionaler (2D) Bilddaten, was die ordnungsgemäße Bewertung eines Entwicklungsprozesses wie axiale Ausdehnung und Somitogenese mit hochdynamischen Wechselwirkungen in einem komplexen 3D-Raum einschränkt. Hier beschreiben wir Techniken, die die Live-Bildgebung der Maus, die Datensatzverarbeitung, die Visualisierung und die Analyse in 3D und 4D ermöglichen, um die Zellen (z. B. neuromesodermale Vorläufer) zu untersuchen, die an diesen Entwicklungsprozessen beteiligt sind. Wir bieten auch ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die optische Projektionstomographie und die gesamte Immunfluoreszenzmikroskopie in Mausembryonen (von der Probenvorbereitung bis zur Bildaufnahme) und zeigen eine Pipeline, die wir entwickelt haben, um 3D-Bilddaten zu verarbeiten und zu visualisieren. Wir erweitern den Einsatz einiger dieser Techniken und heben spezifische Merkmale verschiedener verfügbarer Software (z. B. Fidschi / ImageJ, Drishti, Amira und Imaris) hervor, die verwendet werden können, um unser derzeitiges Verständnis von axialer Ausdehnung und Somitbildung (z. B. 3D-Rekonstruktionen) zu verbessern. Insgesamt betonen die hier beschriebenen Techniken die Bedeutung der 3D-Datenvisualisierung und -analyse in der Entwicklungsbiologie und könnten anderen Forschern helfen, 3D- und 4D-Bilddaten im Zusammenhang mit der axialen Ausdehnung und Segmentierung von Wirbeltieren besser zu adressieren. Schließlich verwendet die Arbeit auch neuartige Werkzeuge, um die embryonale Entwicklung von Wirbeltieren zu erleichtern.

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Artikel sowohl für die Live- als auch für die Immunfluoreszenzbildgebung gezeigt werden, wurden unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Systems mit einem 20 × 1,0 NA-Wasserobjektiv, dem auf 960 nm abgestimmten Anregungslaser und GaAsP-Photodetektoren (wie in Dias et al. (2020) 43 beschrieben. Die optische Projektionstomographie wurde mit einem speziell angefertigten OPenT-Scanner durchgeführt (wie in Gualda et al. (2013)28 bes...

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Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Hier beschreiben wir Berechnungswerkzeuge und -methoden, die die Visualisierung und Analyse von drei- und vierdimensionalen Bilddaten von Mausembryonen im Rahmen der axialen Dehnung und Segmentierung ermöglichen, die durch optische In-toto-Projektionstomographie und durch Live-Bildgebung und Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung mittels Multiphotonenmikroskopie erhalten werden.

Drei- und vierdimensionale Visualisierungs- und Analyseansätze zur Untersuchung der axialen Dehnung und Segmentierung von Wirbeltieren

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Die Organogenese-Stadien in den Mausembryonen sind nach wie vor schlecht untersucht, was zum Teil auf die schwierige Visualisierung der komplexen Strukturen des Embryos zurückzuführen ist. Dieses Protokoll beschreibt Techniken, die eine 3D- und 4D-Visualisierung und Analyse von Mausembryonen während der axialen Ausdehnung und Segmentierung ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, die komplexen Strukturen des Mausembryos als dynamische 3D-Objekte zu untersuchen und zu zeigen.Dieses Protokoll enthält Techniken, die bei der Untersuchung angeborener Fehlbildungen verwendet werden können, die den Wirbel und das Rückenmark von Säugetieren betreffen, wie Skoliose. Diese Techniken können auch mit In-vitro-Modellsystemen verwendet werden, wodurch die Untersuchung der menschlichen Embryonalentwicklung ermöglicht wird. Um Mausembryonen zwischen dem embryonalen Tag 8,25 und dem embryonalen Tag 10,5 für die Lebendbildgebung vorzubereiten, sezieren Sie die Embryonen in vorgewärmtem M2-Medium bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie den Dottersack vorsichtig mit einer sauberen Pinzette und waschen Sie den Embryo einmal mit frischem M2-Medium, um Blut und Ablagerungen zu entfernen, die während der Dissektion entstanden sind. Während des Live-Bildgebungsverfahrens brüten Embryonen in niedrigem Glukose-DMEM-Medium, ergänzt mit 10% HyClone definiertem FBS, zwei millimolaren L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin in einer 37 Grad Celsius beheizten Kammer und einem 65% Sauerstoff mit 5% Kohlendioxid-Umgebung. Um Mausembryonen im ähnlichen Stadium für die Immunfluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, anstatt erhitztes M2 zu verwenden, sezieren Sie die Embryonen in kaltem PBS und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd.Nach Durchführung des gesamten Mount-Immunfluoreszenz-Färbeprotokolls, wie im Textmanuskript beschrieben, kann die Gewebereinigung mit RapiClear erreicht werden. Legen Sie zuerst die Embryonen in die Mitte eines konkaven Glasobjektträgers mit einer Vertiefung von 75 x 25 Millimetern, entfernen Sie den gesamten PBST im Mikroskop-Vertiefungsobjektträger und fügen Sie 200 Mikroliter Klärlösung hinzu, dann bedecken Sie die Objektträgervorbereitung mit einer Box. Nach 10 Minuten vor Licht geschützt, wenn die Embryonen transparent werden, ersetzen Sie die Klärlösung und warten Sie weitere 20 Minuten.Bedecken Sie den Embryo mit einem Deckglas, das von einer Seite ausgeht und sich sanft zur anderen bewegt. Die Probe ist nun bereit für die Bildgebung. Stellen Sie für das Clearing mit Methylsalicylat oder BABB sicher, dass die Embryonen vollständig in 100% Methanol dehydriert sind, und beginnen Sie dann die Reihe von BABB und Methanol mit 20% sukzessiven Konzentrationserhöhungen und einer 20-minütigen Inkubation für jeden Schritt.Wenn die BABB-Lösung 100% erreicht, nehmen Sie zwei zusätzliche Änderungen für eine neue Lösung vor. Bereiten Sie einen 20 x 60 Millimeter großen 1,5-Deckglas-Objektträger vor, um die Embryonen zu montieren, um eine Komprimierung der Probe zu vermeiden. Fügen Sie Abstandshalter aus dünnen Metallscheiben hinzu.Übertragen Sie die gereinigten Embryonen mit einem Zahnstocher, einer feinen Baumwollspitze oder einer Pasteur-Pipette auf die Objektträger. Fügen Sie dann einen Tropfen Montagemedium hinzu, bedecken Sie es mit einem anderen ähnlichen Deckglas und versiegeln Sie es mit geschmolzenem Paraffin, um die Vorbereitung besser zu stabilisieren und Blasen zu vermeiden. Legen Sie das Deckglas auf eine Seite und schieben Sie es dann allmählich und vorsichtig zur Seite, wobei Sie bei Bedarf mehr Medium hinzufügen.Die Probe ist nun bereit, im Mikroskop abgebildet zu werden. Verwenden Sie Fidschi/ImageJ, um den Embryo nach der Bildgebung in eine standardisierte vorder-posteriore und dorsal-ventrale Achsenposition zu bringen. Reduzieren Sie die Datensatzgröße im Bild von Fidschi, skalieren und fügen Sie dann die X-, Y- und Z-Skalierungswerte ein, die erforderlich sind, um das Dataset auf weniger als 200 Megabyte zu reduzieren.Stellen Sie sicher, dass die Option Neues Fenster erstellen aktiviert ist. Gehen Sie dann zu Plugins und öffnen Sie 3D Viewer. Klicken Sie im 3D-Viewer-Fenster auf den Embryo, um ihn auszuwählen, wodurch ein rotes 3D-Feld angezeigt wird.Wenn Sie diesen Modus verwenden, steuern Sie die Drehung des Datensatzes mit einer Maus. Nachdem Sie die perfekte Position des Embryos sichergestellt haben, wählen Sie Bearbeiten, Transformieren des Bildes und Exportieren des transformierten Bildes im 3D-Viewer-Fenster. Untersuchen Sie die verschiedenen orthogonalen Ebenen, gehen Sie dann zum Bild, stapeln Sie sie und wählen Sie orthogonale Ansichten aus.Wenn der Embryo richtig positioniert ist, wählen Sie das 3D-Viewer-Fenstermenü und bearbeiten, transformieren und speichern Sie dann die Transformationsmatrix in einer Textdatei mit der Erweiterung mat. Öffnen Sie die Textdatei mit Fiji/ImageJ, entfernen Sie die ersten beiden Zeilen und speichern Sie sie erneut. Dadurch wird eine Transformationsmatrixdatei erstellt, die mit dem TransformJ-Plugin kompatibel ist.Wechseln Sie zum Datensatz mit voller Auflösung und führen Sie die Operation-Plugins TransformJ und TransformJ affine aus. Suchen Sie im neuen Fenster nach der zuvor gespeicherten Matrixdatei, wählen Sie die kubische B-Spline-Interpolation aus, führen Sie ein isotropes Resampling durch, und klicken Sie dann auf OK. Nachdem Sie den Embryo richtig neu positioniert haben, schneiden Sie den größten Teil des entstandenen leeren Raums ab. Um ein vollständiges Z-Projektionsbild auszuführen, klicken Sie auf Stapel, Z-Projekt und wählen Sie die maximale Intensität.Zeichnen Sie dann den minimalen ROI, der den gesamten Embryo in X und Y enthält.Wechseln Sie zu den Bildfenstern des ursprünglichen Datensatzes, indem Sie auf Bearbeiten, Auswahl, Auswahl wiederherstellen und Zuschneiden klicken, indem Sie das Bild auswählen. Schneiden Sie die Scheiben am Anfang und Ende zu, die sich nicht mit Embryogewebe überschneiden, indem Sie Bild- und Öffnungsstapel auswählen, auf Werkzeuge klicken, den Scheibenentferner auswählen und die erste und letzte zu entfernende Scheibe angeben, wobei Sie sicherstellen, dass das Inkrement in eins geändert wird. Führen Sie auf Wunsch weitere Analysen und 3D-Rekonstruktionen anhand der Anweisungen im Textmanuskript durch.Um eine 3D-Analyse von weiter entwickelten Embryonen durchzuführen, sezieren Sie embryonale Föten am 18,5. Tag in kaltem PBS, entfernen Sie alle zusätzlichen embryonalen Membranen und waschen Sie die Föten mehrmals in frischem PBS, um Blut und Ablagerungen zu entfernen, die während des Dissektionsverfahrens produziert wurden. Fixieren Sie Föten in 4% PFA in PBS bei vier Grad Celsius für fünf bis sieben Tage. Nachdem Sie den Embryo mehrmals in PBS gewaschen haben, dehydrieren Sie die Föten, indem Sie in 10% 10% aufeinanderfolgenden Erhöhungen von Methanollösungen inkubieren, bis 100% Methanol erreicht ist.Führen Sie jede Inkubation für 25 Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur durch. Als nächstes brüten Sie Föten separat auf einem Shaker zuerst für einen Tag in 5% Wasserstoffperoxid in Methanol und dann in 10% Wasserstoffperoxid in Methanol für bis zu drei Tage, bis die Embryonen alle natürliche Pigmentierung verlieren. Rehydrieren Sie die Embryonen schrittweise in einer umgekehrten Methanolserie in demineralisiertem Wasser mit jeder Inkubation für 20 Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur und waschen Sie die Embryonen dann dreimal für 30 Minuten pro Waschgang in demineralisiertem Wasser.Um Föten in 1%-Agaroseblöcke einzubetten, füllen Sie ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen oder eine Spritze mit geschmolzener Agarose, legen Sie dann den Fötus in der Agarose in eine vertikale Position und halten Sie diese Position mit einer Pinzette während der Erstarrung der Agarose. Legen Sie die Form mit dem Block bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, damit die Agarose vollständig gelalysiert wird, entfernen Sie dann den Agaroseblock mit dem Fötus aus der Form und legen Sie ihn in einen Behälter mit demoralisiertem Wasser. Führen Sie eine Dehydratisierung des Fötus allmählich mit einem Anstieg der Methanolkonzentration um 10% durch, die in demineralisiertem Wasser oder PBS verdünnt wird, und halten Sie die Probe mindestens 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker, bis 100% Methanol erreicht ist.Beseitigen Sie die Föten, indem Sie sie durch eine Reihe von BABB-Lösung und Methanol für 2,5 Stunden in jeder Konzentration bewegen, wobei die BABB-Konzentration um 25% zunimmt, bis 100% BABB erreicht werden. Ersetzen Sie die BABB-Lösung jeden Tag durch eine frische, bis der Fötus vollständig transparent ist. Dieser Vorgang kann drei bis fünf Tage dauern.Verwenden Sie Klebstoff, um den gereinigten Agaroseblock an der Motorachse des OPT-Scanners zu befestigen, passen Sie dann die Optik an, um ein Bild des gesamten Fötus zu erhalten, und fahren Sie fort, einen vollständigen Projektionsdatensatz zu erfassen. Die 4D-Live-Bildgebungstechnik ermöglicht die dynamische Analyse der LuVeLu-Reporterexpression und der embryonalen Snai1-bedingten Knockout-Embryonen am Tag 8,5. Zusammen mit dem normalen LuVeLu-Signal auf dem präsomitischen Mesoderm zeigen Snai1-bedingte Knockout-Embryonen eine LuVeLu-Expression in der ektopischen Ausbuchtung, die sich aus dem primitiven Streifen ergibt.Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Assays ermöglichen den Nachweis potenzieller NMPs und wichtiger Regulatoren der Mesoderm-Differenzierung. Weiße und gelbe Pfeile verdeutlichen Unterschiede in den mutierten und Wildtyp-Embryonen. Die 3D-Darstellung ganzer Mount-Immunfärbungen ermöglicht ein besseres Verständnis des Gewebes oder der Struktur in der Studie.In diesem Fall wurde die Position potenzieller NMPs in der Schwanzknospe untersucht. 3D-Geweberekonstruktionen sind auch wichtig, um morphologische Defekte in Mausembryonen zu verstehen und zu charakterisieren. Die interaktive Visualisierung der 3D-Rekonstruktion kann auch in benutzerfreundlichen Formaten erstellt werden.Zum Beispiel in einer PDF-Datei. Diese 3D-Embryo-Schwanzstrukturen können verwendet werden, um die Leistungsfähigkeit von 3D-Modellen einem allgemeineren Publikum zu veranschaulichen und bei der Untersuchung bei der Lehre einer axialen Dehnung und Segmentierung von Wirbeltieren zu helfen. Schließlich ist eine 3D-in-toto-Visualisierung von weiter entwickelten Mausembryonen mit der OTP-Mikroskopie-Technik möglich.Hier werden animierte Renderings gezeigt, die wichtige Scheiben von Föten des embryonalen Tages 18,5 hervorheben. Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, dass das Ergebnis eine getreue Darstellung dessen bleiben muss, was im Embryo beobachtet wird. Forscher können diese Methoden verwenden, um über die Präsentation von nur statischer Darstellung der Bilder hinauszugehen, sondern auch Videos, dreidimensionale Rekonstruktionen und sogar interaktive 3D-Modelle ihrer Daten einzubeziehen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...