Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
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Vorremmo ringraziare Olivier Pourquié e Alexander Aulehla per il ceppo reporter LuVeLu, il laboratorio SunJin per il campione di test RapiClear, Hugo Pereira per l'aiuto con BigStitcher, Nuno Granjeiro per aver contribuito a configurare l'apparato di imaging dal vivo, la struttura per animali IGC e i membri passati e presenti del laboratorio Mallo per commenti utili e supporto nel corso di questo lavoro.
Ringraziamo il supporto tecnico dell'Advanced Imaging Facility di IGC, che è supportato dal finanziamento portoghese ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinanziato dal Programma operativo regionale di Lisbona (Lisboa 2020), nell'ambito dell'accordo di partenariato Portogallo 2020, attraverso il Fondo europeo di sviluppo regionale (FEDER) e Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portogallo). Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato supportato dalle sovvenzioni LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portogallo) e SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portogallo) a M.M., l'infrastruttura di ricerca Congento, il progetto LISBOA-01-0145-FEDER-022170 e la borsa di dottorato PD / BD / 128426/2017 ad A.D.

Gli esperimenti che coinvolgono animali hanno seguito le legislazioni portoghese (Portaria 1005/92) ed europea (direttiva 2010/63/UE) in materia di alloggio, allevamento e benessere. Il progetto è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico dell'Instituto Gulbenkian de Ciência e dall'Ente Nazionale Portoghese ,Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (riferimento di licenza: 014308).
1. Preparazione del campione per l'imaging 3D e 4D
NOTA: Qui forniamo u...

L'allungamento assiale e la segmentazione sono due dei processi più complessi e dinamici che si verificano durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati. L'uso dell'imaging 3D e 4D con tracciamento monocellulare è stato applicato, da tempo, per studiare questi processi sia negli embrioni di zebrafish che di pollo, per i quali l'accessibilità e le condizioni di coltura facilitano l'imaging complesso 19,44,45,46,47,48,49</...

La formazione dell'asse del corpo dei vertebrati è un processo altamente complesso e dinamico che si verifica durante lo sviluppo embrionale. Alla fine della gastrulazione [nel topo, intorno al giorno embrionale (E) 8.0], un gruppo di cellule progenitrici epiblastiche note come progenitori neuromesodermici (NMP) diventa un fattore chiave dell'estensione assiale in una sequenza testa a coda, generando il tubo neurale e i tessuti mesodermici paraassiali durante la formazione del collo, del tronco e della coda 1,2,3,4 . È interessante notare che la posizione che questi NMP occupano nell'epiblasto caudale sembra svolgere un ruolo chiave nella decisione di differenziarsi in mesoderma o neuroectoderma5. Sebbene attualmente non ci sia un'impronta molecolare precisa per le NMP, queste cellule sono generalmente ritenute co-espressive T (Brachyury) e Sox2 5,6. I meccanismi esatti che regolano le decisioni sul destino dell'NMP (cioè se prendono vie neurali o mesodermiche) stanno solo iniziando a essere definiti con precisione. L'espressione di Tbx6 nella regione della striscia primitiva è un marcatore precoce della decisione del destino NMP, poiché questo gene è coinvolto nell'induzione e nella specificazione del mesoderma 6,7. È interessante notare che le prime cellule del mesoderma sembrano esprimere alti livelli di Epha18 e la segnalazione Wnt / β-catenina, così come Msgn1 hanno anche dimostrato di svolgere ruoli importanti nella differenziazione del mesoderma paraassiale e nella formazione di somiti 9,10. Un'analisi spazio-temporale completa delle NMP a livello di singola cellula sarà certamente strumentale per comprendere appieno i meccanismi molecolari che controllano la specifica del mesoderma.
La formazione di somiti (precursori delle vertebre) è una caratteristica chiave dei vertebrati. Durante l'allungamento assiale, il mesoderma paraassiale viene segmentato in una serie di unità ripetute bilaterali note come somiti. Il numero di somiti e il tempo necessario per la formazione di nuovi segmenti varia tra le specie11,12. La somitogenesi comporta oscillazioni periodiche di segnalazione (note come "orologio di segmentazione") che possono essere osservate dall'espressione ciclica di diversi geni delle vie di segnalazione Notch, Wnt e Fgf nel mesoderma presomitico (ad esempio, Lfng)11,12. L'attuale modello di somitogenesi postula anche l'esistenza di un "fronte d'onda di maturazione", una serie di complessi gradienti di segnalazione che coinvolgono la segnalazione di Fgf, Wnt e acido retinoico che definiscono la posizione del bordo posteriore di ogni nuovo somite. Un'interazione coordinata tra il "segmentation clock" e il "fronte d'onda di maturazione" è quindi fondamentale per la generazione di questi moduli precursori delle vertebre in quanto le perturbazioni in questi processi morfogenetici chiave possono provocare letalità embrionale o la formazione di malformazioni congenite (ad esempio, scoliosi)13,14,15.
Nonostante i recenti progressi sostanziali nelle tecniche di imaging, nei metodi di analisi delle bioimmagini e nel software, la maggior parte degli studi sull'allungamento assiale e sulla somitogenesi si basano ancora su dati di immagini bidimensionali singole / isolate (ad esempio, sezioni), che non consentono una visualizzazione completa del tessuto multidimensionale e complicano una chiara differenziazione tra malformazioni patologiche (cioè dovute a mutazioni) rispetto alla normale variazione morfologica che si verifica durante lo sviluppo embrionale16 . L'imaging in 3D ha già scoperto nuovi movimenti morfogenetici, precedentemente non identificati con i metodi 2D standard 17,18,19,20, evidenziando il potere dell'imaging in toto per comprendere i meccanismi della somitogenesi dei vertebrati e dell'estensione assiale.
La microscopia 3D e 4D di embrioni di topo, in particolare l'imaging dal vivo, è tecnicamente impegnativa e richiede passaggi critici durante la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini e la pre-elaborazione dei dati al fine di consentire un'analisi spazio-temporale accurata e significativa. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'imaging dal vivo e la colorazione dell'immunofluorescenza a montaggio intero degli embrioni di topo, che può essere utilizzato per studiare sia le NMP che le cellule mesodermiche durante l'estensione e la segmentazione assiale. Inoltre, descriviamo anche un protocollo per la tomografia a proiezione ottica (OPT) di embrioni e feti più anziani, che consente la visualizzazione 3D in toto e la quantificazione di anomalie patologiche che possono derivare da problemi durante la somitogenesi (ad esempio, fusione ossea e scoliosi)13,21,22. Infine, illustriamo la potenza delle ricostruzioni di imaging 3D nello studio e nell'insegnamento della segmentazione dei vertebrati e dell'allungamento assiale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

La somitogenesi è un segno distintivo dello sviluppo embrionale dei vertebrati. Per anni, i ricercatori hanno studiato questo processo in una varietà di organismi utilizzando una vasta gamma di tecniche che comprendono approcci ex vivo e in vitro. Tuttavia, la maggior parte degli studi si basa ancora sull'analisi dei dati di imaging bidimensionali (2D), che limita la corretta valutazione di un processo di sviluppo come l'estensione assiale e la somitogenesi che coinvolgono interazioni altamente dinamiche in uno spazio 3D complesso. Qui descriviamo le tecniche che consentono l'acquisizione di immagini dal vivo del topo, l'elaborazione di set di dati, la visualizzazione e l'analisi in 3D e 4D per studiare le cellule (ad esempio, progenitori neuromesodermici) coinvolte in questi processi di sviluppo. Forniamo anche un protocollo passo-passo per la tomografia a proiezione ottica e la microscopia a immunofluorescenza a montaggio intero in embrioni di topo (dalla preparazione del campione all'acquisizione di immagini) e mostriamo una pipeline che abbiamo sviluppato per elaborare e visualizzare i dati delle immagini 3D. Estendiamo l'uso di alcune di queste tecniche ed evidenziamo caratteristiche specifiche di diversi software disponibili (ad esempio, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) che possono essere utilizzate per migliorare la nostra attuale comprensione dell'estensione assiale e della formazione di somiti (ad esempio, ricostruzioni 3D). Complessivamente, le tecniche qui descritte sottolineano l'importanza della visualizzazione e dell'analisi dei dati 3D nella biologia dello sviluppo e potrebbero aiutare altri ricercatori ad affrontare meglio i dati delle immagini 3D e 4D nel contesto dell'estensione e della segmentazione assiale dei vertebrati. Infine, il lavoro impiega anche nuovi strumenti per facilitare l'insegnamento dello sviluppo embrionale dei vertebrati.

I risultati rappresentativi mostrati in questo documento sia per l'imaging vivo che per l'imaging a immunofluorescenza, sono stati ottenuti utilizzando un sistema a due fotoni, con un obiettivo acquatico da 20 × 1,0 NA, il laser di eccitazione sintonizzato su 960 nm e fotorivelatori GaAsP (come descritto in Dias et al. (2020) 43. La tomografia a proiezione ottica è stata eseguita utilizzando uno scanner OPenT costruito su misura (come descritto in Gualda et al. (2013)28.<...

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Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Qui descriviamo strumenti e metodi computazionali che consentono la visualizzazione e l'analisi di dati di immagini tridimensionali e quadridimensionali di embrioni di topo nel contesto dell'allungamento e della segmentazione assiale, ottenuti mediante tomografia a proiezione ottica in toto e mediante imaging dal vivo e colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero utilizzando la microscopia multifotonica.

Approcci di visualizzazione e analisi tridimensionali e quadridimensionali per studiare l'allungamento e la segmentazione assiale dei vertebrati

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Le fasi di organogenesi negli embrioni di topo rimangono scarsamente studiate in parte a causa della difficile visualizzazione delle strutture complesse embrionali. Questo protocollo descrive le tecniche che consentono la visualizzazione e l'analisi 3D e 4D degli embrioni di topo durante l'estensione e la segmentazione assiale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di studiare e mostrare le complesse strutture dell'embrione di topo come oggetti dinamici 3D.Questo protocollo contiene tecniche che possono essere utilizzate nello studio delle malformazioni congenite che colpiscono la vertebra e il midollo spinale dei mammiferi, come la scoliosi. Queste tecniche possono essere utilizzate anche con sistemi modello in vitro, consentendo così lo studio dello sviluppo embrionale umano. Per preparare gli embrioni di topo tra il giorno embrionale 8.25 e il giorno embrionale 10.5 per l'imaging dal vivo, sezionare gli embrioni in mezzo M2 preriscaldato a 37 gradi Celsius.Rimuovere delicatamente il sacco vitellino con una pinza pulita e lavare l'embrione una volta con un mezzo M2 fresco per rimuovere il sangue e i detriti prodotti durante la dissezione. Durante la procedura di imaging dal vivo, incubare embrioni in mezzo DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con FBS definito 10% HyClone, due L-glutammina millimolare e 1% penicillina streptomicina in una camera riscaldata a 37 gradi Celsius e un 65% di ossigeno con il 5% di anidride carbonica. Per preparare embrioni di topo allo stadio simile per la microscopia a immunofluorescenza, invece di usare M2 riscaldato, sezionare gli embrioni in PBS freddo e fissare in paraformaldeide al 4%.Dopo aver eseguito l'intero protocollo di colorazione dell'immunofluorescenza come descritto nel manoscritto di testo, la clearance dei tessuti può essere ottenuta utilizzando RapiClear. In primo luogo, posizionare gli embrioni al centro di un vetrino concavo di depressione da 75 per 25 millimetri, rimuovere tutto il PBST nel vetrino di depressione del microscopio e aggiungere 200 microlitri di soluzione di compensazione, quindi coprire la preparazione del vetrino con una scatola. Dopo 10 minuti protetti dalla luce, quando gli embrioni iniziano a diventare trasparenti, sostituire la soluzione di compensazione e attendere altri 20 minuti.Coprire l'embrione con una coverslip partendo da un lato e muovendosi delicatamente verso l'altro. Il campione è ora pronto per l'imaging. Per la pulizia utilizzando metil salicilato o BABB, assicurarsi che gli embrioni siano completamente disidratati in metanolo al 100% e quindi iniziare la serie di BABB e metanolo con aumenti di concentrazione successivi del 20% e un'incubazione di 20 minuti per ogni fase.Quando la soluzione BABB raggiunge il 100%, apportare due modifiche aggiuntive per una nuova soluzione. Preparare un vetrino di copertura da 20 per 60 millimetri 1,5 per montare gli embrioni per evitare di comprimere il campione. Aggiungi distanziali realizzati con sottili rondelle metalliche.Trasferire gli embrioni eliminati sui vetrini del microscopio usando uno stuzzicadenti, una punta di cotone fine o una pipetta Pasteur. Quindi aggiungere una goccia di mezzo di montaggio, coprire con un altro vetro di copertura simile e sigillare con paraffina fusa per stabilizzare meglio la preparazione per evitare bolle. Posizionare il coverslip su un lato e poi farlo scorrere gradualmente e delicatamente lateralmente, aggiungendo altro mezzo se necessario.Il campione è ora pronto per essere ripreso al microscopio. Utilizzare Fiji/ImageJ per riposizionare l'embrione in una posizione standardizzata dell'asse anteriore-posteriore e dorsale-ventrale dopo l'imaging. Riduci le dimensioni del set di dati nell'immagine delle Figi, quindi ridimensiona e inserisci i valori di scala X, Y e Z necessari per ridurre il set di dati a meno di 200 megabyte.Assicurati che l'opzione Crea nuova finestra sia selezionata. Quindi vai ai plugin e apri 3D Viewer. All'interno della finestra del Visualizzatore 3D, fai clic sull'embrione per selezionarlo, facendo apparire una casella 3D rossa.Quando si utilizza questa modalità, controllare la rotazione del set di dati con un mouse. Dopo aver assicurato la posizione perfetta dell'embrione, selezionare modifica, trasformare l'immagine ed esportare l'immagine trasformata nella finestra del Visualizzatore 3D. Ispeziona i diversi piani ortogonali, quindi vai all'immagine, quindi impila e seleziona le viste ortogonali.Quando l'embrione è posizionato correttamente, selezionare il menu della finestra visualizzatore 3D, quindi modificare, trasformare e salvare la matrice di trasformazione in un file di testo con estensione mat. Apri il file di testo usando Fiji/ImageJ, rimuovi le prime due righe e salva di nuovo. Questo crea un file matrice di trasformazione compatibile con il plugin TransformJ.Passare al set di dati a piena risoluzione ed eseguire l'operazione plugin TransformJ e TransformJ affine. Nella nuova finestra, cercare il file della matrice precedentemente salvato, selezionare l'interpolazione cubica B-spline e ricampionare isotropicamente, quindi fare clic su OK. Dopo aver riposizionato correttamente l'embrione, tagliare la maggior parte dello spazio vuoto creato. Per eseguire un'immagine di proiezione Z completa, fare clic su stack, Z Project e scegliere l'intensità massima.Quindi disegna il ROI minimo che contiene l'intero embrione in X e Y.Passa alle finestre dell'immagine del set di dati originale facendo clic su modifica, selezione, ripristina selezione e ritaglia selezionando l'immagine. Taglia le fette all'inizio e alla fine che non intersecano i tessuti embrionali selezionando l'immagine e aprendo le pile, fai clic sugli strumenti, seleziona il dispositivo di rimozione delle sezioni e specifica la prima e l'ultima fetta da rimuovere, assicurandoti di cambiare l'incremento in uno. Se lo si desidera, eseguire ulteriori analisi e ricostruzioni 3D utilizzando le istruzioni nel manoscritto di testo.Per eseguire l'analisi 3D di embrioni più sviluppati, sezionare feti embrionali giorno 18,5 in PBS freddo, rimuovere tutte le membrane embrionali extra, quindi lavare i feti più volte in PBS fresco per rimuovere sangue e detriti prodotti durante la procedura di dissezione. Fissare i feti in 4% PFA fatto in PBS a quattro gradi Celsius per cinque o sette giorni. Dopo aver lavato l'embrione più volte in PBS, disidratare i feti incubando nel 10%10 aumenti successivi di soluzioni di metanolo fino a raggiungere il 100% di metanolo.Eseguire ogni incubazione per 25 minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Successivamente, incubare i feti separatamente su uno shaker prima per un giorno in perossido di idrogeno al 5% in metanolo e poi in perossido di idrogeno al 10% in metanolo per un massimo di tre giorni fino a quando gli embrioni perdono tutta la pigmentazione naturale. Reidratare gradualmente gli embrioni in una serie di metanolo inversa in acqua demineralizzata con ogni incubazione per 20 minuti su uno shaker a temperatura ambiente, quindi lavare gli embrioni tre volte per 30 minuti per lavaggio in acqua demineralizzata.Per incorporare i feti in blocchi di agarosio all'1%, riempire un tubo di plastica da 50 millilitri o una siringa con agarosio fuso, quindi posizionare il feto nell'agarosio in posizione verticale e mantenere questa posizione con una pinza durante la solidificazione dell'agarosio. Posizionare lo stampo con il blocco a quattro gradi Celsius per 30 minuti affinché l'agarosio si gelatini completamente, quindi rimuovere il blocco di agarosio con il feto dallo stampo e metterlo in un contenitore con acqua demoralizzata. Eseguire la disidratazione del feto gradualmente con aumenti del 10% della concentrazione di metanolo diluito in acqua demineralizzata o PBS, mantenendo il campione in concentrazione di metanolo per almeno 45 minuti a temperatura ambiente su uno shaker fino al raggiungimento del 100% di metanolo.Eliminare i feti spostandoli attraverso una soluzione babbana in serie e metanolo per 2,5 ore in ogni concentrazione con aumenti del 25% della concentrazione di BABB fino a raggiungere il 100% di BABB. Sostituire la soluzione BABB con una nuova ogni giorno fino a quando il feto non è completamente trasparente. Questo processo potrebbe richiedere da tre a cinque giorni.Utilizzare la colla per collegare il blocco di agarosio eliminato all'asse motore dello scanner OPT, quindi regolare l'ottica per ottenere un'immagine dell'intero feto e procedere all'acquisizione di un set di dati di proiezione completo. La tecnica di live imaging 4D consente l'analisi dinamica dell'espressione del reporter LuVeLu e degli embrioni embrionali knockout condizionati al giorno 8.5 Snai1. Insieme al normale segnale LuVeLu sul mesoderma presomitico, gli embrioni knockout condizionali Snai1 mostrano l'espressione LuVeLu nel rigonfiamento ectopico che deriva dalla striscia primitiva.I saggi di immunofluorescenza a montaggio intero consentono il rilevamento di potenziali NMP e regolatori chiave della differenziazione del mesoderma. Le frecce bianche e gialle evidenziano le differenze negli embrioni mutanti e selvatici. La renderizzazione 3D di immunocolori a montaggio intero consente una migliore comprensione del tessuto o della struttura nello studio.In questo caso, è stata studiata la posizione di potenziali NMP nel bocciolo della coda. Le ricostruzioni tissutali 3D sono anche importanti per comprendere e caratterizzare i difetti morfologici negli embrioni di topo. La visualizzazione interattiva della ricostruzione 3D può anche essere costruita in formati user-friendly.Ad esempio, in un file PDF. Queste strutture caudali embrionali 3D possono essere utilizzate per illustrare la potenza dei modelli 3D a un pubblico più generale e per aiutare nello studio nell'insegnamento dell'allungamento e della segmentazione assiale dei vertebrati. Infine, la visualizzazione 3D in toto di embrioni di topo più sviluppati è possibile utilizzando la tecnica di microscopia OTP.I rendering animati sono mostrati qui, evidenziando le fette chiave dei feti embrionali del giorno 18.5. La cosa più importante da ricordare è che il risultato deve rimanere una rappresentazione fedele di ciò che si osserva nell'embrione. I ricercatori possono utilizzare questi metodi per andare oltre la presentazione solo statica alle immagini, ma includono anche video, ricostruzioni tridimensionali e persino modelli 3D interattivi dei loro dati.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

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Ex Cultura Vivo del faringea Archi allo Studio cuore e muscoli Progenitori e la loro nicchia

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Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

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