Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
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LuVeLu 기자 균주에 대한 Olivier Pourquié와 Alexander Aulehla, RapiClear 테스트 샘플의 SunJin 실험실, BigStitcher를 사용하여 도움을 주신 Hugo Pereira, 라이브 이미징 장치, IGC 동물 시설 및 Mallo 실험실의 과거와 현재 구성원에게 유용한 의견과 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.
포르투갈 기금 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 및 ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017이 지원하는 IGC의 고급 이미징 시설의 기술 지원에 감사 드리며, 포르투갈 2020 파트너십 계약에 따라 유럽 지역 개발 기금 (FEDER) 및 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, 포르투갈)를 통해 Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020)이 공동 자금을 지원합니다. 이 원고에 설명 된 작업은 LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, 포르투갈) 및 SCML-MC-60-2014 (포르투갈 산타 카사 다 미세 리코 디아)를 M.M., 연구 인프라 Congento, 프로젝트 LISBOA-01-0145-FEDER-022170 및 박사 학위 펠로우십 PD / BD / 128426 / 2017을 A.D.에 부여함으로써 지원되었습니다.

동물과 관련된 실험은 주택, 축산 및 복지에 관한 포르투갈 (Portaria 1005/92) 및 유럽 (지침 2010 / 63 / EU) 법률을 따랐습니다. 이 프로젝트는 'Instituto Gulbenkian de Ciência'의 윤리위원회와 포르투갈 국가 단체 인 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária'(라이센스 참조 : 014308)에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비
참고: 여기서는 라이브...

축 신장과 세분화는 척추 동물 배아 발달 중에 발생하는 가장 복잡하고 역동적 인 과정 중 두 가지입니다. 단일 세포 추적과 함께 3D 및 4D 이미징의 사용은 한동안 제브라 피쉬와 닭 배아 모두에서 이러한 과정을 연구하기 위해 적용되었으며, 접근성과 배양 조건은 복잡한 이미징을 용이하게합니다 19,44,45,46,47,48,49 <sup c...

척추 동물의 체축 형성은 배아 발달 중에 발생하는 매우 복잡하고 역동적 인 과정입니다. 위축이 끝날 때 [마우스에서, 배아 일 (E) 8.0 전후], 신경 중배엽 선조 (NMPs)로 알려진 에피아세포 전구 세포 그룹이 머리에서 꼬리 서열에서 축 방향 확장의 핵심 동인이되어 목, 몸통 및 꼬리 형성 중에 신경관과 동축 중배엽 조직을 생성합니다 1,2,3,4 . 흥미롭게도, 이러한 NMP가 인과성 표피세포에서 차지하는 위치는 중배엽 또는 신경외배엽(neuroectoderm5)으로 분화하는 결정에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 우리는 현재 NMP에 대한 정확한 분자 지문이 부족하지만, 이들 세포는 일반적으로 T (Brachyury)와 Sox2 5,6을 공동 발현하는 것으로 생각된다. NMP 운명 결정을 조절하는 정확한 메커니즘 (즉, 신경 또는 중배엽 경로를 취하는지 여부)은 정확하게 정의되기 시작했습니다. 원시적 줄무늬 영역에서의 Tbx6 발현은 NMP 운명 결정의 초기 마커이며, 이 유전자는 중배엽 6,7의 유도 및 사양에 관여하기 때문이다. 흥미롭게도, 초기 중배엽 세포는 높은 수준의 Epha18을 발현하는 것으로 보이며, Wnt/β-catenin 신호전달뿐만 아니라 Msgn1도 역축성 중배엽 분화 및 소마이트 형성 9,10에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 단일 세포 수준에서 NMP에 대한 완전한 공간적 시간 분석은 중배엽 사양을 제어하는 분자 메커니즘을 완전히 이해하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.
somites (척추 전구체)의 형성은 척추 동물의 주요 특징입니다. 축 신장 동안, 역축 중배엽은 somites로 알려진 일련의 양측 반복 단위로 분할된다. somite의 수와 새로운 세그먼트의 형성에 필요한 시간은 종11,12에 따라 다릅니다. 소미토제네시스는 전소미성 중배엽(예를 들어, Lfng)11,12에서 Notch, Wnt 및 Fgf 신호전달 경로의 몇몇 유전자의 순환 발현에 의해 관찰될 수 있는 주기적 신호전달 진동("세그멘테이션 클록"으로 알려짐)을 수반한다. somitogenesis의 현재 모델은 또한 각각의 새로운 소마이트의 후부 경계의 위치를 정의하는 Fgf, Wnt 및 레티노산 신호 전달을 포함하는 일련의 복잡한 신호 구배인 "성숙 파면"의 존재를 가정한다. 따라서 "세분화 시계"와 "성숙 파면" 사이의 조율된 상호작용은 이러한 주요 형태형성 과정의 교란이 배아 치사율 또는 선천성 기형(예를 들어, 척추측만증)의 형성을 초래할 수 있기 때문에 이러한 척추 전구체 모듈의 생성에 필수적이다(예를 들어, 척추측만증)13,14,15.
이미징 기술, 생체 영상 분석 방법 및 소프트웨어의 상당한 최근 발전에도 불구하고, 축 신장 및 소미토제네시스에 대한 대부분의 연구는 여전히 단일 / 분리 된 이차원 이미지 데이터 (예 : 섹션)에 의존하고 있으며, 이는 완전한 다차원 조직 시각화를 허용하지 않으며 병리학 적 기형 (즉, 돌연변이로 인한) 대 배아 발달 중에 발생하는 정상적인 형태 학적 변화 사이의 명확한 분화를 복잡하게 만듭니다16 . 3D에서의 이미징은 이전에 표준 2D 방법17,18,19,20에 의해 확인되지 않은 새로운 형태 유전 학적 움직임을 이미 밝혀 냈으며, 척추 동물 소미토제네시스 및 축 방향 확장의 메커니즘을 이해하기 위해 토토 이미징의 힘을 강조합니다.
마우스 배아의 3D 및 4D 현미경 검사, 특히 라이브 이미징은 기술적으로 어려운 일이며 정확하고 의미있는 시공간 분석을 위해 샘플 준비, 이미지 수집 및 데이터 전처리 중에 중요한 단계가 필요합니다. 여기에서, 우리는 축 확장 및 분절 동안 NMP 및 중배엽 세포 모두를 연구하는데 사용될 수 있는 마우스 배아의 살아있는 이미징 및 전체 마운트 면역형광 염색을 위한 상세한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 또한 오래된 배아 및 태아의 광학 투영 단층 촬영 (OPT)을위한 프로토콜을 설명하는데, 이는 소밀 토제이 (예를 들어, 뼈 융합 및 척추 측만증) 동안 문제로 인해 발생할 수있는 병리학 적 이상을 시각화하고 정량화하는 토토에서 3D를 허용합니다 13,21,22. 마지막으로, 우리는 척추 동물 세분화 및 축 신장에 대한 연구와 교육에서 3D 이미징 재구성의 힘을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

Somitogenesis는 척추 동물 배아 발달의 특징입니다. 수년 동안 연구자들은 생체외 및 시험관 내 접근법을 포괄하는 광범위한 기술을 사용하여 다양한 유기체에서이 과정을 연구해 왔습니다. 그러나 대부분의 연구는 여전히 2차원(2D) 이미징 데이터의 분석에 의존하고 있으며, 이는 복잡한 3D 공간에서 매우 역동적인 상호작용을 수반하는 축방향 확장 및 소미토제네시스와 같은 발달 과정에 대한 적절한 평가를 제한합니다. 여기서는 마우스 라이브 이미징 획득, 데이터 세트 처리, 시각화 및 분석을 3D 및 4D로 하여 이러한 발달 과정에 관여하는 세포(예: 신경중배엽 선조)를 연구할 수 있는 기술을 설명합니다. 우리는 또한 마우스 배아에서 광학 프로젝션 단층 촬영 및 전체 마운트 면역 형광 현미경 검사 (샘플 준비에서 이미지 수집까지)를위한 단계별 프로토콜을 제공하고 3D 이미지 데이터를 처리하고 시각화하기 위해 개발 한 파이프 라인을 보여줍니다. 우리는 이러한 기술 중 일부의 사용을 확장하고 축 방향 확장 및 소마이트 형성 (예 : 3D 재구성)에 대한 현재의 이해를 향상시키는 데 사용할 수있는 다양한 사용 가능한 소프트웨어 (예 : 피지 / ImageJ, Drishti, Amira 및 Imaris)의 특정 기능을 강조합니다. 전체적으로 여기에 설명 된 기술은 발달 생물학에서 3D 데이터 시각화 및 분석의 중요성을 강조하며 다른 연구자가 척추 동물 축 확장 및 세분화의 맥락에서 3D 및 4D 이미지 데이터를보다 잘 다루는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로,이 연구는 또한 척추 동물 배아 발달을 가르치기 위해 새로운 도구를 사용합니다.

살아있는 및 면역형광 이미징 둘 다에 대해 본 논문에 나타난 대표적인 결과는, 20 × 1.0 NA 물 목표물, 960 nm로 튜닝된 여기 레이저, 및 GaAsP 광검출기 (Dias et al. (2020)43에 기재된 바와 같이)를 갖는 이광자 시스템을 사용하여 수득되었다. 광학 프로젝션 단층 촬영은 맞춤형 OPenT 스캐너를 사용하여 수행되었다 (Gualda et al. (2013)28에 기재된 바와 같이).
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Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

마우스 배아의 유기 생성 단계는 배아 복합체 구조의 어려운 시각화로 인해 부분적으로 제대로 연구되지 않은 채로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 축 방향 확장 및 세분화 중에 마우스 배아의 3D 및 4D 시각화 및 분석을 허용하는 기술을 설명합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 연구자가 마우스 배아의 복잡한 구조를 3D 동적 개체로 연구하고 보여줄 수 있다는 것입니다.이 프로토콜은 척추측만증과 같은 포유동물의 척추 및 척수에 영향을 미치는 선천성 기형의 연구에 사용될 수 있는 기술을 포함하고 있다. 이들 기술은 또한 시험관내 모델 시스템과 함께 사용될 수 있으며, 따라서 인간 배아 발달에 대한 연구를 허용한다. 생생 영상화를 위해 배아 8.25일째와 배아 10.5일 사이에 마우스 배아를 준비하려면, 섭씨 37도에서 미리 예열된 M2 배지에서 배아를 해부한다.깨끗한 포셉을 사용하여 노른자 낭을 부드럽게 제거하고 신선한 M2 배지로 배아를 한 번 씻어 해부 중에 생성 된 혈액과 이물질을 제거하십시오. 라이브 이미징 절차 동안, 배아를 섭씨 37도 가열된 챔버 및 5%이산화탄소 환경을 갖는 65%산소에서 10%HyClone 정의 FBS, 2밀리몰 L-글루타민 및 1%페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 저글루코스 DMEM 배지에서 배양한다. 면역 형광 현미경을 위해 유사한 단계의 마우스 배아를 제조하기 위해 가열 된 M2를 사용하는 대신 차가운 PBS에서 배아를 해부하고 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오.텍스트 원고에 기재된 바와 같이 전체 마운트 면역형광 염색 프로토콜을 수행한 후, RapiClear를 사용하여 조직 클리어런스를 달성할 수 있다. 먼저, 배아를 75 x 25 밀리미터 함몰 오목 유리 슬라이드의 중앙에 놓고 현미경 우울증 슬라이드의 모든 PBST를 제거하고 200 마이크로 리터의 클리어링 용액을 첨가 한 다음 슬라이드 준비를 상자로 덮으십시오. 빛으로부터 10 분 보호 한 후, 배아가 투명해지기 시작하면 개간 용액을 교체하고 추가로 20 분을 기다리십시오.한쪽에서 시작하여 다른 쪽으로 부드럽게 움직이는 커버 슬립으로 배아를 꼭대기에 올려 놓습니다. 이제 샘플을 이미징할 준비가 되었습니다. 메틸 살리실레이트 또는 BABB를 사용하여 클리어링을 위해, 배아가 100%메탄올에서 완전히 탈수되었는지 확인한 다음, 20% 연속 농도 증가로 일련의 BABB 및 메탄올을 시작하고 각 단계에 대해 20분간 인큐베이션한다.BABB 솔루션이 100%에 도달하면 새로운 솔루션을 위해 두 가지 추가 변경을 수행합니다. 20 x 60 밀리미터 1.5 커버 글라스 슬라이드를 준비하여 배아를 장착하여 시료를 압축하지 않도록 한다. 얇은 금속 와셔로 만든 스페이서를 추가하십시오.이쑤시개, 미세한 면화 팁 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 클리어 된 배아를 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 그런 다음 장착 매체 한 방울을 추가하고 다른 유사한 커버 유리로 덮고 녹은 파라핀으로 밀봉하여 거품을 피하기 위해 준비를보다 잘 안정화하십시오. 커버 슬립을 한쪽에 놓은 다음 점차적으로 옆으로 부드럽게 밀어 필요한 경우 더 많은 매체를 추가하십시오.샘플은 이제 현미경으로 이미징 할 준비가되었습니다. 피지 / ImageJ를 사용하여 이미징 후 배아를 표준화 된 전후 및 등쪽 - 복부 축 위치로 재배치하십시오. 피지 이미지에서 데이터 세트 크기를 줄인 다음 데이터 세트를 200MB 미만으로 줄이는 데 필요한 X, Y 및 Z 배율 값을 확장하고 삽입합니다.새 창 만들기 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 플러그인으로 이동하여 3D 뷰어를 엽니 다. 3D 뷰어 창 내에서 배아를 클릭하여 선택하면 빨간색 3D 상자가 나타납니다.이 모드를 사용하는 경우 마우스로 데이터 세트의 회전을 제어합니다. 배아의 완벽한 위치를 확인한 후 편집을 선택하고 이미지를 변형하고 3D 뷰어 창에서 변환 된 이미지를 내보냅니다. 다른 직교 평면을 검사한 다음 이미지로 이동한 다음 직교 뷰를 스택하고 선택합니다.배아가 올바르게 배치되면 3D 뷰어 창 메뉴를 선택한 다음 변형 행렬을 편집, 변형 및 매트 확장자를 가진 텍스트 파일에 저장합니다. 피지 / ImageJ를 사용하여 텍스트 파일을 열고 처음 두 줄을 제거한 다음 다시 저장하십시오. 이렇게 하면 TransformJ 플러그인과 호환되는 변환 행렬 파일이 생성됩니다.전체 해상도 데이터 세트로 전환하고 작업 플러그인 TransformJ 및 TransformJ affine을 수행하십시오. 새 창에서 이전에 저장한 매트릭스 파일을 검색하고, 입방 B-스플라인 보간을 선택한 다음 등방성으로 다시 샘플링한 다음 확인을 클릭합니다. 배아의 위치를 적절하게 바꾼 후 생성 된 빈 공간의 대부분을 다듬습니다. 전체 Z 프로젝션 이미지를 수행하려면 스택, Z 프로젝트를 클릭하고 최대 강도를 선택합니다.그런 다음 X와 Y.Switch의 전체 배아를 포함하는 최소 ROI를 이미지를 선택하여 편집, 선택, 선택 복원 및 자르기를 클릭하여 원래 데이터 세트 이미지 창으로 그립니다. 이미지를 선택하고 스택을 열어 배아 조직을 교차하지 않는 슬라이스를 트리밍하고, 도구를 클릭하고, 슬라이스 제거기를 선택하고, 제거 할 첫 번째 슬라이스와 마지막 슬라이스를 지정하여 증분을 하나로 변경하십시오. 원하는 경우 텍스트 원고의 지침을 사용하여 추가 분석 및 3D 재구성을 수행하십시오.보다 발달된 배아의 3D 분석을 수행하기 위해, 차가운 PBS에서 배아 18.5일째 태아를 해부하고, 모든 여분의 배아막을 제거한 다음, 신선한 PBS에서 태아를 여러 번 세척하여 해부 과정 중에 생성된 혈액과 이물질을 제거한다. PBS로 만든 4 % PFA의 태아를 섭씨 4도에서 칠일 동안 고정하십시오. 배아를 PBS로 여러 번 세척한 후, 100%메탄올에 도달할 때까지 10%10 증가된 메탄올 용액에서 배양함으로써 태아를 탈수시킨다.실온에서 진탕기 상에서 25분 동안 각각의 인큐베이션을 수행한다. 다음으로, 태아를 메탄올 중 5% 과산화수소에서 하루 동안 먼저 진탕기에서 따로 배양한 다음, 배아가 모든 천연 색소침착을 잃을 때까지 최대 3일 동안 메탄올 중의 10% 과산화수소에서 배양한다. 역메탄올 계열의 배아를 탈염수에 서서히 재수화시키고 실온에서 진탕기에서 20분 동안 각각 배양한 다음, 탈염수로 세척당 30분 동안 배아를 3회 세척한다.태아를 1 % 아가로스 블록에 묻히려면 녹은 아가로스로 50 밀리리터 플라스틱 튜브 또는 주사기를 채운 다음 아가로스를 수직 위치에 태아를 놓고 아가로스를 응고시키는 동안 포셉으로이 위치를 유지하십시오. 블록이있는 곰팡이를 섭씨 4도에 30 분 동안 놓아 아가로스가 완전히 젤화되도록 한 다음 태아가있는 아가로스 블록을 곰팡이에서 꺼내 사기가 저하 된 물로 용기에 넣으십시오. 탈염수 또는 PBS에 희석된 메탄올 농도가 10% 증가하면서 태아 탈수를 점진적으로 수행하고, 100%메탄올에 도달할 때까지 진탕기에서 실온에서 45분 이상 동안 시료를 메탄올 농도로 유지한다.100%BABB에 도달할 때까지 BABB 농도가 25% 증가하면서 각 농도에서 2.5시간 동안 일련의 BABB 용액과 메탄올을 통해 이들을 이동시켜 태아를 맑게 한다. BABB 용액을 태아가 완전히 투명해질 때까지 매일 신선한 용액으로 교체하십시오. 이 과정은 사흘에서 오일이 걸릴 수 있습니다.접착제를 사용하여 클리어 된 아가로스 블록을 OPT 스캐너의 모터 축에 부착 한 다음 광학을 조정하여 전체 태아의 이미지를 얻고 전체 프로젝션 데이터 세트를 획득하십시오. 4D 라이브 이미징 기술은 LuVeLu 리포터 발현 및 배아 8.5일 Snai1 조건부 녹아웃 배아의 동적 분석을 가능하게 합니다. 전치산 중배엽의 정상적인 LuVeLu 신호와 함께, Snai1-conditional 녹아웃 배아는 원시적 줄무늬에서 발생하는 자궁외 팽창에서 LuVeLu 발현을 표시합니다.전체 마운트 면역형광 분석은 잠재적인 NMPs 및 중배엽 분화의 주요 조절인자의 검출을 허용한다. 흰색과 노란색 화살표는 돌연변이 및 야생형 배아의 차이를 강조합니다. 전체 마운트 면역염색의 3D 렌더링은 연구에서 조직 또는 구조를 더 잘 이해할 수 있게 합니다.이 경우, 꼬리 새싹에서 잠재적인 NMPs의 위치를 조사하였다. 3D 조직 재구성은 마우스 배아의 형태 학적 결함을 이해하고 특성화하는 데에도 중요합니다. 3D 재구성의 인터랙티브 시각화는 사용자 친화적 인 형식으로 구축 할 수도 있습니다.예를 들어, PDF 파일에서. 이러한 3D 배아 꼬리 구조는보다 일반적인 청중에게 3D 모델의 힘을 설명하고 척추 동물 축 신장 및 세분화를 가르치는 연구에 도움이되는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, OTP 현미경 기술을 이용하여 더욱 발달된 마우스 배아의 3D 토토 시각화가 가능하다.애니메이션 렌더링이 여기에 표시되어 배아 18.5 태아의 주요 조각을 강조 표시합니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 결과가 배아에서 관찰되는 것을 충실하게 표현해야한다는 것입니다. 연구원은 이러한 방법을 사용하여 이미지에 정적 인 것을 제시하는 것을 넘어 비디오, 3 차원 재구성 및 데이터의 대화 형 3D 모델도 포함 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

연구

발생학

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...