Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

ברצוננו להודות לאוליבייה Pourquié ואלכסנדר Aulehla על זן הכתב LuVeLu, מעבדת SunJin עבור מדגם הבדיקה RapiClear, הוגו Pereira על העזרה באמצעות BigStitcher, נונו Granjeiro על שעזר להקים את מנגנון ההדמיה החיה, מתקן בעלי החיים IGC וחברים בעבר ובהווה של מעבדת מאלו עבור הערות שימושיות ותמיכה במהלך עבודה זו.
אנו מודים על התמיכה הטכנית של מתקן ההדמיה המתקדם של IGC, הנתמך על ידי נציג המימון הפורטוגלי# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 ו- ref# PTDC/ BII-BTI/32375/2017, במימון משותף של תוכנית התפעול האזורית של Lisboa (Lisboa 2020), במסגרת הסכם השותפות של פורטוגל 2020, באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (FEDER) ו- Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, פורטוגל). העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי מענקים LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, פורטוגל) ו SCML-MC-60-2014 (סנטה קאסה דה מיסריקורדיה, פורטוגל) ל- M.M., תשתית המחקר קונג'נטו, פרויקט LISBOA-01-0145-FEDER-022170, ואת מלגת הדוקטורט PD / BD / 128426 / 2017 ל- A.D.

ניסויים הקשורים בבעלי חיים עקבו אחר החקיקה הפורטוגזית (Portaria 1005/92) ואירופאית (הוראה 2010/63/EU) הנוגעת לדיור, גידול ורווחה. הפרויקט נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של 'מכון גולבנקיאן דה Ciência' ועל ידי הישות הלאומית הפורטוגזית, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (התייחסות רישיון: 014308).
1. הכנה מד...

התארכות צירית וסגמנטציה הם שניים מהתהליכים המורכבים והדינמיים ביותר המתרחשים במהלך התפתחות עוברית של חוליות. השימוש בהדמיה תלת-ממדית ו-4D עם מעקב אחר תאים חד-תאיים הוחל, מזה זמן מה, כדי לחקור תהליכים אלה הן בעוברי זברה והן בעוברי עוף, אשר תנאי הנגישות והתרביות מאפשרים הדמיה מורכבת 19,44,44,45,46,4...

היווצרות ציר גוף חוליות היא תהליך מורכב ודינמי ביותר המתרחש במהלך התפתחות עוברית. בסוף גסטרולציה [בעכבר, סביב יום עוברי (E) 8.0], קבוצה של תאי אב אפיבלסט המכונה אבות נוירומסודרמליים (NMPs) הופכים לנהג מפתח של הרחבה צירית ברצף ראש לזנב, יצירת הצינור העצבי ורקמות mesodermal paraxial במהלך היווצרות הצוואר, תא המטען והזנב 1,2,2,3,4 . מעניין, העמדה כי NMPs אלה תופסים epiblast caudal נראה לשחק תפקיד מפתח בהחלטה של הבחנה לתוך mesoderm או neuroectoderm5. למרות שכרגע חסרה לנו טביעת אצבע מולקולרית מדויקת עבור NMPs, תאים אלה נחשבים בדרך כלל ל- Co-express T (Brachyury) ו- Sox2 5,6. המנגנונים המדויקים המסדירים את החלטות הגורל של NMP (כלומר, בין אם הם לוקחים מסלולים עצביים או מסודרמליים) רק מתחילים להיות מוגדרים במדויק. ביטוי Tbx6 באזור הפס הפרימיטיבי הוא סמן מוקדם של החלטת גורל NMP, כמו גן זה מעורב אינדוקציה ומפרט של mesoderm 6,7. מעניין, תאי mesoderm מוקדם נראה לבטא רמות גבוהות של Epha18, Wnt / β-קטנין איתות, כמו גם Msgn1 הוצגו גם לשחק תפקידים חשובים בבידול mesoderm paraxial ו היווצרות somite 9,10. ניתוח מרחבי-זמני מלא של NMPs ברמה של תא יחיד בהחלט יהיה אינסטרומנטלי כדי להבין באופן מלא את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט mesoderm.
היווצרות של somites (מבשרי חוליות) היא תכונה מרכזית של בעלי חוליות. במהלך התארכות צירית, mesoderm paraxial הופך מקוטע בסדרה של יחידות חוזרות דו צדדיות המכונה somites. מספר הסומיטים והזמן הנדרש להיווצרות מקטעים חדשים משתנה בין מינים11,12. Somitogenesis כרוך תנודות איתות תקופתיות (המכונה "שעון פילוח") שניתן לראות על ידי הביטוי המחזורי של מספר גנים של חריץ, Wnt ו Fgf איתות מסלולים במסודרמה presomitic (למשל, Lfng)11,12. המודל הנוכחי של סמיטוגנזה גם מניח את קיומו של "חזית גל התבגרות", סדרה של שיפועי איתותים מורכבים הכוללים Fgf, Wnt ואיתות חומצה רטינואית המגדירים את המיקום של הגבול האחורי של כל סומיט חדש. אינטראקציה מתואמת בין "שעון הפילוח" לבין "חזית גל ההבשלה" היא אפוא בסיסית ליצירת מודולים מבשרים אלה של חוליות, שכן הפרעות בתהליכים מורפוגנטיים מרכזיים אלה עלולות לגרום לקטלניות עוברית או להיווצרות מומים מולדים (למשל, עקמת)13,14,15.
למרות התקדמות משמעותית לאחרונה בטכניקות הדמיה, שיטות ניתוח ביו-דימאז' ותוכנה, רוב המחקרים של התארכות צירית וסומיטוגנזה עדיין מסתמכים על נתוני תמונה דו-ממדיים חד-ממדיים/מבודדים (למשל, מקטעים), שאינם מאפשרים הדמיה מלאה של רקמות רב-ממדיות ומסבך הבחנה ברורה בין מומים פתולוגיים (כלומר עקב מוטציות) לעומת וריאציה מורפולוגית רגילה המתרחשת במהלך התפתחות עוברית16 . הדמיה בתלת-ממד כבר חשפה תנועות מורפוגנטיות חדשניות, שלא זוהו בעבר בשיטות דו-ממדיות סטנדרטיות 17,18,19,20, המדגישות את כוחה של הדמיית טוטו להבין את המנגנונים של סמיטוגנזה חוליות והרחבה צירית.
מיקרוסקופיה תלת-ממדית ותלת-ממדית של עוברי עכבר, במיוחד הדמיה חיה, הם מאתגרים מבחינה טכנית ודורשים צעדים קריטיים במהלך הכנת מדגם, רכישת תמונה ועיבוד נתונים מראש על מנת לאפשר ניתוח מרחבי-זמני מדויק ומשמעותי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להדמיה חיה והכתמת אימונופלואורסצנטיות בהר שלם של עוברים עכברים, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור הן NMPs והן תאים מסודרמליים במהלך הרחבה צירית וסגמנטציה. בנוסף, אנו מתארים גם פרוטוקול לטומוגרפיה של הקרנה אופטית (OPT) של עוברים ועוברים ישנים יותר, המאפשר הדמיה תלת-ממדית של טוטו וכימות של חריגות פתולוגיות שיכולות לנבוע מבעיות במהלך סמיטוגנזה (למשל, היתוך עצם ועקמת)13,21,222. לבסוף, אנו ממחישים את כוחם של שחזורי הדמיה תלת-ממדית במחקר ובהוראת פילוח חוליות והארכה צירית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

סומיטוגנזה הוא סימן היכר של התפתחות עוברית חוליות. במשך שנים, חוקרים חקרו את התהליך הזה במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות מגוון רחב של טכניקות המקיפות גישות ex vivo ו במבחנה. עם זאת, רוב המחקרים עדיין מסתמכים על ניתוח של נתוני הדמיה דו-ממדיים (דו-ממדיים), המגבילים הערכה נכונה של תהליך התפתחותי כמו הרחבה צירית וסומיטוגנזה המערבת אינטראקציות דינמיות מאוד במרחב תלת-ממדי מורכב. כאן אנו מתארים טכניקות המאפשרות רכישת הדמיה חיה של עכבר, עיבוד ערכת נתונים, הדמיה וניתוח בתלת-ממד וב-4D כדי לחקור את התאים (למשל, אבות עצביים) המעורבים בתהליכים התפתחותיים אלה. אנו מספקים גם פרוטוקול שלב אחר שלב לטומוגרפיה של הקרנה אופטית ומיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה בעוברי עכבר (מהכנה מדגמית לרכישת תמונה) ומציגים צינור שפיתחנו לעיבוד ולהדמיה של נתוני תמונה תלת-ממדית. אנו מרחיבים את השימוש בכמה מטכניקות אלה ומדגישים תכונות ספציפיות של תוכנות זמינות שונות (למשל, פיג'י / ImageJ, Drishti, Amira ו- Imaris) שניתן להשתמש בהן כדי לשפר את ההבנה הנוכחית שלנו של הרחבה צירית ויצירת somite (למשל, שחזורים תלת-ממדיים). בסך הכל, הטכניקות המתוארות כאן מדגישות את החשיבות של הדמיה וניתוח נתונים תלת-ממדיים בביולוגיה התפתחותית, ועשויות לסייע לחוקרים אחרים לטפל טוב יותר בנתוני תמונה תלת-ממדית ודו-ממדית בהקשר של הרחבה צירית וסגמנטציה של בעלי חוליות. לבסוף, העבודה משתמשת גם בכלים חדשניים כדי להקל על הוראת התפתחות עוברית של בעלי חוליות.

התוצאות הייצוגיות המוצגות במאמר זה הן להדמיית החי והן להדמיית האימונופלואורסצנטית, התקבלו באמצעות מערכת דו-פוטונית, עם יעד מים של 20 × 1.0 NA, לייזר עירור המכוון ל-960 ננומטר, ו-GaAsP photodetectors (כמתואר בדיאס ואח' (2020)43. טומוגרפיה הקרנה אופטית נעשתה באמצעות סורק OPenT שנבנה בהתאמה אישית (כמת?...

Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

כאן, אנו מתארים כלים ושיטות חישוביות המאפשרים הדמיה וניתוח של נתוני תמונה תלת-ממדיים וארבעה מימדיים של עוברי עכבר בהקשר של התארכות צירית וסגמנטציה, המתקבלים על ידי טומוגרפיה של הקרנה אופטית טוטו, ועל ידי הדמיה חיה וכתם אימונופלואורסצנטי בהר שלם באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית.

גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

שלבי האורגנוגנזה בעוברי העכבר עדיין נחקרים בצורה גרועה חלקית בשל ההדמיה הקשה של המבנים המורכבים העובריים. פרוטוקול זה מתאר טכניקות המאפשרות הדמיה וניתוח תלת-ממדיים ודו-ממדיים של עוברי עכבר במהלך הרחבה צירית וסגמנטציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור ולהראות את המבנים המורכבים של עובר העכבר כאובייקטים דינמיים תלת-ממדיים.פרוטוקול זה מכיל טכניקות שניתן להשתמש בהן בחקר מומים מולדים המשפיעים על החוליה ועל חוט השדרה של יונקים, כגון עקמת. טכניקות אלה יכולות לשמש גם עם מערכות מודל הפריה חוץ גופית, ובכך לאפשר את המחקר של התפתחות עוברית אנושית. כדי להכין עוברי עכבר בין יום עוברי 8.25 ויום עוברי 10.5 להדמיה חיה, לנתח את העוברים במדיום M2 שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס.הסר בעדינות את שק החלמון באמצעות מלקחיים נקיים ושטוף את העובר פעם אחת עם מדיום M2 טרי כדי להסיר דם ופסולת המיוצרים במהלך הניתוח. במהלך הליך ההדמיה החיה, עוברים דגירה במדיום DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10% HyClone מוגדר FBS, שני מילימולרי L-גלוטמין, ו 1%פניצילין סטרפטומיצין בתא מחומם 37 מעלות צלזיוס ו 65% חמצן עם 5% סביבת דו תחמוצת הפחמן. כדי להכין עוברי עכבר במה דומה עבור מיקרוסקופיה immunofluorescence, במקום להשתמש M2 מחומם, לנתח את העוברים PBS קר ולתקן ב 4% paraformaldehyde.לאחר ביצוע כל פרוטוקול הכתמת אימונופלואורסצנטיות בהר כמתואר בכתב היד של הטקסט, ניתן להשיג אישור רקמות באמצעות RapiClear. ראשית, מניחים את העוברים במרכז של 75 על 25 מילימטר דיכאון קעור שקופית זכוכית, להסיר את כל PBST במגלשת דיכאון מיקרוסקופ ולהוסיף 200 מיקרוליטרים של פתרון ניקוי, ולאחר מכן לכסות את הכנת השקופית עם תיבה. לאחר 10 דקות מוגן מפני האור, כאשר עוברים מתחילים להיות שקופים, להחליף את פתרון הסליקה ולחכות 20 דקות נוספות.מעל העובר עם כיסוי החל מצד אחד ונע בעדינות לכיוון השני. הדגימה מוכנה כעת להדמיה. עבור ניקוי באמצעות מתיל סליצילאט או BABB, להבטיח כי העוברים מיובשים לחלוטין ב 100% מתנול ולאחר מכן להתחיל את הסדרה של BABB ו מתנול עם 20% עליות רצופות בריכוז ודגרה של 20 דקות עבור כל צעד.כאשר פתרון BABB מגיע ל- 100%, בצע שני שינויים נוספים עבור פתרון חדש. הכן שקופית זכוכית 20 על 60 מילימטר 1.5 לכסות כדי להרכיב את העוברים, כדי למנוע דחיסת המדגם. הוסיפו מרווחים העשויים ממכונות כביסה ממתכת דקה.העבירו את העוברים המנוקים למגלשות המיקרוסקופ באמצעות קיסם, קצה כותנה דק או פיפטה פסטר. לאחר מכן מוסיפים טיפה של מדיום הרכבה, לכסות עם עוד כיסוי דומה ולאטום עם פרפין מומס כדי לייצב טוב יותר את ההכנה כדי למנוע בועות. מניחים את כיסוי על צד אחד ולאחר מכן בהדרגה ובעדינות להחליק אותו לצדדים, הוספת בינוני יותר במידת הצורך.המדגם מוכן כעת לתמונה במיקרוסקופ. השתמש בפיג'י/ImageJ כדי למקם מחדש את העובר בתנוחת ציר קדמי-אחורי-אחורית מתוקננת לאחר הדמיה. הקטן את גודל ערכת הנתונים בתמונה של פיג'י ולאחר מכן שנה את קנה המידה והוסף את ערכי קנה המידה X, Y ו- Z הדרושים כדי להקטין את ערכת הנתונים לפחות מ- 200 מגה-בתים.ודא שהאפשרות צור חלון חדש מסומנת. לאחר מכן עבור אל תוספים ופתח את מציג התלת-ממד. בתוך חלון מציג התלת-ממד, לחץ על העובר כדי לבחור אותו, מה שגרם להופעת תיבת תלת-ממד אדומה.בעת שימוש במצב זה, שלוט בסיבוב ערכת הנתונים באמצעות עכבר. לאחר הבטחת המיקום המושלם של העובר, בחרו 'עריכה', 'שנה צורה של התמונה' ו'ייצוא תמונה שעברה שינוי צורה בחלון 'מציג התלת-ממד'. בדוק את המישורים האורתוגונליים השונים ולאחר מכן עבור לתמונה ולאחר מכן הערם ובחר תצוגות אורתוגונליות.כשהעובר ממוקם כראוי, בחרו בתפריט החלון 'מציג התלת-ממד' ולאחר מכן ערכו, שינו ושמרו מטריצת המרה לקובץ טקסט עם סיומת מחצלת. פתח את קובץ הטקסט באמצעות Fiji/ImageJ, הסר את שתי השורות הראשונות ושמור מחדש. פעולה זו יוצרת קובץ מטריצת המרה התואם לתוסף TransformJ.עברו לערכת הנתונים ברזולוציה מלאה ובצעו את תוספי הפעולה TransformJ ו-TransformJ affine. בחלון החדש, אתר כדי לחפש את קובץ המטריצה שנשמר בעבר, בחר את האינטרפולציה הקובית B-spline ודגום מחדש איזוטרופית ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מיקום מחדש כראוי של העובר, חתוך את רוב השטח הריק שנוצר. כדי לבצע תמונת הקרנת Z מלאה, לחץ על ערימות, Z Project ובחר בעוצמה מרבית.לאחר מכן צייר את ההחזר המינימלי המכיל את העובר כולו ב- X ו- Y.עבור לחלונות התמונה המקוריים של ערכת הנתונים על-ידי לחיצה על עריכה, בחירה, שחזור בחירה וחיתוך על-ידי בחירת תמונה. חותכים את הפרוסות בהתחלה ובסוף שאינן מצטלבות רקמות עובר על ידי בחירת תמונה ופתיחת ערימות, לחץ על כלים, בחר את מסיר הפרוסה וציין את הפרוסה הראשונה והאחרונה להסרה, תוך הקפדה על שינוי ההפרש הקבוע לאחת. אם תרצה, בצע ניתוח נוסף ושחזורים תלת-ממדיים באמצעות ההוראות בכתב היד של הטקסט.כדי לבצע ניתוח תלת-ממדי של עוברים מפותחים יותר, לנתח עוברים עובריים 18.5 עוברים ב- PBS קר, להסיר את כל הממברנות העובריות הנוספות, ולאחר מכן לשטוף את העוברים מספר פעמים PBS טרי כדי להסיר דם ופסולת המיוצרים במהלך הליך הנתיחה. לתקן עוברים ב 4%PFA עשה PBS בארבע מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים. לאחר שטיפת העובר מספר פעמים ב- PBS, לייבש את העוברים על ידי דגירה ב 10%10 עליות רצופות של פתרונות מתנול עד 100% מתנול הוא הגיע.בצע כל דגירה במשך 25 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לדגור עוברים בנפרד על שייקר הראשון ליום אחד ב 5% מי חמצן במתנול ולאחר מכן ב 10% מי חמצן במתנול עד שלושה ימים עד העוברים לאבד את כל פיגמנטציה טבעית. בהדרגה rehydrate העוברים בסדרת מתנול הפוכה במים demineralized עם כל דגירה במשך 20 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את העוברים שלוש פעמים במשך 30 דקות לכל לשטוף במים demineralized.כדי להטמיע עוברים בבלוקים של 1%agarose, מלא צינור פלסטיק 50 מיליליטר או מזרק עם אגרווז מומס, ולאחר מכן למקם את העובר באגרוז במצב אנכי ולשמור על עמדה זו עם מלקחיים במהלך התגבשות של האגרוז. מניחים את התבנית עם הבלוק על ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עבור agarose כדי להתגמש במלואו, ולאחר מכן להסיר את בלוק agarose עם העובר מן התבנית ומניחים אותו במיכל עם מים מיואשים. בצע התייבשות העובר בהדרגה עם 10% עליות בריכוז מתנול מדולל במים demineralized או PBS, שמירה על המדגם בריכוז מתנול לפחות 45 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר עד 100% מתנול הוא הגיע.לנקות את העוברים על ידי העברתם דרך פתרון BABB סדרה מתנול במשך 2.5 שעות בכל ריכוז עם 25% עליות בריכוז BABB עד שהגיע 100% BABB. החליפו את תמיסת BABB בתמיסה טרייה מדי יום עד שהעובר יהיה שקוף לחלוטין. תהליך זה עשוי להימשך שלושה עד חמישה ימים.השתמש בדבק כדי לצרף את בלוק האגרוז המנוקה לציר המנוע של סורק OPT, ולאחר מכן התאם את האופטיקה כדי לקבל תמונה של העובר כולו ולהמשיך לרכוש ערכת נתוני הקרנה מלאה. טכניקת ההדמיה החיה 4D מאפשרת ניתוח דינמי של ביטוי כתב LuVeLu ועוברי יום עוברי 8.5 Snai1-מותנה נוקאאוט עוברי. יחד עם האות הרגיל LuVeLu על mesoderm presomitic, עוברי נוקאאוט מותנה Snai1 מציגים ביטוי LuVeLu בבליטה חוץ רחמית הנובעת מהפס הפרימיטיבי.בדיקות אימונופלואורסצנטיות בהר שלם מאפשרות זיהוי של NMPs פוטנציאליים ורגולטורים מרכזיים של בידול mesoderm. חצים לבנים וצהובים מדגישים הבדלים בעוברים המוטנטים והפראיים. עיבוד תלת מימדי של חיסוני הר שלם מאפשר הבנה טובה יותר של הרקמה או המבנה במחקר.במקרה זה, המיקום של NMPs פוטנציאליים ב bud tail ניצן נחקר. שחזורי רקמות תלת-ממדיים חשובים גם כדי להבין ולאפיין פגמים מורפולוגיים בעוברי עכבר. ויזואליזציה אינטראקטיבית של שחזור תלת-ממד יכולה להיבנות גם בפורמטים ידידותיים למשתמש.לדוגמה, בקובץ PDF. מבנים עובריים תלת-ממדיים אלה יכולים לשמש כדי להמחיש את העוצמה של מודלים תלת-ממדיים לקהל כללי יותר ולעזור במחקר בהוראת התארכות צירית של בעלי חוליות וסגמנטציה. לבסוף, 3D בהדמיית טוטו של עוברי עכבר מפותחים יותר אפשרי באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה OTP.עיבודים מונפשים מוצגים כאן, המדגישים פרוסות מפתח של עוברים ביום העוברי 18.5. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי התוצאה חייבת להישאר ייצוג נאמן של מה שנצפה בעובר. חוקרים יכולים להשתמש בשיטות אלה כדי ללכת מעבר להצגת רק סטטי לתמונות, אבל גם לכלול קטעי וידאו, שחזורים תלת ממדיים, ואפילו מודלים תלת-ממדיים אינטראקטיביים של הנתונים שלהם.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

אקס תרבות Vivo של בלוע קשתות לחקר תאי אב לב ושרירים והנישה שלהם

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...